Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי תוכנית בסיסית מחקר המדע באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2018R1A6A3A01011832), על ידי משרד המדע, מ& תכנון עתידי (NRF-2016M3C1A6936606) ועל ידי משרד המסחר, התעשייה & אנרגיה (10068076).

כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי שימוש בבעלי חיים מוסדיים מקומיים וועדת השימוש.
1. הכנת התמיסה
<ol><li>הכינו מיציטים חד-לבבית. הערה: כל מעבדה עשויה להיות בעלת פתרון אחסון תאים שונה. כאן, המיציטים מאוחסנים במדיום התרבותי (DMEM).</li>
	<li>הכן 100 mL של Ca2 +-פתרון ח...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2++under+various+conditions.">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li><li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium.">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li><li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues.">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li><li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals.">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

שיטת תיקון ההפרעות פותחה בהצלחה עבור מדידת האותות של NADH ו fura-2 אנלוגיות. מדידה מדויקת של האותות חיונית לתיקון מדויק. עם זאת, האופי הטבוע של מכשיר הפלורסנט מייצר אות רקע שאינו קשור לזה של NADH של fura-2. הפילטר האיכותי ביותר יכול להעביר עד 10 עד8 מאורכי הגל הלא רצויים של האור. עם זאת, אות הפלורס...

