Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
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विज्ञान, आईसीटी और भविष्य की योजना (NRF-2016M3C1A69606) के विज्ञान मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) के माध्यम से इस काम को आंशिक रूप से बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था और व्यापार, उद्योग और ऊर्जा मंत्रालय (10068076) द्वारा.

सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल स्थानीय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. समाधान तैयारी
<ol><li>एक ताजा अलग कार्डियक मायोसाइट्स11तैयार करें. नोट: प्रत्येक प्रय...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2++under+various+conditions.">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li><li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium.">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li><li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues.">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li><li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals.">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

हस्तक्षेप सुधार विधि सफलतापूर्वक NADH और fura-2 एनालॉग के संकेतों को मापने के लिए विकसित किया गया था। सटीक सुधार के लिए संकेतों का सटीक माप आवश्यक है। हालांकि, फ्लोरोसेंट डिवाइस की अंतर्निहित प्रकृति एक पृष...

इंट्रासेल्यूलर कै2+ की महत्वपूर्ण भूमिका व्यापक रूप से जानी जाती है1. कोशिकीय शारीरिक प्रकार्यों की प्रक्रियाओं को समझने के लिए [Ca2+] का परिमाणीकरण आवश्यक है। Fura-2 एनालॉग काफी उपयोगी हैं क्योंकि वे यूवी रेंज में उत्साहित हैं (lt;400 एनएम), और अनुपातमेट्रिक विधि मात्रात्मक माप के लिए लागू किया जा सकता है. इसलिए, इस तरह के पीएच के रूप में अन्य शारीरिक मापदंडों, झिल्ली क्षमता, आदि, अन्य फ्लोरोसेंट रंगों के साथ मापा जा सकता है. माइटोकोंड्रियाल कै2+ सांद्रता ([Ca2+]उ) श्रेणी कथित तौर पर 0.08$20 $M2,3,4,5. Fura-2 एनालॉग के अलावा, fura-2-FF [Ca2 +] की इस सीमा को मापने के लिए उपयुक्त है। हालांकि, जीवित कोशिकाओं दुर्भाग्य से उनके चयापचय प्रक्रियाओं के लिए NADH/NADPH होते हैं, और NADH fura-2 एनालॉग के साथ ओवरलैपिंग उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम की वजह से संकेत हस्तक्षेप उत्पन्न करता है। यह हस्तक्षेप बहुत fura-2 एनालॉग के उपयोग को सीमित करता है। विशेष रूप से, यदि एनालॉग mitochondrial को मापने के लिए लागू किया जाता है [Ca2 +], इस हस्तक्षेप सबसे बड़ी बाधा है क्योंकि NADH की सबसे अधिक राशि mitochondria में है. यह नाडाड परिवर्तनों से और जटिल है जो माइटोकोंड्रियाल झिल्ली की क्षमता(ज )से संबंधित है और$m का परिवर्तन [Ca2+]m6,7,8 , 9.इसके अतिरिक्त, [Ca2+]m गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, अन्य माइटोकोंड्रियाल पैरामीटरों की स्थिति जानना आवश्यक है, जैसे नाड, $एम, और पीएच।
353 एनएम, 361 एनएम, और 400 एनएम पर उत्तेजना के साथ 450 एनएम और 500 एनएम पर उत्सर्जन में नाडाह और फ्यूरा-2-एफएफ के संकेत होते हैं, और समीकरण इस प्रकार हैं। इसमें, 353 एनएम और 361 एनएम क्रमशः 450 एनएम और 500 एनएम पर उत्सर्जन के लिए फ्यूरा-2-एफएफ के आइसोबेस्टिक अंक हैं।
F361,450 ] F361,450,NADH + F361,450,Fura समीकरण 1 F353,500 ] F353,500,NADH + F353,500,Fura समीकरण 2 F400,500 ] F400,500,NADH + F400,500,Fura समीकरण 3
जहां एफएक्स, y द्वारा y-nm पर मापा उत्सर्जन तीव्रता है x-nm उत्तेजना, एफएक्स, y, NADH शुद्ध NADH-निर्भर उत्सर्जन तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, और एफएक्स,y,Fura शुद्ध fura-2-FF-निर्भर उत्सर्जन तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। फ्लोरोसेंट डाई की एक ही एकाग्रता के तहत, एक निश्चित उत्तेजना तीव्रता एक ही उत्सर्जन तीव्रता का उत्पादन करना चाहिए. अतः दो विभिन्न उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का उत्सर्जन तीव्रता अनुपात स्थिर होना चाहिए। Ca2+ और fura-2 NADH फ्लोरोसेंट विशेषताओं को प्रभावित नहीं किया; अतः 450 दउ पर उत्सर्जन का अनुपात तथा 500 दउ नाडड किसी भी उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर स्थिर था। एक ही नियम fura-2-FF के लिए इस धारणा के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है कि NADH या [Ca2 +] fura-2-FF के उत्सर्जन और उत्तेजना स्पेक्ट्रम को प्रभावित नहीं करता है. हालांकि, Ca2 + fura-2-FF उत्सर्जन की एक वर्णक्रमीय बदलाव का कारण बना. इसलिए, Ca2 +के प्रभाव को दूर करने के लिए, isosbestic उत्तेजना, जो Ca2 +से स्वतंत्र है, का उपयोग करने की जरूरत है. प्रत्येक उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (यानी, 450 एनएम और 500 एनएम) एक अलग isosbestic बिंदु है, और हमारे प्रयोगात्मक सेटअप से, 353 एनएम पर 500 एनएम और 361 एनएम पर 450 एनएम चुना गया. इन से, निम्नलिखित समीकरण मान्य हैं10.
आरएफ ] एफ361,450,Fura/F353,500,Fura समीकरण 4 आरएन 1 ] एफ400,500,NADH/F361,450,NADH समीकरण 5 आरएन 2 ] एफ353,500,NADH/F361,450,NADH समीकरण 6
इन स्थिरांकों के साथ, (समीकरण 1) (समीकरण 2) से निम्न समीकरण और (समीकरण 3) मान्य हैं।
F361,450 ] F361,450,NADH + Rf ] F353,500,Fura समीकरण 7 F353,450 ] RN2 ] F361,450,NADH + F353,500,Fura समीकरण 8 F400,500 ] RN1 ] F361,450,NADH + F400,500,Fura समीकरण 9
यदि तच,त्द1तथा त्द2 ज्ञात हों तो नाध तथा फरा-2 के शुद्ध संकेत निम्नानुसार प्राप्त किए जा सकते हैं।
F361,450,NADH ] (F361,450 - Rf ] F353,500)/ F353,500,Fura ] (RN2 ] F361,450 ] F353,500)/ F400,500,Fura ] F400,500 ] RN1 ] F361,450,NADH समीकरण 12 आरFura ] F353,500,Fura/ एफ400,500, Fura समीकरण 13
फरा-2-एफएफ का Ca2+-बाउंड रूप 400 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर व्यावहारिक रूप से गैर-फ्लोरोसेंट था। इस गुण के आधार पर, निम्न नए अंशांकन समीकरण प्राप्त किया जा सकता है।
[Ca2+] Kd ] (F400,500,max/ F353,500,max) ] (RFura ] Rmin) समीकरण 14
जहां Kd एक वियोजन स्थिरांक है, F400,500, अधिकतम और F353,500, अधिकतम 400 एनएम और 353 एनएम पर उत्तेजना के साथ 500 एनएम पर उत्सर्जित संकेतों की अधिकतम मान रहे हैं, क्रमशः, और आरमिनट Ca 2 में न्यूनतम आरFura है +-मुक्त हालत। चूंकि isosbestic उत्तेजना का उपयोग किया गया था, समीकरण निम्नानुसार आगे सरल किया जा सकता है.
[Ca2+] Kd ] (1 / Rmin) ] (RFura ] Rmin) समीकरण 15
इसलिए, केवल Kd और Rमिनट मान [Ca2 +] की गणना करने के लिए आवश्यक हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

