Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
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この研究は、文部科学省の助成を受けた韓国国立研究財団(NRF)の基礎科学研究プログラム(2018R1A6A3A01011832)、科学・ICT・未来計画省(NRF-2016M3C1A6936606)の支援を受けたものです。貿易産業省(10068076)によって。

すべての実験プロトコルは、地元の機関動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. ソリューションの準備
<ol><li>単一の新たに単一分離された心臓筋細胞11を調調す。 注: 各ラボには異なる細胞貯蔵ソリューションがある場合があります。ここで、筋細胞は培養培地(DMEM)に貯蔵される。</li>
	<li>Ca2+-フリー溶液の100 mLを準備します(<stron...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2++under+various+conditions.">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li><li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium.">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li><li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues.">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li><li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals.">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

干渉補正法は、NADHとフラ2アナログの信号を測定するために開発されました。信号の正確な測定は、正確な補正に不可欠です。しかし、蛍光装置の本来の性質は、フラ-2のNADHとは無関係の背景信号を生成する。最高品質のバンドパスフィルタは、光の不要な波長の10-8までしか通過できません。しかし、単一細胞からの蛍光シグナルは非常に小さく、バンドパスフィルタ後の励起光の?...

細胞内Ca2+の重要な役割は広く知られている1.[Ca2+]の定量化は、細胞の生理機能のプロセスを理解するために不可欠です。Fura-2アナログはUV範囲(<400 nm)で励起され、定量測定にレシオメトリック法を適用できるので非常に便利です。従って、pH、膜電位等の他の生理学的パラメータは、他の蛍光色素と共に測定することができる。ミトコンドリアCa2+濃度([Ca2+]m)の範囲は、伝えられるところでは0.08−20 μM2、3、4、5であった。フラ-2アナログの中でも、フラ2-FFは「Ca2+」のこの範囲の測定に適しています。しかし、生細胞には代謝過程にNADH/NADPHが含まれており、NADHはフラ-2アナログと励起と発光スペクトルが重なり合うため信号干渉を発生します。この干渉は、fura-2アナログの使用を大幅に制限します。具体的には、ミトコンドリア[Ca2+]を測定するためにアナログを適用した場合、NADHの最大量がミトコンドリアにあるため、この干渉が最大の障害となる。これは、ミトコンドリア膜電位(+m)に関連するNADHの変化によってさらに複雑になり、及びmの変化は[Ca2+]m 6、7、8に影響を与える,9.さらに、[Ca2+]mダイナミクスを研究するためには、NADH、αm、pHなどの他のミトコンドリアパラメータの状態を知る必要がある。
353 nm、361 nm、および 400 nm の励起を伴う 450 nm および 500 nm の放出には、NADH および fura-2-FF からの信号が含まれており、式は次のとおりです。ここで、353 nmおよび361nmは、それぞれ450nmおよび500nmでの排出に対するフラ2-FFのイソスベスティックポイントである。
F361,450 = F361,450,NADH + F361,450,フラ方程式 1 F353,500 = F353,500,NADH + F353,500,フラ方程式 2 F400,500 = F400,500,NADH + F400,500,フラ方程式 3
ここで、F x,yは x-nm 励起による y-nm での測定された発光強度であり、Fx,y,NADHは純粋な NADH 依存性発光強度を表し、Fx,y,Furaは純粋なフラ-2-FF 依存性発光強度を表します。蛍光色素の同じ濃度の下で、特定の励起強度は、同じ発光強度を生成する必要があります。したがって、2つの異なる励起波長の発光強度比は一定でなければならない。Ca2+およびフラ-2はNADH蛍光特性に影響を与えなかった。従って、NADHの450nmおよび500nmでの放出の比率は、任意の励起波長で一定であった。NADHまたは[Ca2+]がフラ-2-FFの放出および励起スペクトルに影響を与えないという仮定に基づいて、同じルールをフラ2-FFに使用することができます。しかし、Ca2+はフラ-2-FF放出のスペクトルシフトを引き起こした。したがって、Ca2+の効果を除去するには、Ca2+に依存しないイソスベスト励起を使用する必要があります。各発光波長(すなわち、450 nmおよび500 nm)は異なるアイソスベストポイントを有し、我々の実験セットアップから、500nmで353 nm、450nmで361nmを選択した。これらのことから、次の式は有効な 10です。
R= F361,450,フラ/F353,500,フラ方程式 4 RN1 = F400,500,NADH/F361,450,NADH方程式 5 RN2 = F353,500,NADH/F361,450,NADH式 6
これらの定数では、(式 1)(式2)および(式3)からの次の式が有効です。
F361,450 = F361,450,NADH + Rf × F353,500,フラ方程式 7 F353,450 = RN2 × F361,450,NADH + F353,500,フラ方程式 8 F400,500 = RN1 × F361,450,NADH + F400,500,フラ方程式 9
これらの式から、Rf、RN1、およびRN2が知られている場合、NADHおよびfura-2の純粋な信号は以下のように得ることができる。
F361,450,NADH = (F361,450 - Rf × F353,500)/(1 - Rf × RN2)式 10 F353,500,フラ= (RN2 × F361,450 - F353,500)/(Rf × RN2 - 1) 式 11 F400,500,フラ= F400,500 - RN1 × F361,450,NADH方程式 12 Rふら= F353,500,フラ/F400,500,フラ方程式 13
フラ-2-FFのCa2+結合形態は、400nm励起波長で実質的に非蛍光であった。このプロパティに基づいて、次の新しいキャリブレーション方程式を導き出すことができます。
[Ca2+] = Kd ∙ (F400,500,max/F353,500,max)× (Rフラ- R分)式 14
ここで、Kdは解離定数であり、F400,500、maxおよび F353,500、最大は、それぞれ 400 nm と 353 nm の励起を持つ 500 nm で放出された信号の最大値であり、Rminは Ca 2 の最小 Rフラです。+-フリー条件。アイソスベスティック励起を用いたので、この方程式は以下のようにさらに簡略化することができる。
[Ca2+] = Kd ∙ (1 / R分)∙ (Rフラ- R分)式 15
したがって、[Ca2+]を計算するために必要なのは Kdと R分の値だけです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

