Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av grundforskning forsknings program genom National Research Foundation i Korea (NRF) som finansieras av undervisningsministeriet (2018R1A6A3A01011832), av ministeriet för vetenskap, IKT & framtida planering (NRF-2016M3C1A6936606) och handelsministeriet, industri & energi (10068076).

Alla experimentella protokoll godkändes av den lokala institutionella djurvårds-och användnings kommittén.
1. beredning av lösningen
<ol><li>Förbered enstaka nyligen isolerade hjärt myocyter11. Varje laboratorium kan ha en annan cell lagringslösning. Här, den myocyter lagras i kultur medium (DMEM).</li>
	<li>Bered 100 mL ca2 +-fri lösning (tabell 1).</li>
	<li>Förbered 50 mL odlingssubstrat i en 50 mL-bägare. Alikvot 5 mL och...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2++under+various+conditions.">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li><li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium.">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li><li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues.">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li><li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals.">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

Störnings korrigerings metoden utvecklades framgångsrikt för att mäta signalerna från NADH och fura-2 analoger. Exakt mätning av signalerna är avgörande för exakt korrektion. Den inneboende karaktären hos den fluorescerande anordningen ger emellertid en bakgrunds signal som inte har något samband med NADH för fura-2. Det högsta kvalitets bandet-pass filtret kan bara passera upp till 10− 8 av ljusets oönskade våglängder. Men den fluorescerande signalen från en enda cell är mycket liten, och ...

Den betydande roll intracellulära ca2 + är vida känd1. Kvantifieringen av [ca2 +] är nödvändig för att förstå de cellulära fysiologiska funktionernas processer. Fura-2 analoger är ganska användbara eftersom de är upphetsad i UV-området (< 400 nm), och den ratiometriska metoden kan tillämpas för den kvantitativa mätningen. Därför kan andra fysiologiska parametrar såsom pH, membran potential, etc., mätas med andra fluorescerande färgämnen. Den mitokondriella ca2 + koncentrationen ([ca2 +]m) var enligt uppgift 0,08 − 20 μm2,3,4,5. Bland fura-2 analoger är fura-2-FF lämplig för att mäta detta intervall på [ca2 +]. Men levande celler innehåller tyvärr NADH/NADPH för sina metaboliska processer, och NADH genererar signalinterferens på grund av överlappande excitation och emission spektra med fura-2 Analog. Denna störning begränsar kraftigt användningen av fura-2 analoger. Specifikt, om analog används för att mäta mitokondriell [ca2 +], denna störning är det största hindret eftersom det högsta beloppet av NADH är i Mitochondria. Detta kompliceras ytterligare av NADH förändringar är relaterade till mitokondriella membranet potential (Ψm) och förändringen av Ψm påverkar [ca2 +]m6,7,8 , 9. för att studera [ca2 +]m dynamik är det dessutom viktigt att känna till status för andra MITOKONDRIELLA parametrar, såsom NADH, Ψmoch pH.
Utsläppen vid 450 nm och 500 Nm med exciteringar vid 353 nm, 361 nm och 400 nm innehåller signalerna från NADH och fura-2-FF, och ekvationerna är som följer. Häri, 353 nm och 361 Nm är de isosbestic punkterna i fura-2-FF för utsläpp vid 450 nm och vid 500 Nm, respektive.
F361 450 = f361450, NADH + f361450, fura ekvation 1 F353 500 = f353500, NADH + f353500, fura ekvation 2 F400 500 = f400500, NADH + f400500, fura ekvation 3
där Fx, y är den uppmätta utsläppsintensiteten vid y-nm genom x-nm excitation, fx, y, utgör NADH den rena NADH-beroende emissions intensiteten, och fx, y, fura representerar den rena fura-2-FF-beroende utsläppsintensiteten. Under samma koncentration av det fluorescerande färgämnet bör en viss exciteringsintensitet ge samma utsläppsintensitet. Därför bör förhållandet mellan utsläppsintensiteten för två olika magnetisering våglängder vara konstant. Ca2 + och fura-2 påverkade inte NADH-fluorescensegenskaper; Därför var förhållandet av utsläppet på 450 nm och på 500 Nm av NADH konstant på någon magnetisering våglängd. Samma regel kan användas för fura-2-FF baserat på antagandet att NADH eller [ca2 +] inte påverkar emissions-och exciteringspektrat av fura-2-FF. Ca2 + orsakade dock en spektralförskjutning av fura-2-FF-utsläppet. Därför, för att ta bort effekten av ca2 +, isosbestic excitation, som är oberoende av ca2 +, måste användas. Varje emissionsvåglängd (dvs. 450 nm och 500 Nm) har en annan isosbestic punkt, och från vår experimentella inställning, 353 Nm vid 500 Nm och 361 Nm vid 450 nm valdes. Av dessa är följande ekvationer giltiga10.
Rf = f361450, fura/F353500, fura ekvation 4 RN1 = F400500, NADH/F361450, NADH ekvation 5 RN2 = F353500, NADH/F361450, NADH ekvation 6
Med dessa konstanter är följande ekvationer från (ekvation 1) (ekvation 2) och (ekvation 3) giltiga.
F361 450 = f361450, NADH + Rf × f353500, fura ekvation 7 F353 450 = RN2 × F361450, NADH + F353500, fura ekvation 8 F400 500 = RN1 × f361450, NADH + f400500, fura ekvation 9
Från dessa ekvationer, om Rf, rN1och rN2 är kända, kan rena signaler från NADH och fura-2 erhållas enligt följande.
F361450, NADH = (f361 450 -rf × f353 500)/(1 − rf × rN2) ekvation 10 F353500, fura = (rN2 × f361 450 − f353 500)/(rF × rN2 − 1) ekvation 11 F400500, fura = f400 500 − RN1 × f361450, NADH ekvation 12 Rfura = f353500, fura/F400500, fura ekvation 13
Ca2 +-bunden form av fura-2-FF var praktiskt taget icke-fluorescerande vid 400 nm excitation våglängd. Baserat på denna egenskap kan följande nya kalibrerings ekvation härledas.
[Ca2 +] = Kd ∙ (F400500, Max/f353500, Max) × (rfura − rmin) ekvation 14
där Kd är en dissociationskonstant, F400500, Max och F353500, Max är maximivärdena för de avgivna signalerna vid 500 Nm med Magnetiseringar värden vid 400 nm respektive 353 nm, och rmin är minsta rfura i ca2 +-gratis skick. Sedan isosbestic magnetiserna användes, kan ekvationen förenklas vidare som följer.
[Ca2 +] = Kd ∙ (1/Rmin) ∙ (rfura − rmin) ekvation 15
Därför krävs endast Kd och Rminvärden för att beräkna [ca2 +].