התפקיד המשמעותי של הרשות התאיים2 + מוכר באופן נרחב1. הקוונפיקציה של [Ca2 +] חיוני כדי להבין את התהליכים של פונקציות פיזיולוגיות הסלולר. האנלוגית fura-2 הם שימושיים למדי משום שהם נרגשים בטווח UV (< 400 ננומטר), ואת השיטה הטימטרית ניתן להחיל על המדידה הכמותית. לכן, פרמטרים פיזיולוגיים אחרים כגון pH, פוטנציאל הממברנה, וכו ', ניתן למדוד עם צבעי פלורסנט אחרים. Ca מיטוכונדריאלי2 + ריכוז ([Ca2 +]m) היה הדיווחים 0.08-20 μm2,3,4,5. בין fura-2 אנלוגיות, fura-2-FF מתאים למדידת טווח זה של [Ca2 +]. עם זאת, התאים החיים למרבה הצער מכילים NADH/NADH עבור תהליכי חילוף החומרים שלהם, ו-NADH יוצר הפרעות האות בגלל העירור החופף וספקטרום הפליטה עם האנלוגי fura-2. הפרעה זו מגבילה מאוד את השימוש באנלוגיות של fura-2. במיוחד, אם האנלוגי מוחל על מדידת מיטוכונדריאלי [Ca2 +], הפרעה זו היא המכשול הגדול ביותר, כי הסכום הגבוה ביותר של nadh הוא במיטו,. זה מסובך עוד יותר על ידי שינויים nadh להיות קשור הפוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ענבלm) ושינוי של ענבלm משפיע [Ca2 +]m6,7,8 , 9. יתר על כן, עבור לימוד [Ca2 +]m דינמיקה, חיוני לדעת את מעמדם של פרמטרים מיטוכונדריאלי אחרים, כגון nadh, ענבלm, ו-pH.
פליטות ב 450 ננומטר ו 500 nm עם ההתרגשות ב 353 nm, 361 nm, ו-400 nm מכילים את האותות מ-NADH ו-fura-2-FF, והמשוואות הן כדלקמן. בזאת, 353 nm ו 361 nm הם נקודות isosbestic של fura-2-FF עבור פליטות ב 450 nm ו ב 500 nm, בהתאמה.
F361,450 = f361450, nadh + F361450, משוואת פרא 1 F353,500 = f353500, nadh + F353500, משוואת פרא 2 F400,500 = f400500, nadh + F400500, משוואת פרא 3
כאשר Fx, y היא עוצמת הפליטה הנמדדת ב-y-nm על-ידי עירור ה-x-Nm, fx, y, nadh מייצגת את עוצמת הפליטה הטהורה התלוית התלות, ו-fx, y, fura מייצגת את עוצמת הפליטה הטהורה של fura-2-FF. תחת הריכוז זהה של צבע פלורסנט, אינטנסיביות עירור מסוים צריך לייצר את עוצמת פליטה זהה. לכן, יחס עוצמת הפליטה של שני אורכי גל עירור שונים צריך להיות קבוע. Ca2 + ו fura-2 לא השפיעו על מאפייני הזריחה של nadh; לכן, את היחס של הפליטה ב 450 ננומטר ו ב 500 ננומטר של NADH היה קבוע באורך גל כל עירור. אותו כלל ניתן להשתמש עבור fura-2-FF מבוסס על ההנחה כי NADH או [Ca2 +] אינו משפיע על הפליטה ואת מהווה ספקטרום של fura-2-ff. עם זאת, Ca2 + גרם שינוי ספקטרלי של הפליטה fura-2-FF. לכן, כדי להסיר את ההשפעה של Ca2 +, הריגוש isosbestic אשר אינו תלוי ca2 +, צריך להיות בשימוש. כל אורך הגל (כלומר, 450 nm ו 500 ננומטר) יש נקודה isosbestic ומתוך ההתקנה הניסיונית שלנו, 353 nm ב 500 nm ו-361 nm ב 450 nm נבחרו. מאלה, המשוואות הבאות תקפים10.
Rf = f361450, fura/F353500, משוואת fura 4 RN1 = F400500, nadh/F361450, משוואת נדיה 5 RN2 = F353500, nadh/F361450, משוואת נדיה 6
עם קבועים אלה, המשוואות הבאות מ (משוואה 1) (משוואה 2) ו (משוואה 3) הן חוקיות.
F361,450 = f361450, nadh + RF × f353500, משוואת fura 7 F353,450 = RN2 × f361450, nadh + f353500, משוואת fura 8 F400,500 = RN1 × f361450, nadh + f400500, משוואת fura 9
ממשוואות אלה, אם Rf, rN1ו-rN2 ידועים, אותות טהורים של nadh ו fura-2 ניתן להשיג כדלקמן.
F361450, NADH = (F361,450 -Rf × f353,500)/(1-rf × rN2) משוואה 10 F353500, Fura = (rN2 × f361,450 -f353,500)/(rF × rN2 -1) משוואה 11 F400500, Fura = F400,500 -RN1 × f361450, משוואת נדיה 12 Rfura = F353500, fura/F400500, משוואת fura 13
Ca2 +הטופס מאוגד של fura-2-FF היה כמעט לא פלורסנט ב 400 הריגוש ננומטר גל. בהתבסס על מאפיין זה, ניתן לגזור את משוואת הכיול החדשה הבאה.
[Ca2 +] = Kd ∙ (F400500, max/f353500, מקסימום) × (Rfura -rדקות) משוואה 14
כאשר Kd הוא קבוע הדיסוציאציה,f 400500, Max ו-f 353500, max הם הערכים המרביים של האותות הנפלטים ב 500 ננומטר עם ההתרגשות ב 400 nm ו 353 Nm, בהתאמה, ו rדקות הוא מינימום rfura ב Ca2 +-תנאי פנוי. מאחר שנעשה שימוש בהתרגשות, המשוואה יכולה להיות פשוטה יותר כדלקמן.
[Ca2 +] = Kd ∙ (1/Rדקות) ∙ (Rfura -rדקות) משוואה 15
לכן, רק ערכי K ו- Rמינימום נדרשים לחישוב [Ca2 +].