[Ca2+]を定量的に測定するために、比率蛍素プローブであるフラ2アナログが頻繁に使用されます。しかし、色素の使用法は、主にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)からの自己蛍光干渉のために生細胞において本質的に制限される。具体的には、NADHの大部分がミトコンドリアにあるため、フラ-2アナログを定量的に用いてミトコンドリア[Ca2+]を測定する際の大きな障害となる。蛍光色素濃度が同じである場合、特定の励起強度は同じ発光強度を生成する必要があります。したがって、2つの異なる励起波長の発光強度比は一定でなければならない。この原理に基づき、NADH信号干渉を測定する新規なオンライン補正法「Ca2+」を開発し、NADHとフラ-2の実信号強度を得ることができる。また、400nmでイソスベスティック励起または励起を用いて「Ca2+」を計算する新規方程式を開発した。この方法では、ミトコンドリア[Ca2+]の変化を正常に測定することができました。さらに、励起波長と発光波長の異なるセットを用いて、NADH、[Ca2+]、およびpHまたはミトコンドリア膜電位(+m)を含む複数のパラメータを同時に測定することができる。ミトコンドリア[Ca2+]およびαmまたはpHを、フラ-2-FFおよびテトラメチルロダミンエチルエステルエステル(TMRE)またはカルボキシセミナフトローダフールフルオール-1(カルボキシ-SNARF-1)を用いて測定した。

ミトコンドリアCa2+修正による変更10 図4は、補正前後の[Ca2+]mの変化を示す。結果は明らかに[Ca2+]mの実質的な変化を示した。サイトソリックCa2+を含まないミトコンドリア安静カルシウム濃度は1.03±0.13μM(平均±S.E.、n=32)、最大[Ca2+]mは1μM[Ca2+]cで29.6±1.61μM( 平均 ±S....

