Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av Basic Science Research program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av utdanningsdepartementet (2018R1A6A3A01011832), av vitenskapsdepartementet, IKT & Future Planning (NRF-2016M3C1A6936606) og av departementet for handel, industri & energi (10068076).

Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av den lokale institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen.
1. forberedelse av løsningen
<ol><li>Forbered én fersk isolert CARDIAC myocytter11. Merk: hvert laboratorium kan ha en annen celle lagringsløsning. Her lagres myocytter i kultur medium (DMEM).</li>
	<li>Klargjør 100 mL av ca2 +-gratis løsning (tabell 1).</li>
	<li>Forbered 50 mL kultur medium i et 50 mL beger. Alikvot 5 mL og leg...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2++under+various+conditions.">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li><li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium.">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li><li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues.">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li><li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals.">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

Metoden for korrigering av interferens ble vellykket utviklet for å måle signalene fra NADH-og fura-2-analogs. Eksakt måling av signalene er avgjørende for nøyaktig korreksjon. Imidlertid produserer den iboende natur fluorescerende enheten en bakgrunn signal som ikke er relatert til at av NADH av fura-2. Den høyeste kvalitet band-pass filter kan bare passere opp til 10− 8 av de uønskede bølgelengder av lyset. Imidlertid er det fluorescerende signalet fra en enkelt celle svært liten, og refleksjon av...

Den viktige rollen intracellulære ca2 + er viden kjent1. Kvantifisering av [ca2 +] er avgjørende for å forstå prosessene i cellulære fysiologiske funksjoner. Fura-2 analogs er ganske nyttige fordi de er glade i UV-serien (< 400 nm), og ratiometrisk metoden kan anvendes for den kvantitative målingen. Derfor kan andre fysiologiske parametre som pH, membran potensial, etc., måles med andre fluorescerende fargestoffer. Mitokondrie ca2 + konsentrasjon ([ca2 +]m) range ble angivelig 0.08 − 20 μM2,3,4,5. Blant fura-2 analogs er fura-2-FF egnet for å måle dette spekteret av [ca2 +]. Imidlertid, det bo celler beklageligvis inneholde NADH/NADPH for deres metabolic prosesser, og NADH utvikler signal innblanding med hensyn til det overlappe eksitasjon og utstråling Spectra med det fura-2 analog. Denne forstyrrelsen i stor grad begrenser bruken av fura-2 analogs. Spesielt hvis analog brukes til å måle mitokondrie [ca2 +], er denne forstyrrelsen den største hindringen fordi det høyeste beløpet av NADH er i mitokondrier. Dette er ytterligere komplisert av NADH endringer som er relatert til mitokondrie membran potensialet (Ψm) og endring av Ψm påvirker [ca2 +]m6,7,8 , 9. videre, for å studere [ca2 +]m dynamikk, er det viktig å vite status for andre mitokondrie parametre, slik som NADH, Ψm, og pH.
Utslippene på 450 nm og 500 NM med excitations på 353 NM, 361 NM, og 400 nm inneholde signaler fra NADH og fura-2-FF, og likninger er som følger. Heri, 353 NM og 361 NM er isosbestic punkter fura-2-FF for utslipp på 450 nm og ved 500 NM, henholdsvis.
F361 450 = f361450, NADH + f361450, fura ligning 1 F353 500 = f353500, NADH + f353500, fura ligning 2 F400 500 = f400500, NADH + f400500, fura ligning 3
der Fx, y er den målte utslipps intensiteten på y-NM ved x-NM eksitasjon, Fx, y, NADH representerer den rene NADH-avhengige utslipps intensiteten, og fx, y, fura representerer den rene fura-2-FF-avhengige utslipps intensiteten. Under samme konsentrasjon av fluorescerende fargestoff, en viss eksitasjon intensitet bør produsere samme utslipps intensitet. Derfor bør utslipps intensitet forholdet mellom to forskjellige eksitasjon bølgelengder være konstant. Ca2 + og fura-2 påvirket ikke NADH fluorescens egenskaper; Derfor var forholdet mellom utslippene ved 450 nm og ved 500 NM for NADH konstant ved enhver eksitasjon bølgelengde. Den samme regelen kan brukes for fura-2-FF basert på antagelsen om at NADH eller [ca2 +] ikke påvirker utslipp og eksitasjon Spectra av fura-2-FF. Men ca2 + forårsaket en Spectral forskyvning av fura-2-FF utslipp. Derfor, for å fjerne effekten av ca2 +, isosbestic eksitasjon, som er uavhengig av ca2 +, må brukes. Hvert utslipps bølgelengde (dvs. 450 nm og 500 NM) har et annet isosbestic punkt, og fra vårt eksperimentelle oppsett, 353 NM ved 500 NM og 361 NM på 450 nm ble valgt. Fra disse er følgende ligninger gyldige10.
Rf = f361450, fura/F353500, fura ligning 4 RN1 = F400500, NADH/F361450, NADH ligning 5 RN2 = F353500, NADH/F361450, NADH ligning 6
Med disse konstantene er følgende ligninger fra (formel 1) (formel 2) og (formel 3) gyldige.
F361 450 = f361450, NADH + Rf × f353500, fura ligning 7 F353 450 = RN2 × F361450, NADH + F353500, fura ligning 8 F400 500 = RN1 × F361450, NADH + F400500, fura ligning 9
Fra disse ligninger, hvis Rf, rN1, og RN2 er kjent, rene signaler av NADH og fura-2 kan fås som følger.
F361450, NADH = (F361 450 -rf × f353 500)/(1 − rf × rN2) ligning 10 F353500, fura = (rN2 × F361 450 − f353 500)/(rF × rN2 − 1) ligning 11 F-400500, fura = f400 500 − RN1 × F-361450, NADH ligning 12 Rfura = F353500, fura/F400500, fura ligning 13
Ca2 +-bundet form av fura-2-FF var praktisk talt ikke-fluorescerende på 400 nm eksitasjon bølgelengde. Basert på denne egenskapen kan følgende nye kalibrerings ligning utledes.
[Ca2 +] = Kd ∙ (F400500, maks/f353500, maks.) × (rfura − rmin) ligning 14
der Kd er en dissosiasjon konstant, f400500, Max og F353500, Max er de maksimale verdiene av de slippes signalene på 500 NM med excitations på 400 nm og 353 NM, henholdsvis, og Rmin er minimum rfura i ca2 +-fri tilstand. Siden isosbestic excitations ble brukt, kan ligningen forenkles videre som følger.
[Ca2 +] = Kd ∙ (1/Rmin) ∙ (rfura − rmin) ligning 15
Derfor kreves bare Kd -og Rmin -verdier for å beregne [ca2 +].

