Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования (2018R1A6A3A011832), Министерством науки, ИКТ и будущего планирования (NRF-2016M3C1A6936606) и Министерством торговли, промышленности и энергетики (10068076).

Все экспериментальные протоколы были одобрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и использованию.
1. Подготовка решения
<ol><li>Подготовка одного свежеизолированных сердечных миоцитов11. ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лаборатория может иметь др?...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2++under+various+conditions.">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li><li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium.">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li><li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues.">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li><li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals.">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

Метод коррекции помех был успешно разработан для измерения сигналов аналогов NADH и fura-2. Точное измерение сигналов имеет важное значение для точной коррекции. Тем не менее, присущий характер флуоресцентного устройства производит фоновый сигнал, не связанный с NADH фура-2. Фильтр с высоким ?...

Значительная роль внутриклеточного Ca2 "широко известен1. Количественная оценка «Ca2»необходима для понимания процессов клеточных физиологических функций. Аналоги Fura-2 весьма полезны, потому что они возбуждаются в УФ-диапазоне (Злт;400 нм), а коэффициентеметрический метод может быть применен для количественного измерения. Таким образом, другие физиологические параметры, такие как рН, мембранный потенциал и т.д., могут быть измерены с другими флуоресцентными красителями. Митохондриальная концентрация Ca2 "("Ca 2"м) диапазон, как сообщается, 0,08 х 20 мкм2,3,4,5. Среди аналогов fura-2, fura-2-FF подходит для измерения этого диапазона «Ca2». Тем не менее, живые клетки, к сожалению, содержат NADH/NADPH для их метаболических процессов, а NADH генерирует сигнальные помехи из-за перекрывающихся возбужденийных и эмиссионных спектров с аналогом fura-2. Это вмешательство значительно ограничивает использование аналогов fura-2. В частности, если аналог применяется для измерения митохондриальных «Ca2»,это вмешательство является самым большим препятствием, потому что наибольшее количество NADH находится в митохондриях. Это еще больше осложняется изменениями NADH, связанными с митохондриальным мембрановым потенциалом(м)и изменением м влияетна «Ca2»m6,7,8 , 9. Кроме того, для изучения динамики «Ca2»m, важно знать состояние других митохондриальных параметров, таких как NADH,м ,и рН.
Выбросы на уровне 450 нм и 500 нм с возбуждением на уровне 353 нм, 361 нм и 400 нм содержат сигналы от NADH и fura-2-FF, и уравнения следующие. При этом 353 нм и 361 нм являются изосбестовыми точками фурас-2-ФЗ для выбросов на уровне 450 нм и 500 нм соответственно.
F361,450 - F361,450,NADH - F361,450,Fura Equation 1 F353,500 - F353,500,NADH - F353,500,Fura Equation 2 F400,500 - F400,500,NADH - F400,500,Fura Equation 3
где Fx,y является измеренной интенсивностью выбросов на y-nm по x-nm возбуждение, Fх,y, NADH представляет собой чистую NADH-зависимую интенсивность выбросов, и Fx,y,Fura представляет собой чистую интенсивность выбросов фура-2-FF. При той же концентрации флуоресцентного красителя определенная интенсивность возбуждения должна производить такую же интенсивность выбросов. Таким образом, коэффициент интенсивности выбросов двух различных длин волн возбуждения должен быть постоянным. Ca2 и fura-2 не повлияли на характеристики флуоресценции NADH; таким образом, соотношение выбросов на 450 нм и на 500 нм NADH было постоянным на любой волне возбуждения. То же правило может быть использовано для fura-2-FF на основе предположения, что NADH или «Ca2»не влияет на спектры выбросов и возбуждения фурас-2-FF. Тем не менее, Ca2 "вызвало спектральный сдвиг фура-2-FF выбросов. Таким образом, чтобы удалить эффект Ca2 ",изосбестическое возбуждение, которое не зависит от Ca2 ", необходимо использовать. Каждая длина волны эмиссии (т.е. 450 нм и 500 нм) имеет различную изосбестную точку, и из нашей экспериментальной установки было выбрано 353 нм при 500 Нм и 361 нм при 450 Нм. Из них, следующие уравнения действительны10.
Rf - F361,450,Fura/F353,500,Fura Equation 4 RN1 - F400,500,NADH/F361,450,NADH Уравнение 5 RN2 - F353,500,NADH/F361,450,NADH Уравнение 6
С этими константами, следующие уравнения из (Equation 1) (Equation 2), и (Equation 3) действительны.
F361,450 - F361,450,NADH - Rf f353,500,Fura Equation 7 F353,450 - RN2 - F361,450,NADH -F 353,500,Fura Equation 8 F400,500 - RN1 - F361,450,NADH -F 400,500,Fura Equation 9
Из этих уравнений, если Rf,RN1и RN2 известны, чистые сигналы NADH и fura-2 могут быть получены следующим образом.
F361,450,NADH (F361,450 - Rf f353,500)/(1 - Rf и RN2) Уравнение 10 F353,500,Fura (RN2 и F361,450 ) F353,500)/(Rf и RN2 - 1) Уравнение 11 F400,500,Fura - F400,500 - RN1 - F361,450,NADH Equation 12 RФура - F353,500,Fura/F400,500,Fura Equation 13
Форма привязкиКП -2к фура-2-FF была практически нефлуоресцентной на длине волны возбуждения 400 нм. На основе этого свойства можно получить следующее новое уравнение калибровки.
"Ca2"-К-д ( F400,500,max/F353,500,max) 
где Kd является постоянной диссоциации, F400,500,max и F353,500, макс являются максимальными значениями излучаемых сигналов на 500 нм с возбуждениями на 400 нм и 353 нм, соответственно, и Rмин является минимальным RFura в Ca2 -бесплатное состояние. В виду того что isosbestic excitations были использованы, уровнение можно упростить более далее следующим образом.
"Ca2"-К д . (1 / Rмин)
Таким образом, для расчета значения K d иRmin необходимы только значения Kd и R.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

