Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
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Diese Arbeit wurde teilweise durch das Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, die vom Bildungsministerium (2018R1A6A01011832) vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (NRF-2016M3C1A6936606) gefördert wurde. und vom Ministerium für Handel, Industrie und Energie (10068076).

Alle Versuchsprotokolle wurden vom lokalen institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss genehmigt.
1. Lösungsvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie einzelne frisch isolierte Herzmyozyten11vor. HINWEIS: Jedes Labor verfügt möglicherweise über eine andere Zellspeicherlösung. Hier werden die Myozyten im Kulturmedium (DMEM) gespeichert.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 ml Ca2+-freie Lösung vor (Tabelle 1).</li>
	<li>Bereiten Sie 50 ml Kultu...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. 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NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

Die Interferenzkorrekturmethode wurde erfolgreich zur Messung der Signale von NADH- und Fura-2-Analogen entwickelt. Eine genaue Messung der Signale ist für die exakte Korrektur unerlässlich. Die inhärente Natur der Fluoreszenzvorrichtung erzeugt jedoch ein Hintergrundsignal, das nichts mit dem von NADH von fura-2 zu tun hat. Der bandpass-Filter höchster Qualität kann nur bis zu 10x 8 der unerwünschten Wellenlängen des Lichts passieren. Das fluoreszierende Signal einer einzelnen Zelle ist jedoch sehr kle...

