Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Bilim Bakanlığı, BİT ve Gelecek Planlaması (NRF-2016M3C1A6936606) tarafından Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) tarafından kısmen Temel Bilim Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. ve Ticaret, Sanayi ve Enerji Bakanlığı (10068076) tarafından.

Tüm deneysel protokoller yerel kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandı.
1. Çözüm hazırlama
<ol><li>Tek taze izole kardiyak miyosithazırlayın 11. NOT: Her laboratuvarda farklı bir hücre depolama çözümü olabilir. Burada miyositler kültür ortamında (DMEM) depolanır.</li>
	<li>100 mL Ca2+içermeyen çözelti hazırlayın (Tablo 1).</li>
	<li>50 mL'lik bir kabın içinde 50 mL kültür ortamı haz?...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2++under+various+conditions.">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li><li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium.">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li><li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues.">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li><li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals.">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

Girişim düzeltme yöntemi, NADH ve fura-2 analoglarının sinyallerini ölçmek için başarıyla geliştirilmiştir. Sinyallerin tam olarak ölçülmesi tam düzeltme için gereklidir. Ancak, floresan cihazın doğal doğası fura-2 NADH ile ilgisi olmayan bir arka plan sinyali üretir. En yüksek kalitede bant geçiş filtresi, ışığın istenmeyen dalga boylarının yalnızca 10-8'ini geçebilir. Ancak, tek bir hücreden gelen floresan sinyal çok küçüktür ve bant-pass filtresinden sonra uyarma ış...

