Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Basic Science Research Program attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF) finanziato dal Ministero dell'Istruzione (2018R1A6A3A01011832), dal Ministero della Scienza, ICT & Future Planning (NRF-2016M3C1A6936606) e dal Ministero del Commercio, dell'Industria e dell'Energia (10068076).

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali.
1. Preparazione della soluzione
<ol><li>Preparare un singolo miocito cardiaco appena isolato11. NOTA: ogni laboratorio potrebbe avere una soluzione di memorizzazione cellulare diversa. Qui, i miociti sono memorizzati in mezzo di coltura (DMEM).</li>
	<li>Preparare 100 mL di soluzione gratuita di Ca2o(tabella 1).</li>
...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. 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NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

Il metodo di correzione delle interferenze è stato sviluppato con successo per misurare i segnali degli analoghi NADH e fura-2. La misurazione esatta dei segnali è essenziale per la correzione esatta. Tuttavia, la natura intrinseca del dispositivo fluorescente produce un segnale di fondo non correlato a quello di NADH di fura-2. Il filtro a bande-passa-banda di altissima qualità può passare solo fino a 10euro delle lunghezze d'onda indesiderate della luce. Tuttavia, il segnale fluorescente da una singola c...

Il ruolo significativo di Ca2 intracellulare è ampiamente noto1. La quantificazione di [Ca2]è essenziale per comprendere i processi delle funzioni fisiologiche cellulari. Gli analoghi Fura-2 sono molto utili perché sono entusiasti nella gamma UV (<400 nm) e il metodo ratiometrico può essere applicato per la misurazione quantitativa. Pertanto, altri parametri fisiologici come il pH, il potenziale della membrana, ecc., possono essere misurati con altri coloranti fluorescenti. L'intervallo mitocondriale di Concentrazione di Ca2 o m ([Ca2]]è stato riferito che 0,08,20 M2,3,4,5. Tra gli analoghi fura-2, il fura-2-FF è adatto per misurare questa gamma di [Ca2s]. Tuttavia, le cellule vive contengono purtroppo NADH/NADPH per i loro processi metabolici, e NADH genera interferenze di segnale a causa della sovrapposizione degli spettri di eccitazione ed emissione con l'analogico fura-2. Questa interferenza limita notevolmente l'uso di analoghi fura-2. In particolare, se l'analogico viene applicato per misurare il mitocondriale [Ca2s], questa interferenza è l'ostacolo più grande perché la quantità più alta di NADH è nei mitocondri. Ciò è ulteriormente complicato dal fatto che i cambiamenti NADH sono correlati al potenziale della membrana mitocondriale(m) e al cambiamento dim colpisce [Ca2 ]m6,7,8 , 9.Inoltre, per studiare le dinamiche di [Ca2]m, è essenziale conoscere lo stato di altri parametri mitocondriali, come NADH,me pH.
Le emissioni a 450 nm e 500 nm con eccitazioni a 353 nm, 361 nm e 400 nm contengono i segnali da NADH e fura-2-FF e le equazioni sono le seguenti. Qui, 353 nm e 361 nm sono i punti isosbestici di fura-2-FF per le emissioni a 450 nm e a 500 nm, rispettivamente.
Equazione F361,450 - F361.450,NADH - F361.450,Fura 1 Equazione F353.500 x F353.500,NADH , F353.500,Fura F400.500 - F400.500,NADH - F400.500,Fura Equazione 3
dove Fx,y è l'intensità di emissione misurata a y-nm per eccitazione x-nm, Fx,y,NADH rappresenta l'intensità di emissione pura dipendente da NADH e Fx,y,Fura rappresenta l'intensità di emissione pura dipendente da fura-2-FF. Sotto la stessa concentrazione del tinrito fluorescente, una certa intensità di eccitazione dovrebbe produrre la stessa intensità di emissione. Pertanto, il rapporto di intensità di emissione di due diverse lunghezze d'onda di eccitazione dovrebbe essere costante. La frequenza Ca2 e fura-2 non hanno influenzato le caratteristiche della fluorescenza NADH; pertanto, il rapporto tra le emissioni a 450 nm e a 500 nm di NADH era costante a qualsiasi lunghezza d'onda di eccitazione. La stessa regola può essere utilizzata per fura-2-FF sulla base del presupposto che NADH o [Ca2 )non influenzino gli spettri di emissione ed eccitazione di fura-2-FF. Tuttavia, Ca2o causò uno spostamento spettrale dell'emissione di fura-2-FF. Pertanto, per rimuovere l'effetto dell'eccitazione isoscanica ca2,che è indipendente da Ca2, deve essere utilizzata. Ogni lunghezza d'onda di emissione (vale a dire 450 nm e 500 nm) ha un punto isosbestico diverso e, dalla nostra configurazione sperimentale, 353 nm a 500 nm e 361 nm a 450 nm sono stati scelti. Da queste, le seguenti equazioni sono valide10.
Rf - F361.450,Fura/F353.500,Fura Equazione 4 RN1 - F400.500,NADH/F361,450,NADH Equazione 5 RN2 - F353.500,NADH/F361,450,NADH Equazione 6
Con queste costanti, le equazioni seguenti da (Equazione 1) (Equazione 2) e (Equazione 3) sono valide.
F361,450 - F361,450,NADH , Rf 353.500,Equazione Fura 7 F353,450 , RN2 , F361,450,NADH , F353.500,Equazione Fura 8 F400.500 , RN1 , F361,450,NADH , F400,500,Equazione 9
Da queste equazioni, se Rf, RN1e RN2 sono noti, i segnali puri di NADH e fura-2 possono essere ottenuti come segue.
Equazione 10 (F361,450) -(F 361,450 ) F353.500,Fura : (RN2 , F361,450 F353.500)/(Rf - RN2 - 1) Equazione 11 F400.500,Fura : F400.500 , RN1 , F361,450,NADH Equazione 12 RFura - F353.500,Fura/F400,500,Equazione Fura 13
La forma di fura-2-FF legata a Ca2oera praticamente non fluorescente alla lunghezza d'onda dell'eccitazione di 400 nm. In base a questa proprietà, è possibile derivare la nuova equazione di calibrazione seguente.
Equazione [Ca2,] : Kd . (F400.500,max/F353.500,max) - (RFura - Rmin) 14
dove Kd è una costante di dissociazione, F400.500,max e F353.500,max sono i valori massimi dei segnali emessi a 500 nm con eccitazioni rispettivamente a 400 nm e 353 nm e Rmin è il valore minimo RFura in Ca2 -condizione -free. Poiché sono state utilizzate le eccitazioni isosoriche, l'equazione può essere ulteriormente semplificata come segue.
Equazione15(1 / Rmin) 
Pertanto, solo I valori Kd e Rmin sono necessari per calcolare [Ca2 '].