Die bedeutende Rolle der intrazellulären Ca2+ ist weithin bekannt1. Die Quantifizierung von [Ca2+] ist wesentlich, um die Prozesse der zellulären physiologischen Funktionen zu verstehen. Fura-2-Analoga sind sehr nützlich, da sie im UV-Bereich (<400 nm) angeregt werden und die ratiometrische Methode für die quantitative Messung angewendet werden kann. Daher können andere physiologische Parameter wie pH,H,H., Membranpotenzial usw. mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen gemessen werden. Die mitochondriale Ca2+-Konzentration ([Ca2+]m) lag den Angaben zufolge bei 0,08 x 20 ,2,3,4,5. Unter fura-2 Analoga eignet sich fura-2-FF zur Messung dieses Bereichs von [Ca2+]. Allerdings enthalten die lebenden Zellen leider NADH/NADPH für ihre Stoffwechselprozesse, und NADH erzeugt Signalstörungen aufgrund der überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren mit dem fura-2 Analog. Diese Interferenz schränkt die Verwendung von fura-2 Analogen stark ein. Insbesondere, wenn das Analoge angewendet wird, um mitochondrial [Ca2+] zu messen, ist diese Interferenz das größte Hindernis, da die höchste Menge an NADH in den Mitochondrien liegt. Erschwert wird dies noch durch NADH-Änderungen im Zusammenhang mit dem mitochondrialen Membranpotential(m) und die Veränderung vonm wirkt sich auf [Ca2+]m6,7,8 , 9. Darüber hinaus ist es für das Studium der Dynamik [Ca2+]m wichtig, den Status anderer mitochondrialer Parameter, wie NADH,mund pH, zu kennen.
Die Emissionen bei 450 nm und 500 nm mit Anregungen bei 353 nm, 361 nm und 400 nm enthalten die Signale von NADH und fura-2-FF, und die Gleichungen sind wie folgt. Hierin sind 353 nm bzw. 361 nm die isosbestischen Punkte von fura-2-FF für Emissionen bei 450 nm bzw. 500 nm.
F361.450 = F361.450,NADH + F361.450,Fura Gleichung 1 F353.500 = F353.500,NADH + F353.500,Fura Gleichung 2 F400.500 = F400.500,NADH + F400.500,Fura Gleichung 3
wobei Fx,y die gemessene Emissionsintensität bei y-nm durch x-nm Anregung, Fx,y,NADH die reine NADH-abhängige Emissionsintensität und Fx,y,Fura die reine fura-2-FF-abhängige Emissionsintensität darstellt. Bei gleicher Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs sollte eine bestimmte Anregungsintensität die gleiche Emissionsintensität erzeugen. Daher sollte das Emissionsintensitätsverhältnis von zwei verschiedenen Anregungswellenlängen konstant sein. Ca2+ und Fura-2 hatten keinen Einfluss auf die Fluoreszenzeigenschaften von NADH; Daher war das Verhältnis der Emission bei 450 nm und bei 500 nm NADH bei jeder Anregungswellenlänge konstant. Die gleiche Regel kann für fura-2-FF verwendet werden, basierend auf der Annahme, dass NADH oder [Ca2+] die Emissions- und Anregungsspektren von fura-2-FF nicht beeinflusst. Ca2+ verursachte jedoch eine spektrale Verschiebung der Fura-2-FF-Emission. Daher muss verwendet werden, um die Wirkung von Ca2+zu entfernen, isosbestische Anregung, die unabhängig von Ca2+ist. Jede Emissionswellenlänge (d.h. 450 nm und 500 nm) hat einen anderen isosbestischen Punkt, und aus unserem Versuchsaufbau wurden 353 nm bei 500 nm und 361 nm bei 450 nm gewählt. Daraus sind die folgenden Gleichungengültig 10.
Rf = F361.450,Fura/F353.500,Fura Gleichung 4 RN1 = F400.500,NADH/F361,450,NADH Gleichung 5 RN2 = F353.500,NADH/F361,450,NADH Gleichung 6
Bei diesen Konstanten sind die folgenden Gleichungen aus (Gleichung 1) (Gleichung 2) und (Gleichung 3) gültig.
F361.450 = F361.450,NADH + Rf n F353.500,Fura Gleichung 7 F353.450 = RN2 x F361.450,NADH + F353.500,Fura Gleichung 8 F400.500 = RN1 x F361.450,NADH + F400.500,Fura Gleichung 9
Aus diesen Gleichungen können, wenn Rf, RN1und RN2 bekannt sind, reine Signale von NADH und Fura-2 wie folgt erhalten werden.
F361.450,NADH = (F361.450 - Ff - F353.500)/(1 x Rf - RN2) Gleichung 10 F353.500,Fura = (RN2 x F361.450 - F353.500)/(Rf - RN2 - 1) Gleichung 11 F400.500,Fura = F400.500 - RN1 - F361.450,NADH Gleichung 12 RFura = F353.500,Fura/F400,500,Fura Gleichung 13
Die Ca2+-gebundene Form von fura-2-FF war bei der 400 nm Erregungswellenlänge praktisch nicht fluoreszierend. Basierend auf dieser Eigenschaft kann die folgende neue Kalibrierungsgleichung abgeleitet werden.
[Ca2+] = Kd (F 400.500,max/F353,500,max)
wobei Kd eine Dissoziationskonstante ist, Sind F400.500,max und F353.500,max sind die Maximalwerte der emittierten Signale bei 500 nm mit Anregungen bei 400 nm bzw. 353nm, und R min ist die minimale RFura in Ca2 +-freier Zustand. Da die isosbestischen Anregungen verwendet wurden, kann die Gleichung wie folgt weiter vereinfacht werden.
[Ca2+] = Kd (1 / Rmin) ( RFura - Rmin) Gleichung 15
Daher sind nur Kd- undR-min-Werte erforderlich, um [Ca2+] zu berechnen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