Для количественного измерения «Ca2»часто используются аналоги фура-2, которые являются социеметрическими флюорозондами. Тем не менее, использование красителя внутренне ограничено в живых клетках из-за аутофлуоресценции вмешательства, в основном от никотинамида аденин динуклеотид (NADH). Более конкретно, это является основным препятствием при измерении митохондриальных «Ca2»- количественно с помощью аналогов fura-2, потому что большинство NADH находится в митохондриях. Если концентрация флуоресцентного красителя одинакова, определенная интенсивность возбуждения должна производить такую же интенсивность выбросов. Таким образом, коэффициент интенсивности выбросов двух различных длин волн возбуждения должен быть постоянным. На основе этого принципа был разработан новый онлайн-метод коррекции помех сигнала NADH для измерения «Ca2»,и можно получить реальную интенсивность сигнала NADH и fura-2. Кроме того, было разработано новое уравнение для расчета «Ca2»с изосбестическим возбуждением или возбуждением на уровне 400 нм. С помощью этого метода можно было бы успешно измерить изменения в митохондриальной «Ca2». Кроме того, с различным набором возбуждения и длины волн выбросов, несколько параметров, в том числе NADH, "Ca2"и рН или митохондриальной мембраны потенциал(м)), может быть одновременно измерены. Митохондриальные «Ca2»им или рН были измерены с помощью фура-2-FF и тетраметилходамин этилэтил-эстер (TMRE) или carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (карбокси-SNARF-1).

Митохондриальный Ca2 "изменения из-за коррекции10 На рисунке 4 показаны изменения в «Ca2»м до и после коррекции. Результаты ясно показали существенные изменения в «Ca2»м. Концентрация кальция в митохондрии без цитосолика Ca2 (Ca ...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Из-за спектрального перекрытия возбуждения и длины волн выбросов аналогов NADH и fura-2, сигнальные помехи от обоих химических веществ в живых клетках неизбежны во время количественного измерения «Ca2». Таким образом, был разработан новый онлайн-метод коррекции помех сигнала NADH для измерения «Ca2».

Роман Никотинамид Аденин Динуклеотид Метод коррекции для внутриклеточного Измерения Ca2 "с Fura-2-Analog в живых клетках