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

Per misurare quantitativamente [Ca2o] analoghi fura-2, che sono fluorostiche ratiometriche. Tuttavia, l'uso di tintura è intrinsecamente limitato nelle cellule vive a causa dell'interferenza dell'autofluorescenza, principalmente da nicotinamide dinucleotide (NADH). Più specificamente, questo è un ostacolo importante quando si misura il mitocondriale [Ca2]quantitativamente utilizzando fura-2 analoghi perché la maggior parte di NADH è nei mitocondri. Se la concentrazione di tinti fluorescenti è la stessa, una certa intensità di eccitazione dovrebbe produrre la stessa intensità di emissione. Pertanto, il rapporto di intensità di emissione di due diverse lunghezze d'onda di eccitazione dovrebbe essere costante. Sulla base di questo principio, è stato sviluppato un nuovo metodo di correzione online dell'interferenza del segnale NADH per misurare [Ca2]e si può ottenere la reale intensità del segnale di NADH e fura-2. Inoltre, è stata sviluppata una nuova equazione per il calcolo di [Ca2]con eccitazione o eccitazione isosbestica a 400 nm. Con questo metodo, i cambiamenti nel mitocondriale [Ca2]potrebbero essere misurati con successo. Inoltre, con un diverso insieme di lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, è possibile misurare simultaneamente più parametri, tra cui NADH, [Ca2]e pH o potenziale di membrana mitocondriale(m). I mitocondriali [Ca2]e/m o pH sono stati misurati utilizzando fura-2-FF e tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) o carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1).

Modifiche mitocondriali Ca2 a causa della correzione10 Figura 4 Mostra le modifiche in [Ca2 ]m prima e dopo la correzione. I risultati hanno mostrato chiaramente i cambiamenti sostanziali in [Ca2 ']m. La concentrazione di calcio a riposo mitocondriale senzacitosolica Ca2 , c , era di 1,03 x 0,13 M (vale la media (vale a dire S.E., n - 32), e il massimo [Ca2]m a 1-M [Ca2]</sup...

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A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

A causa della sovrapposizione spettrale delle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione degli analoghi NADH e fura-2, l'interferenza del segnale da entrambe le sostanze chimiche nelle cellule vive è inevitabile durante la misurazione quantitativa di [Ca2 ']. Così, è stato sviluppato un nuovo metodo di correzione online dell'interferenza del segnale NADH per misurare [Ca2 ].