Zur quantitativ [Ca2+] werden häufig Fura-2-Analoga verwendet, die ratiometrische Fluorosonden sind. Allerdings ist die Verwendung von Farbstoffen in lebenden Zellen aufgrund von Autofluoreszenzstörungen, hauptsächlich durch Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH), an sich beschränkt. Genauer gesagt ist dies ein großes Hindernis bei der Messung der mitochondrialen [Ca2+] quantitativ mit Fura-2 Analoga, da die Mehrheit der NADH in den Mitochondrien ist. Wenn die Fluoreszenzfarbstoffkonzentration gleich ist, sollte eine bestimmte Anregungsintensität die gleiche Emissionsintensität erzeugen. Daher sollte das Emissionsintensitätsverhältnis von zwei verschiedenen Anregungswellenlängen konstant sein. Basierend auf diesem Prinzip wurde eine neuartige Online-Korrekturmethode der NADH-Signalinterferenz zur Messung [Ca2+] entwickelt, und die tatsächliche Signalintensität von NADH und Fura-2 kann erreicht werden. Darüber hinaus wurde eine neuartige Gleichung zur Berechnung [Ca2+] mit isosbestischer Anregung oder Anregung bei 400 nm entwickelt. Mit dieser Methode konnten Veränderungen in mitochondrialen [Ca2+] erfolgreich gemessen werden. Darüber hinaus konnten bei einem anderen Satz der Anregungs- und Emissionswellenlängen mehrere Parameter, einschließlich NADH, [Ca2+], und pH- oder mitochondriales Membranpotential(m) gleichzeitig gemessen werden. Mitochondrial [Ca2+] undm oder pH wurden mit Fura-2-FF und Tetramethylrhodinethylester (TMRE) oder Carboxy-Seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1) gemessen.

Mitochondriale Ca2+ Änderungen aufgrund von Korrektur10 Abbildung 4 zeigt die Änderungen in [Ca2+]m vor und nach der Korrektur. Die Ergebnisse zeigten deutlich die wesentlichen Veränderungen in [Ca2+]m. Die mitochondriale ruhende Calciumkonzentration ohne zytosolische Ca2+ ([Ca2+]c) betrug 1,03 x 0,13 m (Mittelwert s.E., n = 32), und die maximale [Ca2+]m bei 1-M [Ca<...

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A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Aufgrund der spektralen Überlappung der Anregungs- und Emissionswellenlängen von NADH- und Fura-2-Analogen ist die Signalinterferenz beider Chemikalien in lebenden Zellen bei der quantitativen Messung von [Ca2+ ]unvermeidbar. So wurde eine neuartige Online-Korrekturmethode der NADH-Signalinterferenz zur Messung [Ca2+] entwickelt.

Eine neuartige Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Korrekturmethode zur intrazellulären Ca2+-Messung mit Fura-2-Analog in lebenden Zellen

