Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة بحثية من المعهد الوطني للعلوم العلمية والتكنولوجية (ANPCyT, PICT 2014-3693). جي إف دي إل، جي بي، و بي إتش سي هم زملاء من كونيست. دي دي إم وجي آر إل عضوان في مهنة البحث في كونيست. نحن ممتنون لغونزالو لامبرتو (INMET) لتحليل LC-MS/MS والمناقشة المفيدة. وقد قام بتصوير وتحرير الفيديو راميرو أورتيغا وماريا سوليداد كاساسولا من إدارة العلوم في جامعة العلوم، كلية العلوم العقلية للجامعة الوطنية في روزاريو، الأرجنتين.

1. 1-AG-D5 إعداد
ملاحظة: للحصول على 1-AG-d5 كمعيار داخلي مبتور لكمية الاختبارات، اتبع البروتوكول على النحو المفصل أدناه.
<ol><li>الحماية التفاضلية<ol>
<li>لحماية الكحول الأولية فقط، أولا إضافة 38 ملغ من الجلسرين د8 إلى أنبوب رد فعل 10 مل باستخدام ماصة باستور وإضافة النما?...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence.">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li><li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms.">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine:+a+simple+model+for+a+complex+discipline.">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li><li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves.">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).</li><li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves.">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).</li><li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

Endocannabinoids هي فئة من الدهون التي تورطت في تنظيم تشكيل دور في C. elegans7. وبشكل أكثر تحديدا، فإن تركيب الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (PUFAs) مهم للاتجار بالكوليسترول والتنمية الإنجابية للدانة. وقد كشف هنا أن 2-AG، وهو حمض الأراكيدونيك الذي يحتوي على endocannabinoid، هو المسؤول عن ار?...