मापने के लिए [Ca2 +] मात्रात्मक, fura-2 एनालॉग, जो अनुपातमेट्रिक फ्लोरोप्रोब हैं, अक्सर उपयोग किया जाता है। हालांकि, डाई उपयोग आंतरिक रूप से autofluorscence हस्तक्षेप की वजह से जीना कोशिकाओं में सीमित है, मुख्य रूप से nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) से. अधिक विशेष रूप से, यह एक प्रमुख बाधा है जब mitochondrial को मापने [Ca2 +] मात्रात्मक रूप से fura-2 एनालॉग का उपयोग कर, क्योंकि NADH के बहुमत mitochondria में है. यदि फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता एक ही है, एक निश्चित उत्तेजना तीव्रता एक ही उत्सर्जन तीव्रता का उत्पादन करना चाहिए. अतः दो विभिन्न उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का उत्सर्जन तीव्रता अनुपात स्थिर होना चाहिए। इस सिद्धांत के आधार पर, NADH संकेत हस्तक्षेप के एक उपन्यास ऑनलाइन सुधार विधि को मापने के लिए [Ca2 +] विकसित किया गया था, और NADH और fura-2 के वास्तविक संकेत तीव्रता प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, गणना करने के लिए एक उपन्यास समीकरण [Ca2 +] isosbestic उत्तेजना या 400 एनएम पर उत्तेजना के साथ विकसित किया गया था. इस विधि के साथ, माइटोकोंड्रियाल [सीए2+] में परिवर्तन सफलतापूर्वक मापा जा सकता है। इसके अलावा, उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के एक अलग सेट के साथ, कई पैरामीटर, NADH सहित, [Ca2 +], और पीएच या mitochondrial झिल्ली क्षमता (जेडएम),एक साथ मापा जा सकता है. माइटोकोंड्रियाल [सीए2+] और जेडएम या पीएच को फ्यूरा-2-एफएफ और टेट्रामेथिलहोडामाइन एथिल एथिल एस्टर (टीएमआरई) या कार्बोक्सी-सेमीनाफ्होरफ्लोर-1 (कार्बोक्सी-स्नेफ-1) का उपयोग करके मापा गया था।