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

UV-erregbare Pluralsonden haben aufgrund der Auto-Plural-Sounds eine inhärente Signalkontamination. Das meiste Problem mit NADH, ist die Begrenzung der Verwendung einer Pluralsonde. Es kann eine Methode verwendet werden, um die äußere Blütenstand von NADH genau zu korrigieren, um ein echtes, nicht kontaminiertes Plural-Sondensignal zu extrahieren.Demonstriert wird das Verfahren von Jeong Hoon Lee, unserem wissenschaftlichen Assistenzprofessor aus meinem Labor. Nachdem Sie die Myozyten an der Unterseite der Röhre absetzen lassen, aspirieren Sie den Überstand. Beschriften Sie die Zellen mit zwei Millilitern frisch zubereiteter Millimolar-Fura-2-FFAM-Verdünnungslösung für 60 Minuten bei vier Grad Celsius.Am Ende der Inkubation, legen Sie die Röhre in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 30 Minuten in der aufrechten Position, bevor Sie den Überstand entfernen. Dann fügen Sie vier Milliliter Raumtemperatur Kulturmedium für die Lagerung bei Raumtemperatur. Denn in situ isobestic fura-2-ffa Punkt-Identifikation montieren die verdünnten Zellen auf die Mikroskop-Bühne und warten drei Minuten, bis die Zellen auf den Boden sinken.NADH-freie 37 Grad Celsius kalziumfreie Lösung in die Zellkultur einfließen lassen und eine Zielzelle lokalisieren. Eine profuse Saponin-Lösung für 60 Sekunden vor dem Wiederauflösen mit der NADH-freien calciumfreien Lösung. Messen Sie gleichzeitig die fura-2-ff emittierten Signale bei 450 und 500 Nanometern, wobei ein Anregungsscan von 350 bis 365 Nanometern mit einem 0,1 Nanometer-Schritt verwendet und mit NADH-freier Calcium-freier Lösung wieder aufgefroren wird.Als nächstes subtrahieren Sie die Signale in der kalziumgesättigten Lösung von den Signalen in den kalziumfreien Bedingungen. Berechnen Sie dann die Standardabweichungen der Emission bei jeder Anregung und wählen Sie die Anregungswellenlänge aus, die die minimalen Standardabweichungswerte als einzelne isobestische Punkte anzeigt. Um ein multiparametrisches Messsystem zu verwenden, um das Hintergrundsignal zu erkennen und das Signal im Zellbereich zu korrigieren, montieren Sie farbfreie Zellen im Mikroskopbad und lassen Sie die Zellen sich für drei Minuten absetzen.NADH-Calciumfreie Lösung für etwa fünf Minuten bei einer Rate von zwei bis drei Millilitern pro Minute ins Bad bringen und das Objektfeld so einstellen, dass es die Zielzelle abdeckt. Nach dem Verschieben der Zelle aus dem Feld messen Sie die Hintergrundsignale des zellfreien Fensters und stellen Sie die Signale als Offsets ein. Kehren Sie dann die Zelle an die Ausgangsposition zurück und messen Sie die Zellhintergrundsignale und den Zellbereich.Um den R-Faktor zu berechnen, verwenden Sie den erfassten Zellhintergrund und die Flächensignale, bevor Sie die farbfreien Zellen wieder auf das Mikroskop montieren und mit kalziumfreier Lösung beschneiden. Messen Sie die Signale wie angegeben, bevor Sie die Zellsuspension mit Malatlösung entweiht. Nach der Messung der Signale überaus die Zellen mit Pyruvat-Lösung gefolgt von Überfluss mit Malat-Pyruvat-Lösung und Roton-Lösung.Berechnen Sie dann die Steigung für jedes Signal. Hier werden die Veränderungen des mitochondrialen Kalziums vor und nach der Korrektur angezeigt. Die Ergebnisse zeigen deutlich wesentliche Veränderungen des mitochondrialen Kalziums mit einer mitochondrialen ruhenden Calciumkonzentration ohne zytosolisches Calcium von 1,03 plus oder minus 0,13 Mikromolar und maximales mitochondriales Kalzium bei einem Mikromolaren Calcium von 29,6 plus oder minus 1,61 Mikromolar.Das mitochondriale Transmembranpotential wurde mit einer Fülle von zwei Nanomolaren TMRE überwacht. Die Veränderung des mitochondrialen Potentials wurde auf der Grundlage eines angenommenen anfänglichen mitochondrialen Membranpotentials von minus 150 Millivolt berechnet, was eine Abnahme der NADH als Reaktion auf Kalziumzugabe zeigt, mit einer negierbaren Wirkung auf das mitochondriale Membranpotenzial. Der mitochondirale pH-Wert wurde nicht durch die Erhöhung des durch carboxy SNARF-1-Belastung induzierten mitochondrialen Kalziums bewirkt.Falsche isobestische Punkte führen zu einer falschen R- und NADH-Korrektur. Achten Sie also darauf, den zellfreien Hintergrund und den Zellbereich immer richtig zu messen. Diese Technik wird verwendet, um mitochondriale Kalzium-Dynamische Studien in den bioanalytischen Verschüttungen vorzubereiten.

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Forschung

Biologie

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Mess-intrazellulären Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Änderungen in menschlichen Spermien mit vier Techniken: Konventionelle Fluorometrie, Stopped Flußfluorometrie, Durchflusszytometrie und Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Der Nachweis von intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen der Maus, Mensch und Schwein Origin Mit Fluoreszenz-markierter Nanopartikel

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...