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

For å måle [ca2 +] kvantitativt, fura-2 analogs, som er ratiometrisk fluoroprobes, brukes ofte. Imidlertid er Dye behandling egentlig begrenset i levende celler på grunn av autofluorescence interferens, hovedsakelig fra nikotinamid adenine dinucleotide (NADH). Mer spesifikt, er dette en stor hindring ved måling av mitokondrie [ca2 +] kvantitativt bruker fura-2 analogs fordi FLERTALLET av NADH er i mitokondrier. Hvis den fluorescerende farge konsentrasjonen er den samme, bør en viss eksitasjon intensitet produsere samme utslipps intensitet. Derfor bør utslipps intensitet forholdet mellom to forskjellige eksitasjon bølgelengder være konstant. Basert på dette prinsippet, en roman online korreksjon metode for NADH signal interferens å måle [ca2 +] ble utviklet, og den virkelige signal INTENSITETEN av NADH og fura-2 kan fås. Videre ble en roman ligning for å kalkulere [ca2 +] utviklet med isosbestic eksitasjon eller eksitasjon ved 400 nm. Med denne metoden kan endringer i mitokondrie [ca2 +] måles. I tillegg, med et annet sett av eksitasjon og utslipps bølgelengder, flere parametre, inkludert NADH, [ca2 +], og pH eller mitokondrie membran potensial (Ψm), kan måles samtidig. Mitokondrie [ca2 +] og Ψm eller pH ble målt ved hjelp av FURA-2-FF og TETRAMETHYLRHODAMINE etanol Ester (TMRE) eller carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-snarf-1).

Mitokondrie ca2 + endringer på grunn av korreksjon10 Figur 4 viser endringene i [ca2 +]m før og etter rettelsen. Resultatene viste tydelig de vesentlige endringene i [ca2 +]m. Mitokondrie hvile kalsium konsentrasjon uten cytosolic ca2 + ([ca2 +]c) var 1,03 ± 0,13 μM (gjennomsnitt ± S.E., n = 32), og den maksimale [ca2 +]m ved 1-μM [ca2 +]c va...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

På grunn av en Spectral som overlapper eksitasjon-og utslipps bølgelengdene til NADH-og fura-2-analogs, er signalforstyrrelser fra begge kjemikaliene i levende celler uunngåelig under kvantitativ måling av [ca2 +]. Således, en roman online rettelsen metoden av NADH signal innblanding å mål [ca2 +] var bebygget.