Hücre içi Ca2+'nın önemli rolü yaygın olarak bilinmektedir1. [Ca2+] ölçülmesi hücresel fizyolojik fonksiyonların süreçlerini anlamak için gereklidir. Fura-2 analogları UV aralığında (<400 nm) heyecanlı oldukları ndan oldukça yararlıdır ve kantitatif ölçüm için oranmetrik yöntem uygulanabilir. Bu nedenle, pH, membran potansiyeli, vb gibi diğer fizyolojik parametreler, diğer floresan boyalar ile ölçülebilir. Mitokondriyal Ca2+ konsantrasyonu ([Ca2+]m) aralığı nın 0,08−20 μM2,3,4,5olduğu bildirildi. fura-2 analogları arasında fura-2-FF bu aralığı ölçmek için uygundur [Ca2+]. Ancak, canlı hücreler ne yazık ki metabolik süreçleri için NADH / NADPH içerir, ve NADH fura-2 analog ile örtüşen uyarma ve emisyon spektrumları nedeniyle sinyal girişim üretir. Bu girişim fura-2 analoglarının kullanımını büyük ölçüde sınırlar. Özellikle, analog mitokondriyal [Ca2 +] ölçmek için uygulanırsa, nadh en yüksek miktarda mitokondri olduğu için bu girişim en büyük engeldir. Bu durum, NADH değişikliklerinin mitokondriyal membran potansiyeli ile ilgili olması(M )veM m'nin değişmesi [Ca2+]m6,7,8 , 9- Ayrıca [Ca2+]m dinamiği nin incelenmesi için NADH, M m ve pH gibi diğer mitokondriyal parametrelerin durumunu bilmek esastır.
353 nm, 361 nm ve 400 nm'de uyarma ile 450 nm ve 500 nm'deki emisyonlar NADH ve fura-2-FF'den gelen sinyalleri içerir ve denklemler aşağıdaki gibidir. Burada, 353 nm ve 361 nm 450 nm ve 500 nm emisyonlar için fura-2-FF sozobestik noktaları, sırasıyla vardır.
F361.450 = F361.450,NADH + F361.450,Fura Denklemi 1 F353.500 = F353.500,NADH + F353.500,Fura Denklemi 2 F400.500 = F400.500,NADH + F400.500,Fura Denklemi 3
fx,y x-nm uyarma ile y-nm'de ölçülen emisyon yoğunluğu, Fx,y,NADH saf NADH bağımlı emisyon yoğunluğunu temsil eder ve Fx,y,Fura saf fura-2-FF bağımlı emisyon yoğunluğunu temsil eder. Floresan boya aynı konsantrasyon altında, belirli bir uyarma yoğunluğu aynı emisyon yoğunluğu üretmelidir. Bu nedenle, iki farklı uyarma dalga boylarının emisyon yoğunluğu oranı sabit olmalıdır. Ca2+ ve fura-2 NADH floresan özelliklerini etkilemedi; bu nedenle, 450 nm ve 500 nm NADH emisyon oranı herhangi bir uyarma dalga boyunda sabitti. Aynı kural, NADH veya [Ca2+] fura-2-FF'nin emisyon ve uyarma spektrumlarını etkilemediği varsayımına dayanarak fura-2-FF için de kullanılabilir. Ancak, Ca2+ fura-2-FF emisyonunun spektral kaymasına neden oldu. Bu nedenle, Ca2+etkisini ortadan kaldırmak için, Ca2+bağımsız olan isosbestik uyarma, kullanılması gerekir. Her emisyon dalga boyu (yani, 450 nm ve 500 nm) farklı bir izosbestik noktaya sahiptir ve deneysel kurulumumuzdan, 500 nm'de 353 nm ve 450 nm'de 361 nm seçilmiştir. Bunlardan, aşağıdaki denklemler geçerli10.
Rf = F361.450,Fura/F353.500,Fura Denklemi 4 RN1 = F400.500,NADH/F361.450,NADH Denklemi 5 RN2 = F353.500,NADH/F361.450,NADH Denklemi 6
Bu sabitlerde aşağıdaki denklemler (Denklem 1) (Denklem 2) ve (Denklem 3) geçerlidir.
F361.450 = F361.450,NADH + Rf × F353.500,Fura Denklemi 7 F353.450 = RN2 × F361.450,NADH + F353.500,Fura Denklemi 8 F400.500 = RN1 × F361.450,NADH + F400.500,Fura Denklemi 9
Bu denklemlerden, Rf,RN1ve RN2 biliniyorsa, NADH ve fura-2'nin saf sinyalleri aşağıdaki gibi elde edilebilir.
F361.450,NADH = (F361.450 - Rf × F353.500)/(1 − Rf × RN2) Denklemi 10 F353.500,Fura = (RN2 × F361.450 − F353.500)/(Rf × RN2 − 1) Denklemi 11 F400.500,Fura = F400.500 − RN1 × F361.450,NADH Denklemi 12 RFura = F353.500,Fura/F400.500,Fura Denklemi 13
Fura-2-FF'nin Ca2+bağlı formu 400 nm uyarma dalga boyunda neredeyse floresan değildi. Bu özelliğe dayanarak, aşağıdaki yeni kalibrasyon denklemi türetilebilir.
[Ca2+] = Kd ] (F400.500,max/F353.500,max) × (RFura − Rdk) Denklem 14
Kd bir ayrışma sabiti olduğu yerde, F400,500,max ve F353,500,max, 500 nm'de yayılan sinyallerin maksimum değerleridir ve sırasıyla 400 nm ve 353 nm'de uyarma ile Rmin Ca 2'deki minimum RFura'dır. +-serbest durum. İzosbestik uyarmalar kullanıldığından, denklem aşağıdaki gibi basitleştirilmiş olabilir.
[Ca2+] = Kd • (1 / Rdk) • (RFura − Rdk) Denklem i15
Bu nedenle, [Ca2+]'yi hesaplamak için yalnızca Kd ve Rmin değerleri gereklidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