Endocannabinoids تنظيم العمليات البيولوجية المتعددة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية ويتم حفظها وسطاء الدهون1. أول الإندوكانابينويدات المكتشفة والأكثر تميزا هي أنانداميد (أرشيدونويلإيثانولاميد، AEA) و 2-أرشيدونويل الجلسرين (2-AG). Endocannabinoids تلعب العديد من الأدوار الحاسمة, بما في ذلك تلك المشاركة في نظم مكافأة الدماغ، فضلا عن إدمان المخدرات, الذاكرة, المزاج, والعمليات الأيضية2. يتم تصنيع AEA و 2-AG فقط عند الحاجة ولها فترات حياة قصيرة، ويتم تدهورها من خلال نقل البروتين التناول والتحلل المائي3.
أصبح استخدام النماذج الحيوانية مثل Caenorhabditis elegans (C. elegans)مهملدراسة مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات البيولوجية بما في ذلك المبرمج، إشارات الخلايا، دورة الخلية، قطبية الخلايا، تنظيم الجينات، التمثيل الغذائي، الشيخوخة، وتحديد الجنس4،5. بالإضافة إلى ذلك، C. elegans هو نموذج ممتاز لدراسة الأدوار الفسيولوجية للأحماض الدهنية غير المشبعة (PUFAs). وقد تم تحديد AEA في C. elegans ويتم تخفيض تحت القيود الغذائية6. هذا النقص يمتد عمر الديدان الخيطية من خلال آلية تقييد الغذائية التي يمكن قمعها عن طريق مكملات مع endocannabinoid. في الآونة الأخيرة، تم اكتشاف أن 2-AG وAEA تلعب أدوارا أساسية في تنظيم الاتجار الكولسترول في C. elegans7. والأهم من ذلك، تم تحديد أن المكملات الغذائية مع الخارجية 2-AG يمكن إنقاذ dauer اعتقال، والذي يسببه ضعف الكولسترول الاتجار في نيمان بيك نوع C1 C. elegans المسوخ.
للحصول على فهم أفضل لعلاقة 2-AG مع الاتجار بالكولسترول والعمليات البيولوجية الأخرى في الديدان الخيطية (أي الإشارات أحادية الأمينية، nociception والحركة)، فمن الأهمية بمكان لدراسة هذا المستقلب الذاتية وكيف هو تتأثر في ظل بعض الظروف البيئية والغذائية8،9،10،11،12،13. لذلك، لا بد من تصميم وتحسين طريقة للكشف عن وتحديد المحلي 2-AG في C. elegans التي هي بسيطة للاستخدام للعلماء من مختلف المجالات، وخاصة أولئك الذين يدرسون سلوك الديدان الخيطية فيما يتعلق بهذا إندوكانابينويد.
في عام 2008، نجح Lethonen وزملاء العمل في تحديد 2-AG وAEA في C. elegans باستخدام LC-MS الأساليب التحليلية14. في عام 2011، تمكنوا من توسيع هذه التقنية إلى endocannabinoids أخرى15. وقد أظهرت الأعمال الحديثة أساليب تحليلية أخرى نجحت في الكشف عن والتحديد الكمي للبطانة في C. elegans، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي وGC-MS16،17،18، وقد كما أفيد أنه يمكن توسيع أساليب تحليلية مماثلة إلى نماذج أخرى19.
وعادة ما تنطوي الأساليب التحليلية المبلغ عنها سابقاً المستخدمة في التحديد الكمي 2-AG في العينات البيولوجية على استخدام معايير مقنَّعة يتم الحصول عليها تجارياً وتتطلب توافرها للشراء20و21. العديد من المعايير التحليلية للقياس الكمي LC-MS/MS من endocannabinoids متاحة تجاريا من مقدمي مختلف. ومع ذلك، فهي مكلفة، وحساسة، وتصبح مؤكسدة مع مرور الوقت، وذلك بسبب وجود سندات مزدوجة متعددة. وتستند الإصدارات الأكثر شيوعا من هذه المعايير على حمض الأراكيدوليك ثماني ة deuterated ومناسبة للقياس الكمي عن طريق تخفيف النظائر LC-MS/MS14،22. أيضا، يتم استبدال معظم هذه المعايير في موقف 2 من الجلسرين، مما يجعلها غير مستقرة في ظل معظم الظروف لأنها عرضة للهجرة أسيل19،23.
للتغلب على الصعوبات المرتبطة بتكاليف واستقرار هذه المعايير deuterated، يتم تقديم طريقة مريحة وبسيطة لإعداد معيار تحليلي على أساس الجلسرين د5. تسلسل لإعداد معيار خماسي ة deuterated يتطلب إجراء من ثلاث خطوات التي تؤدي إلى معيار 1-AG-D5, وهو مستقر ولا يخضع للهجرة أسيل (القضية الرئيسية عندما تهدف إلى توليف 2-monoacylglycerols).
الهدف الرئيسي هنا هو إظهار طريقة بسيطة واستنساخ لدراسة 2-AG في C. elegans، بما في ذلك توليف المعايير التحليلية deuterated، وإعداد واستخراج عينات الديدان الخيطية، والتحليل من قبل LC-MS /MS(الشكل 1 ). هذا الإجراء التركيبي يمكن تحقيقه دون المعرفة التوليفية العضوية المتطورة أو المعدات الخاصة، مما يجعلها مناسبة للعلماء من مختلف المجالات الذين يدرسون سلوك C. elegans تحت تأثير endocannabinoid. كما يمكن توسيع هذه الطريقة لتشمل نماذج دراسية أخرى، مما يجعلها مفيدة لمختلف الأهداف. وقد تم تطبيق المعيار، الذي تم إعداده كما هو ذكر هنا، لتطوير طريقة كروماتوغرافية سريعة وموثوق بها تسمح بالكشف الفعال والقياس الكمي لـ 2-AG بطريقة قابلة للاستنساخ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

يقدم هذا العمل طريقة لإعداد معيار تحليلي لتحليل 2-arashidonoyl الجلسرين (2-AG) نوعيا وكميا عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة-الكهربائي التأين-جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-ESI-MS/MS). يتم حفظ Endocannabinoids وسطاء الدهون التي تنظم العمليات البيولوجية المتعددة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. في C. elegans, تم العثور على 2-AG لامتلاك أدوار مختلفة, بما في ذلك تعديل تشكيل دور والتمثيل الغذائي الكولسترول. يصف هذا التقرير طريقة للتغلب على الصعوبات المرتبطة بتكاليف واستقرار المعايير المبتورة المطلوبة للقياس الكمي 2-AG. إجراء توليف المعيار بسيط ويمكن القيام به في أي مختبر، دون الحاجة إلى الخبرة التوليفية العضوية أو المعدات الخاصة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف تعديل طريقة فولتش لاستخراج المعيار المبتور من ثقافة C. elegans. وأخيرا، يتم وصف طريقة كمية وتحليلية للكشف عن 2-AG باستخدام مستقرة isotopically المسمى التناظرية 1-AG-D5، والذي يوفر نتائج موثوق بها في تشغيل الكروماتوغرافية السريعة. هذا الإجراء مفيد لدراسة الأدوار المتعددة من 2-AG في C. elegans في حين يجري أيضا تنطبق على دراسات أخرى من الأيض في الكائنات الحية المختلفة.