Un nuovo metodo di correzione Adenine Adenine nicotinamide per la misurazione intracellulare Ca2o con Fura-2-Analog nelle cellule vive

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

Le sonde plurali eccitabili UV, hanno una contaminazione intrinseca del segnale, a causa dei suoni auto-plurali. La maggior parte del problema con il NADH, è limitare l'uso di una sonda plurale. Un metodo può essere usato, per correggere con precisione la florescenza esterna dal NADH, al fine di estrarre un vero segnale di sonda plurale incontaminato.A dimostrare la procedura sarà Jeong Hoon Lee, il nostro assistente di ricerca del mio laboratorio. Dopo aver permesso ai miociti di depositarsi sul fondo del tubo, aspirare il supernatante. Etichettare le cellule con due millilitri di una soluzione diluizione millimolare fura-2-FFAM preparata al momento per 60 minuti a quattro gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione, posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 30 minuti in posizione verticale prima di rimuovere il supernatante. Quindi aggiungere quattro millilitri di mezzo di coltura a temperatura ambiente per lo stoccaggio a temperatura ambiente. Per l'identificazione isobestica in situ del punto fura-2-ffa montare le cellule diluite sullo stadio del microscopio e attendere tre minuti affinché le cellule sprofondno sul fondo.Abbondante soluzione priva di NADH di 37 gradi Celsius priva di calcio nella coltura cellulare e individuare una cellula bersaglio. Abbondante soluzione di saponina per 60 secondi prima di riprosaciare con la soluzione priva di calcio senza NADH. Misurare contemporaneamente i segnali emessi da fura-2-ff a 450 e 500 nanometri, utilizzando una scansione di eccitazione da 350 a 365 nanometri con un passo di 0,1 nanometri e ri-profusi con una soluzione priva di calcio senza NADH.Quindi sottrarre i segnali nella soluzione satura di calcio dai segnali nelle condizioni libere dal calcio. Quindi calcolare le deviazioni standard dell'emissione ad ogni eccitazione e selezionare la lunghezza d'onda di eccitazione che mostra i valori minimi di deviazione standard come singoli punti isobestici. Per utilizzare un sistema di misurazione multi-parametrico per rilevare il segnale di fondo e correggere il segnale all'interno dell'area cellulare, montare le cellule senza coloranti nel bagno del microscopio e consentire alle cellule di depositarsi per tre minuti.Abbondante soluzione priva di calcio NADH nel bagno per circa cinque minuti a una velocità da due a tre millilitri al minuto e impostare il campo dell'oggetto per coprire la cellula mirata. Dopo aver spostare la cella fuori dal campo, misurare i segnali di fondo della finestra senza celle e impostare i segnali come offset. Quindi riportare la cella nella posizione iniziale e misurare i segnali di sfondo della cella e l'area della cella.Per calcolare il fattore R utilizzare lo sfondo cellulare acquisito e i segnali di area prima di rimontare le cellule senza coloranti al microscopio e profuse con soluzione priva di calcio. Misurare i segnali come indicato prima di abbondante la sospensione cellulare con soluzione malato. Dopo aver misurato i segnali profuse le cellule con soluzione piruvata seguita da profusione con soluzione malato-piruvato e soluzione di rotenone.Quindi calcolare la pendenza per ogni segnale. Qui vengono mostrati i cambiamenti nel calcio mitocondriale prima e dopo la correzione. I risultati rivelano chiaramente cambiamenti sostanziali nel calcio mitocondriale con una concentrazione di calcio a riposo mitocondriale senza calcio citosolico di 1,03 più o meno 0,13 micromolare e calcio mitocondriale massimo ad un micromolare di calcio di 29,6 più o meno 1,61 micromolare.Il potenziale transmembrana mitocondriale è stato monitorato con una profusione di due nanomolari TMRE. La variazione del potenziale mitocondriale è stata calcolata sulla base di un presunto potenziale iniziale di membrana mitocondriale di meno 150 millivolt, dimostrando una diminuzione del NADH in risposta all'aggiunta di calcio, con un effetto negliabile sul potenziale della membrana mitocondriale. Il pH mitocondriale non è stato fatto dall'aumento del calcio mitocondriale indotto dal carico carbossi SNARF-1.Punti isobestici errati ducono una correzione R e NADH errata. Quindi fai attenzione a misurare sempre correttamente lo sfondo e l'area cellulare senza cellule. Questa tecnica viene utilizzata per preparare studi dinamici mitocondriali sul calcio nelle fuoriuscite bioanalitiche.

Research

JoVE Journal

Biology

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