[Ca2+] kantitatif olarak ölçmek için, oranmetrik floroprobolan fura-2 analogları sıklıkla kullanılır. Ancak, boya kullanımı doğal olarak canlı hücrelerde otofloresan girişim nedeniyle sınırlıdır, özellikle nikotinamid adenin dinükleotid (NADH). Daha spesifik olarak, nadh çoğunluğu mitokondri olduğu için kantitatif fura-2 analogları kullanarak mitokondriyal [Ca2 +] ölçerken bu önemli bir engeldir. Floresan boya konsantrasyonu aynı ise, belirli bir uyarma yoğunluğu aynı emisyon yoğunluğu nu üretmelidir. Bu nedenle, iki farklı uyarma dalga boylarının emisyon yoğunluğu oranı sabit olmalıdır. Bu ilkeye dayanarak, [Ca2+] ölçmek için NADH sinyal girişiminin yeni bir çevrimiçi düzeltme yöntemi geliştirilmiş ve NADH ve fura-2'nin gerçek sinyal yoğunluğu elde edilmiştir. Ayrıca, [Ca2+] hesaplamak için yeni bir denklem izosbestik uyarma veya uyarma ile geliştirilmiştir 400 nm. Bu yöntemle mitokondriyal [Ca2+] değişiklikleri başarıyla ölçülebilir. Buna ek olarak, uyarma ve emisyon dalga boylarının farklı bir kümesi ile, NADH, [Ca2+], ve pH veya mitokondriyal membran potansiyeli(M)dahil olmak üzere birden fazla parametre aynı anda ölçülebilir. Mitokondriyal [Ca2+] vem veya pH fura-2-FF ve tetrametetirodanin etil ester (TMRE) veya karboksi-seminaphtorhofluor-1 (karboksi-SNARF-1) kullanılarak ölçüldü.

Düzeltme ye bağlı Mitokondriyal Ca2+ değişiklikleri10 Şekil 4 düzeltmeden önce ve sonra [Ca2+]m'deki değişiklikleri gösterir. Sonuçlar açıkça [Ca2 +]mönemli değişiklikler gösterdi. Sitosolik Ca2+ olmadan mitokondriyal istirahat kalsiyum konsantrasyonu ([Ca2+]c)1,03 ± 0,13 μM (ortalama ± S.E., n = 32) ve maksimum [Ca2+]m 1-μM [Ca2+]...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

NADH ve fura-2 analoglarının uyarma ve emisyon dalga boylarının spektral örtüşmesi nedeniyle, canlı hücrelerdeki her iki kimyasaldan gelen sinyal paraziti [Ca2+]'ün kantitatif ölçümü sırasında kaçınılmazdır. Böylece, [Ca2+] ölçmek için NADH sinyal girişiminin yeni bir çevrimiçi düzeltme yöntemi geliştirilmiştir.

Canlı Hücrelerde Fura-2-Analog Ile Hücre İçi Ca2+ Ölçümü için Yeni Nikotinamid Adenin Dinükleotid Düzeltme Yöntemi