A Novel nikotinamid adenine Dinucleotide korreksjon metode for intracellulære ca2 + måling med fura-2-analog i live Cells

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

UV spennende flertall sonder, har en iboende signalforurensning, på grunn av auto-flertall lyder. Det meste av problemet med NADH, begrenser bruken av en flertallssonde. En metode kan brukes, for å nøyaktig korrigere den ytre florescence fra NADH, for å trekke ut et ekte, uforurenset flertallssondesignal.Å demonstrere prosedyren vil være Jeong Hoon Lee, vår vitenskapelige assisterende professor fra laboratoriet mitt. Etter å ha tillatt myocytter å bosette seg til bunnen av røret, aspirere det overnaturlige. Merk cellene med to milliliter nylaget en millimolar fura-2-FFAM fortynningsløsning i 60 minutter ved fire grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, plasser røret i et 37 graders Celsius vannbad i 30 minutter i oppreist stilling før du fjerner det overnaturlige. Deretter legger du til fire milliliter romtemperaturkulturmedium for lagring ved romtemperatur. For in situ isobestic fura-2-ffa punkt identifikasjon montere de fortynnede cellene på mikroskopet scenen og vente tre minutter for cellene å synke til bunnen.Rikelig NADH-fri 37 grader Celsius kalsiumfri løsning inn i cellekulturen og finn en målcelle. Rikelig saponinløsning i 60 sekunder før den gjenbruke med NADH-fri kalsiumfri oppløsning. Mål samtidig fura-2-ff-utslippssignalene ved 450 og 500 nanometer, ved hjelp av en eksitasjonsskanning fra 350 til 365 nanometer med et 0,1 nanometer trinn og re-rikelig med NADH-fri kalsiumfri løsning.Trekk deretter signalene i kalsiummettet oppløsning fra signalene i kalsiumfrie forhold. Beregn deretter standardavvikene for utslippet ved hver eksitasjon og velg eksitasjonsbølgelengden som viser minimumsstandardavviksverdiene som individuelle isobestiske punkter. Hvis du vil bruke et multiparametrisk målesystem til å oppdage bakgrunnssignalet og korrigere signalet i celleområdet, monterer du fargestofffrie celler i mikroskopbadet og lar cellene bosette seg i tre minutter.Rikelig NADH kalsiumfri løsning i badekaret i omtrent fem minutter med en to til tre milliliter per minutt hastighet og sette objektfeltet for å dekke den målrettede cellen. Når du har flyttet cellen ut av feltet, måler du bakgrunnssignalene i det cellefrie vinduet og angir signalene som forskyvninger. Deretter returnerer du cellen til startposisjonen og måler cellebakgrunnssignalene og celleområdet.For å beregne R-faktor bruk de oppkjøpte cellebakgrunn og områdesignaler før du monterer de fargefrie cellene på mikroskopet og profusing med kalsiumfri løsning. Mål signalene som angitt før du profuserer cellefjæringen med malateløsning. Etter å ha målt signalene rikelig cellene med pyruvat løsning etterfulgt av overflod med malate-pyruvat løsning og rotenone løsning.Beregn deretter skråningen for hvert signal. Her vises endringene i mitokondriekalsium før og etter korreksjonen. Resultatene viser tydelig betydelige endringer i mitokondriekalsium med mitokondrieavsnavsnæring av kalsiumkonsentrasjon uten cytosolisk kalsium på 1,03 pluss eller minus 0,13 mikromos og maksimalt mitokondriekalsium ved ett mikrorør kalsium på 29,6 pluss eller minus 1,61 mikromos.Mitokondrietransmembranepotensialet ble overvåket med en overflod av to nanomolars TMRE. Endringen i mitokondriepotensialet ble beregnet basert på et antatt innledende mitokondriemembranpotensial på minus 150 millivolt, noe som viste en reduksjon i NADH som respons på kalsiumtillegg, med en ubetydelig effekt på mitokondriemembranpotensialet. MitokondriepH ble ikke påvirket av økningen i mitokondriekalsium indusert av karboksy SNARF-1-lasting.Feil isobestiske punkter resulterer i feil R- og NADH-korreksjon. Så vær forsiktig med å alltid måle cellefri bakgrunn og celleområde på riktig måte. Denne teknikken brukes til å forberede mitokondrie kalsium dynamiske studier i bioanalytiske utslipp.

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Måling av Cellular chemotaxis med ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Måling Intracellulær Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Endring i Menneskelig Sperm bruker Fire Teknikker: Konvensjonell fluorometri, Stoppet Flow fluorometri, flowcytometrisystemer og Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Metode for den embryonale mus Hjerte

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

En metode for mus bukspyttkjertelens Isolering og Intracellulær cAMP Bestemmelse

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intramikros for Imaging subcellulære strukturer i levende mus Uttrykke Fluorescent Proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Gransker Protein-protein interaksjoner i levende celler ved hjelp Bioluminesens Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Lokal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i dyrkede pattedyrceller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

To-foton avbildning av intracellulær Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Håndtering og nitrogenoksid produksjon i endotel og glatte muskelceller av en isolert Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Påvisning av Intracellulær Gene Expression i levende celler av Muse, Human og svinekjøtt Origin med fluoresens-merket Nanopartikler

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...