Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
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이 작품은 교육부(2018R1A6A3A0111832)가 지원하는 국립연구재단(NRF)을 통해 기초과학 연구 프로그램(NRF-2016M3C1A696606)의 지원을 받았습니다. 산업통상자원부(10068076)에 의해

모든 실험 프로토콜은 지역 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>단 하나 갓 고립된 심장 근세포11를준비하십시오. 참고: 각 실험실에는 다른 세포 저장 솔루션이 있을 수 있습니다. 여기서, 근세포는 배양 배지(DMEM)에 저장된다.</li>
	<li>Ca2+-free 용액 100 mL을 준비하십시오(표 1).</li>
	<li>50 mL 비커?...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2++under+various+conditions.">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li><li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium.">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li><li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues.">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li><li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals.">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

간섭 보정 방법은 NADH 및 fura-2 유사체의 신호를 측정하기 위해 성공적으로 개발되었습니다. 정확한 교정을 위해서는 신호의 정확한 측정이 필수적입니다. 그러나, 형광 장치의 본질적인 특성은 후라-2의 NADH와 관련이 없는 배경 신호를 생성한다. 최고 품질의 밴드 패스 필터는 빛의 원치 않는 파장의 10-8까지 만 통과 할 수 있습니다. 그러나 단일 셀의 형광 신호는 매우 작고, 밴드 패스 필?...

세포 내 Ca2+의 중요한 역할은 널리 알려진1. [Ca2+]의정량화는 세포 생리 기능의 과정을 이해하는 데 필수적입니다. Fura-2 아날로그는 UV 범위(&400 nm)에서 흥분하기 때문에 매우 유용하며, 비율 측정 방법은 정량 측정에 적용될 수 있습니다. 따라서, pH, 막 전위 등과 같은 다른 생리학적 파라미터는 다른 형광 염료로 측정될 수 있다. 미토콘드리아Ca2+ 농도([Ca2+]m]범위는 0.08-20 μM2,3,4,5로알려졌다. fura-2 유사체 중에서 fura-2-FF는 [Ca2+]의 이 범위를 측정하는 데 적합합니다. 그러나, 살아있는 세포는 불행하게도 그들의 신진 대사 과정에 대한 NADH/NADPH를 포함하고, NADH는 fura-2 아날로그와 겹치는 여기 및 방출 스펙트럼 때문에 신호 간섭을 생성합니다. 이 간섭은 fura-2 유사체의 사용을 크게 제한합니다. 구체적으로, 유사체가 미토콘드리아[Ca2+]를측정하기 위해 적용되는 경우, NADH의 가장 높은 양이 미토콘드리아에 있기 때문에 이러한 간섭이 가장 큰 장애물이다. 이것은 NADH 변화가 미토콘드리아 막 전위(Θm)와관련이 있고 Θm의 변화가[Ca2+ ]m6,7,8에영향을 미치므로 더욱 복잡해져요. , 9. 또한,[Ca2+]m 역학을 공부하기 위해, NADH, Θm및 pH와 같은 다른 미토콘드리아 매개 변수의 상태를 아는 것이 필수적이다.
450 nm 및 500 nm에서의 방출은 353 nm, 361 nm 및 400 nm에서 NADH 및 fura-2-FF로부터의 신호를 포함하고, 수학식은 다음과 같다. 본 명세서에서, 353 nm 및 361 nm는 각각 450 nm 및 500 nm에서 배출을 위한 후라-2-FF의 이등산 지점이다.
F361,450 = F361,450, NADH + F361,450,후라 방정식 1 F353,500 = F353,500, NADH + F353,500,후라 방정식 2 F400,500 = F400,500, NADH + F400,500, 후라 방정식 3
여기서 Fx, y는 x-nm 여기, Fx, y, NADH는 순수한 NADH 의존 방출 강도를 나타내고, Fx, y, Fura는 순수한 후라-2-FF 의존 방출 강도를 나타냅니다. 형광 염료의 동일한 농도하에서, 특정 여기 강도는 동일한 방출 강도를 생성해야 한다. 따라서, 두 개의 상이한 여기 파장의 방출 강도 비는 일정해야 한다. Ca2+ 및 fura-2는 NADH 형광 특성에 영향을 미치지 않았다; 따라서 NADH의 450 nm 및 500 nm에서의 방출 비율은 임의의 여기 파장에서 일정하였다. 동일한 규칙은 NADH 또는[Ca2+]가후라-2-FF의 방출 및 여기 스펙트럼에 영향을 미치지 않는다는 가정에 기초하여 fura-2-FF에 사용될 수 있다. 그러나,Ca2+는 후라-2-FF 방출의 스펙트럼 변화를 일으켰다. 따라서Ca2 +의효과를 제거하려면Ca2 +와무관한 isosbestic 여기를 사용해야합니다. 각 방출 파장(즉, 450 nm 및 500 nm)은 상이한 isosbestic 포인트를 가지며, 우리의 실험 설정에서, 500 nm에서 353 nm 및 450 nm에서 361 nm이 선택되었다. 이 로부터 다음 방정식은 유효한10.
Rf = F361,450, 후라/ F353,500, 후라 방정식 4 RN1 = F400,500, NADH/F361,450, NADH 방정식 5 RN2 = F353,500, NADH/F361,450, NADH 방정식 6
이러한 상수의 경우 (수학식 1) 및 (수학식 3)의 다음 방정식이 유효합니다.
F361,450 = F361,450, NADH + Rf × F353,500, 후라 방정식 7 F353,450 = RN2 × F361,450, NADH + F353,500, 후라 방정식 8 F400,500 = RN1 × F361,450, NADH + F400,500, 후라 방정식 9
이러한 방정식으로부터, Rf,RN1및 RN2가 공지된 경우, NADH 및 fura-2의 순수한 신호는 다음과 같이 얻어질 수 있다.
F361,450,NADH = (F361,450 - RF × F353,500)/(1− RF ×R N2)방정식 10 F353,500,후라 = (RN2 × F361,450 - F353,500)/(RF × RN2 - 1) 방정식 11 F400,500,후라 = F400,500 - RN1 × F361,450, NADH 방정식 12 R후라 = F353,500, 후라/ F400,500, 후라 방정식 13
Ca2+-바운드 형태의 후라-2-FF는 400 nm 여기 파장에서 실질적으로 비형광이었다. 이 속성에 따라 다음과 같은 새 교정 방정식을 파생할 수 있습니다.
[Ca2+ +] = KD ∙ (F400,500, 최대/ F353,500, 최대)× (R후라 - R분)방정식 14
여기서Kd는 해리 상수, F400,500, 최대 및 F353,500, 최대는 각각 400 nm 및 353 nm에서 여기와 500 nm에서 방출 된 신호의 최대 값이며, Rmin은 Ca 2의 최소 RFura입니다. +- 무료 상태. 이소성 여기가 사용되었기 때문에, 방정식은 다음과 같이 더 단순화 될 수있다.
[Ca2+ +] = KD ∙ (1 / R분)∙ (R후라 - R분)방정식 15
따라서 [Ca2+]를 계산하려면 Kd 및 R최소 값만 필요합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