Mitochondrial Ca2 + सुधार के कारण परिवर्तन10 चित्र 4 में सुधार से पहले और बाद में [Ca2+]उ में परिवर्तन दिखाई देते हैं। परिणामों में स्पष्ट रूप से [Ca2+] m में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाईदिए?...

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A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

NADH और fura-2 एनालॉग की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के वर्णक्रमीय ओवरलैपिंग के कारण, लाइव कोशिकाओं में दोनों रसायनों से संकेत हस्तक्षेप [Ca2 +] की मात्रात्मक माप के दौरान अपरिहार्य है। इस प्रकार, NADH संकेत हस्तक्षेप के एक उपन्यास ऑनलाइन सुधार विधि को मापने के लिए [Ca2 +] विकसित किया गया था.

एक उपन्यास Nicotinamide Adenine Dinucleotide सुधार विधि के लिए Intracellular Ca2 + माप के साथ Fura-2-एनालॉग लाइव सेल में

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

यूवी उत्तेजनीय बहुवचन जांच, ऑटो-बहुवचन ध्वनियों के कारण एक अंतर्निहित संकेत संदूषण है। NADH के साथ समस्या के अधिकांश, एक बहुवचन जांच के उपयोग को सीमित कर रहा है । एक विधि का उपयोग किया जा सकता है, जो एक सच्चे, अदूषित बहुवचन जांच संकेत निकालने के लिए, NADH से बाहरी फ्लोरेसेंस को ठीक से सही करने के लिए किया जा सकता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन Jeong Hoon ली, मेरी प्रयोगशाला से हमारे अनुसंधान सहायक प्रोफेसर होगा । मायोसाइट्स को ट्यूब के नीचे बसाने की अनुमति देने के बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें। चार डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए हौसले से तैयार एक मिलीमोलर फ्यूरा-2-FFAM कमजोर समाधान के दो मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं लेबल ।इनक्यूबेशन के अंत में, ट्यूब को सुपरनिटेंट हटाने से पहले ईमानदार स्थिति में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखें। फिर कमरे के तापमान पर भंडारण के लिए कमरे के तापमान संस्कृति माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें। के लिए सीटू isobestic fura-2-ffa बिंदु पहचान माइक्रोस्कोप चरण पर पतला कोशिकाओं माउंट और कोशिकाओं के लिए तीन मिनट इंतजार नीचे करने के लिए सिंक करने के लिए ।सेल संस्कृति में NADH मुक्त 37 डिग्री सेल्सियस कैल्शियम मुक्त समाधान का उपयोग करें और एक लक्ष्य कोशिका का पता लगाएं। NADH मुक्त कैल्शियम मुक्त समाधान के साथ फिर से प्रोफस करने से पहले 60 सेकंड के लिए सैपोनिन समाधान का उपयोग करें। इसके साथ ही 450 और 500 नैनोमीटर पर फ्यूरा-2-एफएएफ उत्सर्जित संकेतों को मापें, 0.1 नैनोमीटर चरण के साथ 350 से 365 नैनोमीटर तक एक्सटिशन स्कैन का उपयोग करके और NADH-मुक्त कैल्शियम-मुक्त समाधान के साथ फिर से दरियादिली।इसके बाद कैल्शियम मुक्त स्थितियों में संकेतों से कैल्शियम संतृप्त समाधान में संकेतों को घटाएं। फिर प्रत्येक उत्तेजन पर उत्सर्जन के मानक विचलन की गणना करें और व्यक्तिगत आइसोबस्टिक अंक के रूप में न्यूनतम मानक विचलन मूल्यों को दिखाने वाले उत्तेजन तरंगदैर्ध्य का चयन करें। पृष्ठभूमि संकेत का पता लगाने और कोशिका क्षेत्र के भीतर संकेत को सही करने के लिए एक बहु-पैरामेट्रिक माप प्रणाली का उपयोग करने के लिए, माइक्रोस्कोप स्नान में डाई-मुक्त कोशिकाओं को माउंट करें और कोशिकाओं को तीन मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।दो से तीन मिलीलीटर प्रति मिनट की दर से स्नान में NADH कैल्शियम मुक्त समाधान का उपयोग करें और लक्षित कोशिका को कवर करने के लिए ऑब्जेक्ट फील्ड सेट करें। सेल को क्षेत्र से बाहर ले जाने के बाद सेल-मुक्त खिड़की के पृष्ठभूमि संकेतों को मापते हैं और संकेतों को ऑफसेट के रूप में सेट करते हैं। फिर सेल को शुरुआती स्थिति में वापस करें और सेल बैकग्राउंड सिग्नल और सेल एरिया को मापें।