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

För att mäta [ca2 +] kvantitativt används ofta fura-2-analoger, som är ratiometriska fluorosonder. Emellertid, Dye användning är i sin tur begränsad i levande celler på grund av autofluorescence inblandning, främst från nikotinamid adenin--dinukleotid (NADH). Mer specifikt, detta är ett stort hinder vid mätning av mitokondrien [ca2 +] kvantitativt med hjälp av fura-2 analoger eftersom majoriteten av NADH är i Mitochondria. Om den fluorescerande färg koncentrationen är densamma, bör en viss exciteringsintensitet ge samma utsläppsintensitet. Därför bör förhållandet mellan utsläppsintensiteten för två olika magnetisering våglängder vara konstant. Baserat på denna princip, en roman online korrigering metod för NADH signalinterferens att mäta [ca2 +] utvecklades, och den verkliga signalintensiteten hos NADH och fura-2 kan erhållas. Vidare utvecklades en ny ekvation för att beräkna [ca2 +] med isosbestic excitation eller excitation vid 400 nm. Med den här metoden kan förändringar i mitokondrien [ca2 +] mätas framgångsrikt. Dessutom, med en annan uppsättning av excitation och utsläpp våglängder, flera parametrar, inklusive NADH, [ca2 +], och pH eller mitokondriell membran potential (Ψm), kunde mätas samtidigt. Mitokondrie [ca2 +] och Ψm eller pH mättes med fura-2-FF och tetrametylrodamin etylester (tmre) eller karboxy-seminaphtorhodafluor-1 (karboxy-snarf-1).

Mitokondriell ca2 + förändringar på grund av korrigering10 Figur 4 visar förändringarna i [ca2 +]m före och efter korrigeringen. Resultaten visade tydligt de väsentliga förändringarna i [ca2 +]m. Den mitokondriella vilande kalciumkoncentrationen utan cytosoliska ca2 + ([ca2 +]c) var 1,03 ± 0,13 μm (medelvärde ± e, n = 32), och den maximala [ca 2 +]m vid 1-?...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

På grund av den spektrala överlappningen av excitation och emissions våglängder av NADH och fura-2 analoger, är signalinterferensen från båda kemikalierna i levande celler oundviklig vid kvantitativ mätning av [ca2 +]. Således, en roman online korrigering metod för NADH signal störningar för att mäta [ca2 +] utvecklades.