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

УФ возбудимые множественные зонды, имеют присущее сигнальное загрязнение, из-за автоматического множественного числа звуков. Большая часть проблемы с NADH, ограничивает использование множественного числа зонда. Метод может быть использован, чтобы точно исправить внешнюю флуоресценцию от NADH, для того, чтобы извлечь истинный, незагрязненый сигнал множественного числа зонда.Демонстрацией процедуры будет Чон Хун Ли, наш доцент из моей лаборатории. После того, как миоциты оседают на дне трубки, аспирируют супернатант. Этикетка клеток с двумя миллилитров свежеприготовленных один миллимолярный фура-2-FFAM разбавления раствора в течение 60 минут при четырех градусах по Цельсию.В конце инкубации поместите трубку в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 30 минут в вертикальном положении, прежде чем удалить супернатант. Затем добавьте четыре миллилитров среды культуры комнатной температуры для хранения при комнатной температуре. Ибо на месте isobestic фура-2-ffa точки идентификации горе разбавленных клеток на стадии микроскопа и ждать три минуты для клеток, чтобы опуститься на дно.Профанный NADH-бесплатный 37 градусов по Цельсию без кальция раствор в клеточной культуре и найти целевую клетку. Профанный раствор сапонина в течение 60 секунд, прежде чем повторно профанать с NADH-бесплатный раствор без кальция. Одновременно измеряйте сигналы фуры-2-ff на 450 и 500 нанометров, используя возбудительный скан от 350 до 365 нанометров с шагом 0,1 нанометров и повторно обитая с раствором без кальция NADH.Далее вычесть сигналы в растворе кальция насыщенных от сигналов в условиях, свободных от кальция. Затем вычислите стандартные отклонения излучения при каждом возбуждении и выберите длину волны возбуждения, показывающую минимальные стандартные значения отклонения в качестве отдельных точек изобестики. Чтобы использовать многопамарометрическую систему измерения для обнаружения фонового сигнала и коррекции сигнала в области клетки, монтировать клетки без красителя в ванне микроскопа и позволить клеткам осесть в течение трех минут.Профанный раствор NADH без кальция в ванну в течение примерно пяти минут со скоростью от двух до трех миллилитров в минуту и установить объект поле для покрытия целевой клетки. После перемещения ячейки из поля измеряют фоновые сигналы свободного от ячейки окна и устанавливают сигналы в качестве смещений. Затем верните ячейку в исходное положение и измерьте фоновые сигналы клетки и область клетки.Для расчета R-фактора используйте приобретенные клеточные фоновые и областные сигналы перед перемонтированием клеток, свободных от красителей, на микроскоп и изобилием раствором без кальция. Измерьте сигналы, как указано, прежде чем обитать клеточной подвески с раствором малата. После измерения сигналов обильно клетки с пируватным раствором следуют изобилие с раствором малат-пируват и раствором ротенона.Затем вычислите наклон для каждого сигнала. Здесь показаны изменения митохондриального кальция до и после коррекции. Результаты ясно показывают существенные изменения в митохондриальном кальции с митохондриальной концентрацией кальция отдыха без цитозолового кальция 1.03 плюс или минус 0.13 микромолара и максимального митохондриального кальция на одном микромоле кальция 29.6 плюс или минус 1.61 микромолара.Митохондриальный трансмембранный потенциал отслеживался с использованием двух наномоларов TMRE. Изменение митохондриального потенциала было рассчитано на основе предполагаемого первоначального митохондриального мембранного потенциала в минус 150 милливольт, демонстрируя снижение NADH в ответ на добавление кальция, с неопоясным воздействием на митохондриальный мембранный потенциал. Митохондиральный рН не был вызван увеличением митохондриального кальция, вызванного нагрузкой carboxy SNARF-1.Неправильные изобетические точки приводят к неправильной коррекции R и NADH. Так что позаботьтесь, чтобы всегда правильно измерить безклеточный фон и область клетки. Этот метод используется для подготовленных митохондриальных динамических исследований кальция в биоаналитических разливов.

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Пиросеквенирования: Простой метод для точного генотипирования

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Измерения клеточных Хемотаксис с ECIS / Такси

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Измерение внутриклеточного Са<sup&gt; 2 +</sup&gt; Изменения в человеческой спермы с помощью четырех методов: Обычные флуорометрии, остановленной струи флуорометрии, проточной цитометрии и односпальная изображений Сотовые

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Роман<em&gt; Экс естественных</em&gt; Культура Метод эмбриональном сердце мыши

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Метод мышь панкреатических островков изоляции и внутриклеточного цАМФ определения

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Прижизненные микроскопия для визуализации субклеточных структур в живых мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках с помощью биолюминесценции резонансный перенос энергии

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Изображений Локальный ЦС<sup&gt; 2+</sup&gt; Сигналы в культуре клетках млекопитающих

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Двухфотонное изображений внутриклеточного Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Погрузочно-разгрузочные работы и оксид азота производства в эндотелиальных и гладкомышечных клеток изолированной аорты крыс

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Обнаружение внутриклеточных экспрессии генов в живых клетках мышиных, человеческого и свиного происхождения с помощью флуоресцентной меченных наночастиц

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...