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A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

NADHとfura-2アナログの励起波長と発光波長のスペクトルが重なり合うため、[Ca2+]の定量測定中に生細胞内の両方の化学物質からの信号干渉は避けられません。そこで、NADH信号干渉を測定する新規なオンライン補正法「Ca2+」を開発した。

生細胞におけるフラ-2-アナログによる細胞内Ca2+測定に関する新規ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド補正法

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

UV励起可能な複数プローブは、自動多元音のために固有の信号汚染を有する。NADHの問題のほとんどは、複数プローブの使用を制限している。NADHから外側の蛍光を正確に補正する方法を使用して、真の、汚染されていない複数のプローブ信号を抽出する。この手順を実証するのが、私の研究室の研究助教授であるチョン・フン・リーです。筋細胞が管の底に落ち着くようにした後、上清を吸引する。2ミリリットルの新鮮なミリモルフラ-2-FFAM希釈液を摂氏4度で60分間ラベル付けします。インキュベーションの終わりに、上清を取り除く前に、37°Cの水浴に30分間直立した位置にチューブを置きます。その後、室温で保存するために室温培養培地を4ミリリットル加えます。その場でのイソベシティフラ-2-ffaポイント識別は、希釈された細胞を顕微鏡ステージに取り付け、細胞が底に沈むのを3分間待ちます。NADHフリー37度のカルシウムフリー溶液を細胞培養に多用し、標的細胞を見つける。NADHフリーのカルシウムフリー溶液を再利用する前に60秒間サポニン溶液を多量に使用します。0.1ナノメートルのステップで350〜365ナノメートルの励起スキャンを使用して、450ナノメートルと500ナノメートルで発するフラ-2-ff信号を同時に測定し、NADHフリーのカルシウムフリー溶液で再使用します。次に、カルシウムフリー条件のシグナルからカルシウム飽和溶液中のシグナルを差し引く。次に、各励起における発光の標準偏差を計算し、個々のイソベスティクス点として最小標準偏差値を示す励起波長を選択します。マルチパラメトリック測定システムを使用してバックグラウンド信号を検出し、細胞領域内の信号を補正するには、顕微鏡浴に色素のない細胞を取り付け、細胞を3分間落ち着かせる。NADHカルシウムフリー溶液を1分間に2〜3ミリリットルで約5分間浴中に入れ、対象細胞を覆う物体フィールドを設定する。セルをフィールド外に移動した後、セルフリーウィンドウのバックグラウンド信号を測定し、オフセットとして信号を設定します。次に、セルを初期位置に戻し、セルの背景信号とセル領域を測定します。Rファクターを計算するには、染色フリー細胞を顕微鏡に再マウントし、カルシウムフリー溶液を使用する前に、取得した細胞の背景と領域信号を使用します。細胞懸濁液をmalate溶液でプロフェッブルする前に示されたシグナルを測定します。信号を測定した後、ピルビン酸溶液で細胞を多量にし、続いて、マレートピルビン酸溶液とロテノーン溶液を用いて増殖する。次に、各信号の傾きを計算します。ここで、ミトコンドリアカルシウムの変化を補正前後に示す。この結果は、29.6プラスまたはマイナス1.61マイクロモルのカルシウムの1マイクロモルで1.03プラスマイナス0.13マイクロモルと最大ミトコンドリアカルシウムのミトコンドリア安静カルシウム濃度を有するミトコンドリアカルシウムの実質的な変化を明らかにした。ミトコンドリア膜貫通電位を2つのナノモルTMREの拡散でモニタリングした。ミトコンドリア電位の変化は、マイナス150ミリボルトの想定された初期ミトコンドリア膜電位に基づいて計算され、カルシウム付加に対するNADHの減少を示し、ミトコンドリア膜電位に対して負の影響を及ぼす。このミトチョンディラルpHは、カルボキシSNARF-1ローディングによって誘導されるミトコンドリアカルシウムの増加によって影響を受けなかった。正しくないisobesticポイントは不正確なRおよびNADHの訂正をもたらす。したがって、セルフリーの背景とセル領域を常に正しく測定するように注意してください。この技術は、生物分析流出におけるミトコンドリアカルシウム動態研究を調製するために使用される。

Research

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Biology

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Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

ECIS /タクシーと細胞走化性の測定

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

細胞内Ca測定<sup&gt; 2 +</sup4つの方法を使用して人間の精子で&gt;変更：従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

小説<em&gt;エクスビボ</emマウス胎児ハート&gt;文化法

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

生物発光共鳴エネルギー転移を用いて生細胞中のタンパク質 - タンパク質相互作用を調査する

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

蛍光標識ナノ粒子を用いたマウス、ヒトおよびブタ起源のライブ細胞の細胞内遺伝子発現の検出

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...