आर-फैक्टर की गणना करने के लिए माइक्रोस्कोप पर डाई-मुक्त कोशिकाओं को फिर से बढ़ाने और कैल्शियम मुक्त समाधान के साथ प्रोयूजिंग से पहले अधिग्रहीत सेल पृष्ठभूमि और क्षेत्र संकेतों का उपयोग करें। मैलेट समाधान के साथ सेल निलंबन की प्रोफाइलिंग से पहले संकेतों को मापें। संकेतों को मापने के बाद पाइरुवेट समाधान के साथ कोशिकाओं को विपुल करें और इसके बाद मालते-पाइरुवेट समाधान और रोटेनोन समाधान के साथ प्रचुरता के बाद।फिर प्रत्येक सिग्नल के लिए ढलान की गणना करें। यहां सुधार से पहले और बाद में माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम में बदलाव दिखाए जाते हैं। परिणाम स्पष्ट रूप से माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम में 1.03 प्लस या माइनस 0.13 माइक्रोमोलर के एक माइक्रोमोलर और अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम के कैल्शियम के एक माइक्रोमोलर में 29.6 प्लस या माइनस 1.61 माइक्रोमोलर के बिना माइटोकॉन्ड्रियल आराम कैल्शियम एकाग्रता के साथ पर्याप्त परिवर्तन प्रकट करते हैं।माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता की निगरानी दो नैनोमोलर्स टीएमआरई की प्रचुरता से की गई थी । माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता में परिवर्तन की गणना शून्य से 150 मिलीवोलlt की एक ग्रहण प्रारंभिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता के आधार पर की गई थी, जो कैल्शियम के अलावा के जवाब में एनएचएच में कमी का प्रदर्शन करती है, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता पर एक नगण्य प्रभाव के साथ। माइटोकॉन्ड्रियल पीएच कार्बोक्सी SNARF-1 लोडिंग द्वारा प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम में वृद्धि से प्रभावित नहीं था।गलत आइसोबस्टिक अंक गलत आर और NADH सुधार में परिणाम है । इसलिए सेल-फ्री बैकग्राउंड और सेल एरिया को हमेशा सही ढंग से मापने का ध्यान रखें। इस तकनीक का उपयोग बायोएनालिटिकल फैल में माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम गतिशील अध्ययन तैयार करने के लिए किया जाता है।

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: सटीक जीनोटाइपिंग के लिए एक सरल तरीका

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

ECIS / टैक्सी के साथ सेलुलर chemotaxis का मापन

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular सीए मापने<sup&gt; 2</supचार तकनीकों का उपयोग करते हुए मानव शुक्राणु में&gt; परिवर्तन: परम्परागत fluorometry, फ्लो fluorometry, फ्लो और सिंगल सेल इमेजिंग रूका

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

एक उपन्यास<em&gt; पूर्व vivo</emभ्रूण माउस हार्ट के लिए&gt; संस्कृति विधि

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

माउस अग्नाशय आइलेट अलगाव और intracellular शिविर निर्धारण के लिए एक विधि

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते रहते चूहों में इमेजिंग subcellular संरचनाओं के लिए intravital माइक्रोस्कोपी

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण का प्रयोग जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच कर

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

इमेजिंग स्थानीय सीए<sup&gt; 2 +</sup&gt; संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में सिग्नल

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Intracellular सीए की दो photon इमेजिंग<sup&gt; 2 +</sup&gt; एक अलग चूहा महाधमनी के रख रखाव और endothelial में नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

प्रतिदीप्ति लेबल नैनोकणों का उपयोग कर Murine, मानव और सुअर उत्पत्ति के जीवित कोशिकाओं में Intracellular जीन एक्सप्रेशन की जांच

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...