[Ca2+]정량적으로 측정하기 위해 비메트릭 플루오로프로브인 fura-2 유사체가 자주 사용됩니다. 그러나, 염료 사용은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)로부터 주로 자가형광 간섭으로 인해 살아있는 세포에서 본질적으로 제한된다. 보다 구체적으로, 이것은 NADH의 대부분이 미토콘드리아에 있기 때문에 fura-2 유사체를 정량적으로 사용하여 미토콘드리아[Ca2+]를측정할 때 주요 장애물이다. 형광 염료 농도가 동일하면 특정 여기 강도가 동일한 방출 강도를 생성해야 합니다. 따라서, 두 개의 상이한 여기 파장의 방출 강도 비는 일정해야 한다. 이러한 원리에 기초하여, NADH 신호 간섭을 측정하는 새로운온라인 보정 방법이 개발되었으며, NADH 및 fura-2의 실제 신호 강도를 얻을 수 있다. 또한,[Ca2+]를계산하는 새로운 방정식은 400 nm에서 isosbestic 여기 또는 여기로 개발되었다. 이 방법을 사용하면 미토콘드리아 [Ca2+]의변화를 성공적으로 측정할 수 있습니다. 또한, 다른 일련의 여기 및 방출 파장의 경우, NADH,[Ca2+],및 pH 또는 미토콘드리아 막 전위(Θm)를포함하는 다중 파라미터를 동시에 측정할 수 있었다. 미토콘드리아[Ca2+] 및 Θm 또는 pH는 후라-2-FF 및 테트라메틸호다민 에틸 에스테르(TMRE) 또는 카르복시-세미나피-호르다플루오르-1(카르복시-SNARF-1)을 사용하여 측정하였다.

미토콘드리아 Ca2+ 수정으로 인한 변경10 그림 4는 보정 전후의[Ca2+]m의 변화를 보여줍니다. 결과는[Ca2+]m의상당한 변화를 명확하게 보여 주었다. 시토솔산 Ca2+([Ca 2+]c)가없는 미토콘드리아 휴식 칼슘 농도는 1.03±0.13 μM(평균 ±S.E., n=32)이었고, 1-μM에서[Ca2+]m의 최대는 29.6±1.61 μM...