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

כדי למדוד [Ca 2 +] כמותית, fura-2 אנלוגיים, אשר משמשים לעתים קרובות משתמשיםבשתישדות פלואורומטרים. עם זאת, השימוש בצבע הוא מוגבל בתאים חיים בגלל הפרעה פלואורסצנטית אוטומטי, בעיקר מפני הפרעות מסוימות (NADH). באופן ספציפי יותר, זהו מכשול גדול כאשר מדידת מיטוכונדריאלי [Ca2 +] ככמת באמצעות fura-2 האנלוגיים כי רוב הרוב של nadh הוא המיטו,. אם הריכוז צבע פלורסנט זהה, עוצמת עירור מסוים צריך לייצר את עוצמת הפליטה זהה. לכן, יחס עוצמת הפליטה של שני אורכי גל עירור שונים צריך להיות קבוע. מבוסס על עיקרון זה, שיטת תיקון מקוון הרומן של הפרעה האות NADH הפרעות למדוד [Ca2 +] פותחה, ואת עוצמת האות האמיתית של nadh ו fura-2 ניתן להשיג. עוד, משוואה הרומן לחשב [Ca2 +] פותחה עם עירור isosbestic או עירור ב 400 nm. עם שיטה זו, שינויים מיטוכונדריאלי [Ca2 +] יכול להיות נמדד בהצלחה. בנוסף, עם קבוצה שונה של העירור ואת אורכי הגל, פרמטרים מרובים, כולל NADH, [Ca2 +], ו-pH או הממברנה מיטוכונדריאלי פוטנציאל (ענבלm), ניתן למדוד בו. מיטוכונדריאלי [Ca2 +] ו ענבלm או pH נמדדו באמצעות fura-2-FF ו טטרמתירומתיל אתיל אסתר (tmre) או קרבוקטרוקסי-סמיטואפאפופלויור-1 (קרבוXY-סנאפ -1).

Ca מיטוכונדריאלי2 + שינויים עקב תיקון10 איור 4 מציג את השינויים ב [Ca2 +]m לפני ואחרי התיקון. התוצאות הראו בבירור את השינויים הניכרים ב [Ca2 +]m. מיטוכונדריאלי מונח ריכוז סידן ללא cytosolic Ca2 + ([Ca2 +]c) היה 1.03 ± 0.13 μm (ממוצע ± S.E., n = 32), ואת ...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

בשל החפיפה הספקטרלית של עירור ואורכי גל הפליטה של NADH וfura-2 אנלוגיות, הפרעות האות משני הכימיקלים בתאים חיים הוא בלתי נמנע במהלך המדידה הכמותית של [Ca2 +]. לפיכך, שיטת התיקון המקוונת הרומן של הפרעה באות NADH למדידה [Ca2 +] פותחה.

הרומן ניקולט שיטת תיקון Dinucleotide עבור Ca תאיים2 + מדידה עם fura-2-אנלוגי בתאים חיים