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

UV uyarılabilir çoğul problar, otomatik çoğul sesler nedeniyle, doğal bir sinyal kontaminasyonu var. NADH ile ilgili sorunun çoğu, çoğul bir sonda kullanımını sınırlamaktır. Bir yöntem, nadh gelen dış floresantam düzeltmek için kullanılabilir, gerçek, kirlenmemiş çoğul prob sinyali ayıklamak için.Prosedürü gösteren jeong Hoon Lee, laboratuvarımdaki araştırma yardımcı doçenti olacak. Miyositlerin tüpün dibine yerleşmelerine izin vererek, süpernatantı aspire edin. Hücreleri iki mililitre taze hazırlanmış bir milimolar fura-2-FFAM seyreltme çözeltisi ile etiketleyin.Kuluçka sonunda, supernatant çıkarmadan önce dik pozisyonda 30 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosu tüp yerleştirin. Sonra oda sıcaklığında depolamak için oda sıcaklığında kültür orta dört mililitre ekleyin. In situ isobestic fura-2-ffa noktası tanımlama için mikroskop aşamasına seyreltilmiş hücreleri monte ve hücrelerin dibe batmak için üç dakika bekleyin.Nadh içermeyen 37 santigrat derece kalsiyumsuz çözeltihücre kültürüne bol ve bir hedef hücre bulmak. NADH içermeyen kalsiyumiçermeyen solüsyon ile yeniden profusing önce 60 saniye boyunca saponin çözeltisi bol. Aynı anda fura-2-ff yayılan sinyalleri 450 ve 500 nanometre olarak ölçün, 0,1 nanometre adım la 350 ila 365 nanometre arasında bir uyarma taramayı ve NADH içermeyen kalsiyumsuz çözeltiile yeniden bolca kullanın.Daha sonra kalsiyumsuz koşullarda sinyallerden kalsiyum doymuş çözeltisi sinyalleri çıkarın. Daha sonra her uyarmada emisyonun standart sapmalarını hesaplayın ve tek tek isobestik noktalar olarak minimum standart sapma değerlerini gösteren uyarma dalga boyu seçin. Arka plan sinyalini tespit etmek ve hücre alanı içindeki sinyali düzeltmek için çok parametrik bir ölçüm sistemi kullanmak için, mikroskop banyosuna boyasız hücreler monte edin ve hücrelerin üç dakika lığına yerleşmesini bekleyin.Nadh kalsiyumsuz çözeltiyi dakikada 2-3 mililitre hızla yaklaşık beş dakika boyunca banyoya verin ve nesne alanını hedeflenen hücreyi kapsayacak şekilde ayarlayın. Hücreyi alan dışına çıkardıktan sonra hücreserbest penceresinin arka plan sinyallerini ölçün ve sinyalleri uzaklık olarak ayarlayın. Sonra hücreyi ilk konuma döndürün ve hücre arka plan sinyallerini ve hücre alanını ölçün.R-faktörünü hesaplamak için, boyaiçermeyen hücreleri mikroskoba yeniden monte etmeden ve kalsiyumsuz çözelti ile kullanmadan önce edinilmiş hücre arka planını ve alan sinyallerini kullanın. Masat çözeltisi ile hücre süspansiyonu profusing önce belirtildiği gibi sinyalleri ölçün. Sinyalleri ölçtükten sonra pirüvat çözeltisi ile hücreleri bol ve ardından malate-pirüuvat çözeltisi ve rotenone çözeltisi ile profüzyon.Daha sonra her sinyal için eğimi hesaplayın. Burada düzeltme öncesi ve sonrası mitokondriyal kalsiyum değişiklikleri gösterilir. Sonuçlar, mitokondriyal kalsiyumda 1.03 artı veya eksi 0.13 mikromolar ve maksimum mitokondriyal kalsiyum ile mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonunda önemli değişiklikler olduğunu açıkça ortaya koymaktadır.Mitokondriyal transmembran potansiyeli iki nanomolar TMRE profüzyonu ile izlendi. Mitokondriyal potansiyeldeki değişim eksi 150 milivoltluk ilk mitokondriyal membran potansiyeline göre hesaplandı ve kalsiyum eklenmesine yanıt olarak NADH'da bir azalma gösterdi ve mitokondriyal membran potansiyeli üzerinde ihmal edilebilir bir etki gösterdi. Mitokondiral pH karboksi SNARF-1 yükleme ile indüklenen mitokondriyal kalsiyum artışı ndan etkilenmedi.Yanlış isobestic noktaları yanlış R ve NADH düzeltme sayılsa neden olabilir. Bu nedenle, hücre içermeyen arka planı ve hücre alanını her zaman doğru bir şekilde ölçmeye özen tin.0k.000.000.000.000.000.000.000.0 Bu teknik biyoanalitik dökülmelerde mitokondriyal kalsiyum dinamik çalışmalarının hazırlanmasında kullanılır.

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: Doğru Genotiplendirme için Basit Bir Yöntem

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

ECIS / Taksiler ile Hücresel Kemotaksis Ölçümü

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Hücre içi Ca Ölçme<sup&gt; 2 +</supDört Teknikleri ile İnsan rm&gt; Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...