En roman nikotinamid adenin-dinukleotid korrigering metod för intracellulära ca2 + mätning med fura-2-analog i levande celler

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

UV retbara pluralsonder, har en inneboende signal kontaminering, på grund av auto-plural ljud. De flesta av problemet med NADH, är att begränsa användningen av en plural sond. En metod kan användas, för att exakt korrigera den yttre florescence från NADH, för att extrahera en sann, oförorenad pluralsond signal.Demonstrerar proceduren blir Jeong Hoon Lee, vår forskarassistentprofessor från mitt laboratorium. Efter att myocyterna att bosätta sig till botten av röret, aspirera supernatanten. Märk cellerna med två milliliter nyberedda en millimolar fura-2-FFAM spädlösning i 60 minuter vid fyra grader Celsius.Vid slutet av inkubationen, placera röret i en 37 grader Celsius vattenbad i 30 minuter i upprätt läge innan du tar bort supernatanten. Tillsätt sedan fyra milliliter av rumstemperatur kultur medium för lagring vid rumstemperatur. För in situ isobstic fura-2-ffa punkt identifiering montera utspädda cellerna på mikroskopet scenen och vänta tre minuter för cellerna att sjunka till botten.Ymnig NADH-fri 37 grader Celsius kalciumfri lösning i cellkulturen och lokalisera en målcell. Ymnig saponinlösning i 60 sekunder innan den åter profusing med NADH-fria kalcium-fri lösning. Mät samtidigt de fura-2-ff som avges signaler på 450 och 500 nanometer, med hjälp av en excitationsskanning från 350 till 365 nanometer med ett 0,1 nanometersteg och åter ymnig med NADH-fri kalciumfri lösning.Nästa subtrahera signalerna i kalcium mättad lösning från signalerna i kalcium fria förhållanden. Beräkna sedan utsläppsnormavvikelserna vid varje excitation och välj den excitationsvåglängd som visar de lägsta standardavvikelsevärdena som individuella isobstiska punkter. För att använda ett multiparetetriskt mätsystem för att upptäcka bakgrundssignalen och för att korrigera signalen inom cellområdet monterar man färgämnesfria celler i mikroskopbadet och låter cellerna bosätta sig i tre minuter.Ymnig NADH kalciumfri lösning i badet i cirka fem minuter med två till tre milliliter per minut och ställ in objektfältet för att täcka den riktade cellen. Efter att ha flyttat cellen ut ur fältet mäta bakgrundssignaler av cell-fria fönstret och ställa in signalerna som förskjutningar. Sedan återgå cellen till den inledande positionen och mäta cellens bakgrundssignaler och cellområdet.För att beräkna R-faktorn använd den förvärvade cellens bakgrund och areasignaler innan de färgämnesfria cellerna monteras på mikroskopet igen och profusing med kalciumfri lösning. Mät signalerna som indikeras innan profusing cellen suspension med malat lösning. Efter mätning av signalerna ymnig cellerna med pyruvat lösning följt av profusion med malat-pyruvat lösning och rotenon lösning.Beräkna sedan lutningen för varje signal. Här visas förändringarna i mitokondriellt kalcium före och efter korrigeringen. Resultaten visar tydligt betydande förändringar i mitokondriellt kalcium med en mitokondriellt vilande kalciumkoncentration utan cytosoliskt kalcium på 1,03 plus eller minus 0,13 mikromolar och maximalt mitokondriellt kalcium vid en mikromolar av kalcium på 29,6 plus eller minus 1,61 mikromolar.Mitokondriellt transmembrane potentialen övervakades med ett överflöd av två nanomolars TMRE. Förändringen i mitokondriell potential beräknades baserat på en antagen initial mitokondriell membranpotential på minus 150 millivolt, vilket visar en minskning av NADH som svar på kalciumtillskott, med en negliable effekt på mitokondriell membranpotentialen. Mitokondiral pH var inte verkställt av ökningen av mitokondriellt kalcium som induceras av carboxy SNARF-1 lastning.Felaktiga isobstiska punkter resulterar i felaktig R- och NADH-korrigering. Så var noga med att alltid korrekt mäta cell-fri bakgrund och cell område. Denna teknik används för att förbereda mitokondriellt kalcium dynamiska studier i bioanalytiska spill.

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: En enkel metod för noggrann Genotypning

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Mätning av Cellular Kemotaxis med ECIS / Taxi

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Mätning intracellulär Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Förändringar i mänskliga spermier med fyra tekniker: Konventionell fluorometri Stoppad Flow fluorometri, flödescytometri och Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Metod för embryonala Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

En metod för mus bukspottkörtel Islet Isolering och intracellulär cAMP Fastställande

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Undersökning av protein-proteininteraktioner i levande celler med hjälp Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Lokala Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i odlade däggdjursceller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Två-foton Imaging av intracellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Hantering och kväveoxidproduktion i Endothelial och glatta muskelceller av en isolerad råttaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Detektion av intracellulära genuttryck i levande celler av Murine, Mänsklig och svin användning av fluorescens-märkta Nanopartiklar

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...