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

UV נרגש בדיקות ברבים, יש זיהום אות אינהרנטי, בגלל צלילי ברבים אוטומטיים. רוב הבעיה עם NADH, היא הגבלת השימוש בבדיקה ברבים. ניתן להשתמש בשיטה, כדי לתקן במדויק את הצמחייה החיצונית מ NADH, על מנת לחלץ אות בדיקה ברבים אמיתי, לא מזהם.הדגמת ההליך תהיה ג'ונג הון לי, עוזר המחקר שלנו פרופסור מהמעבדה שלי. לאחר מתן אפשרות למיוציטים להתיישב בתחתית הצינור, שאף את העל-טבעי. סמן את התאים עם שני מיליליטר של פתרון דילול מילימולרי אחד מילימולרי של fura-2-FFAM למשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, מניחים את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות במצב זקוף לפני הסרת העל-טבעי. לאחר מכן הוסיפו ארבעה מיליליטר של מדיום תרבות טמפרטורת החדר לאחסון בטמפרטורת החדר. עבור situ isobestic fura-2-FFA נקודת זיהוי להרים את התאים מדולל על שלב מיקרוסקופ ולחכות שלוש דקות לתאים לשקוע לתחתית.שפע ללא NADH 37 מעלות צלזיוס ללא סידן פתרון לתוך תא התרבות ולאתר תא היעד. יש לפרופות בתתברית סאפונין למשך 60 שניות לפני שתתמזגו מחדש עם הפתרון נטול הסידן נטול NADH. בו זמנית למדוד את אותות פרווה-2-ff הנפלטים ב 450 ו 500 ננומטר, באמצעות סריקת העירור מ 350 כדי 365 ננומטר עם צעד 0.1 ננומטר מחדש בשפע עם פתרון ללא סידן NADH.לאחר מכן להחסיר את האותות בתסכול רווי סידן מן האותות בתנאים ללא סידן. לאחר מכן חישבו את סטיות התקן של הפליטה בכל קריאה ובחרו את אורך הגל של העירור המציג את ערכי סטיית התקן המינימליים כנקודות איובסטיות בודדות. כדי להשתמש במערכת מדידה רב-פרמטרית כדי לזהות את אות הרקע ולתקן את האות בתוך אזור התא, הר תאים נטולי צבע באמבט המיקרוסקופ ואפשר לתאים להתיישב במשך שלוש דקות.שפע NADH ללא סידן פתרון לתוך האמבטיה במשך כחמש דקות בקצב של שניים עד שלושה מיליליטר לדקה ולהגדיר את שדה האובייקט כדי לכסות את התא ממוקד. לאחר הזזת התא אל מחוץ לשדה, מודדים את אותות הרקע של החלון נטול התאים ומגדירים את האותות כהיסט. לאחר מכן החזירו את התא למיקום הראשוני ולמדוד את אותות הרקע של התא ואת אזור התא.כדי לחשב את R-פקטור להשתמש באותות רקע התאים באזור שנרכשו לפני טעינה מחדש של התאים ללא צבע על המיקרוסקופ והשפע עם פתרון ללא סידן. למדוד את האותות כפי שצוין לפני שפע ההשעיה התא עם פתרון מאלט. לאחר מדידת האותות שפע התאים עם פתרון פירובט ואחריו שפע עם פתרון מלאט-פירובט ופתרון רוטנון.לאחר מכן חשב את השיפוע עבור כל אות. כאן השינויים בסידן המיטוכונדריאלי לפני ואחרי התיקון מוצגים. התוצאות חושפות בבירור שינויים משמעותיים בסידן המיטוכונדריאלי עם ריכוז סידן מיטוכונדריאלי במנוחה ללא סידן ציטוסולי של 1.03 פלוס או מינוס 0.13 מיקרומולרי וסידן מיטוכונדריאלי מרבי במיקרומולר אחד של סידן של 29.6 פלוס או מינוס 1.61 מיקרומולאר.הפוטנציאל הטרנסמברני המיטוכונדריאלי היה במעקב עם שפע של שני ננומולרים TMRE. השינוי בפוטנציאל המיטוכונדריאלי חושב בהתבסס על פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי מנומק של מינוס 150 מיליבולטים, המדגים ירידה NADH בתגובה לתוספת סידן, עם השפעה זניחה על פוטנציאל קרום המיטוכונדריה. ה- pH המיטוכונדריאלי לא הושפע מהעלייה בסידן המיטוכונדריאלי המושרה על ידי טעינת SNARF-1 של carboxy.נקודות איובסטיות שגויות גורמות לתיקון שגוי של R ו- NADH. אז יש לדאוג תמיד כראוי למדוד את הרקע ללא תאים ואת אזור התא. טכניקה זו משמשת להכנת מחקרים דינמיים של סידן מיטוכונדריאלי בדליפות הביואנליטיות.

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

מדידת תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; שינויים בזרע אנושי באמצעות ארבע טכניקות: fluorometry הקונבנציונלי, הפסיק fluorometry זרימה, cytometry זרימה והדמיה תא יחיד

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

זיהוי של ביטוי גנים בתאים תאיים חיים של Murine, אדם וחזירי מקור באמצעות חלקיקים שכותרתו פלואורסצנטי

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...