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A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

NADH 및 fura-2 유사체의 여기 및 방출 파장의 스펙트럼 중첩으로 인해[Ca2+]의 정량 적 측정 중에 라이브 셀의 두 화학 물질의 신호 간섭이 불가피합니다. 따라서, NADH 신호 간섭을 측정하는 새로운 온라인 보정 방법이개발되었다[Ca2+]

라이브 셀에서 Fura-2-Analog를 이용한 세포내 Ca2+ 측정을 위한 새로운 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 보정 방법

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

UV 흥분성 복수 프로브는 자동 복수음으로 인해 고유 신호 오염을 가지게 된다. NADH의 대부분의 문제점은 복수 프로브의 사용을 제한하고 있다. NADH로부터의 외부 플로레시브를 정밀하게 교정하여, 오염되지 않은 다원 탐사 신호를 추출하기 위해 방법을 사용할 수 있다.그 절차를 시연하는 것은 제 실험실에서 연구조교수인 이정훈 교수입니다. 심근세포가 튜브 의 바닥에 정착 할 수 있도록 한 후, 슈퍼 나탄을 흡인. 갓 준비된 밀리머 1밀리머 fura-2-FFAM 희석 용액을 섭씨 4도에서 60분간 2밀리리터로 셀에 라벨을 붙입니다.인큐베이션이 끝나면, 수퍼를 제거하기 전에 37도 의 수조에 튜브를 똑바로 세워 30 분 동안 배치하십시오. 그런 다음 실온에서 보관할 수 있는 실온 배양 배지 4밀리리터를 추가합니다. 시투 동위 상층포라-2-ffa 포인트 식별을 위해 희석된 세포를 현미경 단계에 장착하고 세포가 바닥으로 가라앉을 때까지 3분을 기다린다.NADH가 없는 섭씨 37도 칼슘 없는 용액을 세포 배양에 투입하고 표적 세포를 찾습니다. NADH 가 없는 칼슘 없는 용액을 재사용하기 전에 60초 동안 사포닌 용액을 사용하십시오. 동시에 450 및 500 나노미터에서 fura-2-ff 방출 신호를 측정하여 350 ~ 365 나노미터의 암분 스캔을 사용하여 0.1 나노미터 단계로 NADH가없는 칼슘없는 용액으로 다시 profuse.다음으로 칼슘 없는 조건의 신호로부터 칼슘 포화 용액의 신호를 빼는다. 그런 다음 각 여기에서 배출의 표준 편차를 계산하고 개별 동면 점으로 최소 표준 편차 값을 나타내는 흥분 파장을 선택합니다. 다중 파라메트릭 측정 시스템을 사용하여 배경 신호를 감지하고 세포 영역 내의 신호를 수정하려면 현미경 욕조에 염료가 없는 세포를 장착하고 세포가 3분 동안 정착할 수 있도록 합니다.NADH 칼슘이 없는 용액을 분당 2~3밀리리터로 약 5분 동안 욕조에 넣고 표적 세포를 커버하기 위해 물체 필드를 설정합니다. 셀을 필드 밖으로 이동한 후 셀이 없는 창의 배경 신호를 측정하고 신호를 오프셋으로 설정합니다. 그런 다음 셀을 초기 위치로 되돌리고 셀 배경 신호 및 셀 영역을 측정합니다.R-factor를 계산하기 위해 획득 한 세포 배경 및 영역 신호를 사용하여 염료가없는 세포를 현미경에 재장착하고 칼슘이없는 용액을 주입합니다. malate 용액으로 세포 현탁액을 교화하기 전에 표시된 신호를 측정합니다. 신호를 측정한 후 피루바테 용액으로 세포를 풍부하게 한 다음, malate-pyruvate 용액 및 로테네용액을 풍부하게 합니다.그런 다음 각 신호에 대한 경사를 계산합니다. 여기에 교정 전후의 미토콘드리아 칼슘의 변화가 나타난다. 그 결과 1.03플러스 또는 마이너스 0.13 마이크로몰라 및 최대 미토콘드리아 칼슘 이없는 미토콘드리아 휴식 칼슘 농도를 가진 미토콘드리아 칼슘의 상당한 변화를 명확하게 밝혀 29.6 플러스 또는 마이너스 1.61 마이크로몰라의 한 마이크로몰라에서 최대 미토콘드리아 칼슘.미토콘드리아 막 전위는 2나노몰라 TMRE의 풍부와 함께 모니터링되었다. 미토콘드리아 전위의 변화는 마이너스 150 밀리볼트의 초기 미토콘드리아 막 전위력을 기준으로 계산되었으며, 칼슘 첨가에 대한 반응으로 NADH의 감소를 입증하고 미토콘드리아 막 잠재력에 대한 무시할 만한 효과를 보였다. 미토콘디랄 pH는 카박스SNARF-1 하중에 의해 유도된 미토콘드리아 칼슘의 증가에 의해 영향을 받지 않았다.잘못된 등약 점수로 인해 잘못된 R 및 NADH 보정이 발생합니다. 따라서 항상 세포가 없는 배경 과 셀 영역을 올바르게 측정하십시오. 이 기술은 생체 분석 유출에 있는 미토콘드리아 칼슘 동적 연구 결과를 준비하는 데 사용됩니다.

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing : 정확한 Genotyping을위한 간단한 방법

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

연구

생물학

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

ECIS / 택시와 셀룰러 Chemotaxis 측정

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

세포 내 칼슘 측정<sup&gt; 2 +</sup개의 기술하여 인간 정자에서&gt; 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...