تم تصنيع التناظرية ذات العلامات المتساوية من d 8 المتاحة تجارياً وحمضالأراكيدوليك باستخدام طريقة اصطناعية من 3 خطوات (الشكل 2، الشكل 3). هذه الخطوات واضحة ولا تتطلب معدات متطورة، وظروف تسيطر عليها خصيصا، أو الكواشف باهظة الثمن. وهكذا،...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

يصف هذا العمل طريقة قوية ومباشرة للكشف عن وقياس الإندوكانابينويد 2-أرشيدونويلغليسيرول (2-AG) في C. elegans. معيار تحليلي مُعدّ نُستخدم للتكّنّال من 2-AG بواسطة التخفيف النظائري والقياس اللوني السائل - الرذاذ الكهربائي -قياس الطيف الكتلي الترادف (LC-ESI-MS/MS).

توليف معيار مبتور للكم من 2-Arashidonoylglycerol في Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

إندوكانابينويدات هي وسطاء الدهون المحفوظة التي تنظم العمليات البيولوجية المتعددة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. أول endocannabinoids المكتشفة هي أنانداميد و 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. الخيط من النياتود C.elegans هو نموذج حيواني قوي لدراسة مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات البيولوجية.في الآونة الأخيرة، اكتشفنا أن 2-AG يلعب دورا أساسيا في تنظيم الاتجار بالكولسترول في C.elegans. هذا هو السبب في أنه أصبح من الضروري تصميم وتحسين طريقة لدراسة الذاتية 2-AG عن طريق الكشف عن وتكميم في C.elegans. 11- وعادة ما تشمل الأساليب التحليلية التي سبق الإبلاغ عنها لقياس كمية 2-AG في العينات البيولوجية استخدام معايير مُتَرَكَّرة تجارياً، لكي تكون متاحة للشراء.ومع ذلك، فهي مكلفة، ونظرا لوجود العديد من السندات المزدوجة، حساسة للحصول على المؤكد مع مرور الوقت. وتستند النسخة الأكثر شيوعا من المعايير على حمض arachidonic octadeuterated كونها مناسبة للتموين الكمي عن طريق تخفيف النظائر، عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة، ومطياف الكتلة الخلفية. للتغلب على الصعوبات المرتبطة بتكلفة واستقرار المعايير deuterated لتحديد كمية 2-AG، استخدمنا طريقة مريحة وبسيطة لإعداد معيار تحليلي يستند إلى deuterium-5-الجلسرين.يتطلب تسلسل لإعداد معيار منجل إجراء الخطوات الثلاث. إمكانية الاحتفاظ بها في النموذج المحمي حتى تكون هناك حاجة إليها. الهدف الرئيسي من هذا العمل هو إظهار طريقة كاملة لدراسة 2-AG في C.elegans من توليف المعيار التحليلي deuterated لإعداد واستخراج عينات الخيطيات وأخيرا، والتحليل بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة والمطياف الشامل.للحصول على 1-AG deuterated كمعيار داخلي مُتَنَهَد لمقايسات القياس الكمي اتبع بروتوكول الخطوة الثلاث. من أجل حماية فقط الكحول الأولية، أولا إضافة 38 ملليغرام من الجلسرين deuterated إلى أنبوب رد فعل 10 ملليلتر باستخدام ماصة باستور وإضافة مُنذر مغناطيسي. بعد ذلك، أضف خمسة ملليلتر من DCM اللامائية باستخدام حقنة هاملتون خمسة ملليلتر وملء الأنبوب بالنيتروجين الجاف لإعطاء جو خامل.إعداد حمام باستخدام قارورة ديوار الضحلة مليئة خلات الإيثيل المقطر. ملء أنبوب التفاعل مغلقة بشكل رقي داخل الحمام وتبريده ببطء إضافة النيتروجين السائل إلى خلات الإيثيل حتى يتم تجميد المذيبات. الحذر، السائل يغلي بعنف في درجة حرارة الغرفة، ويمكن أن يسبب حروق شديدة إذا في اتصال مع العينين والجلد.بعد ذلك، أضف 54 ملليغرامًا من الاصطدام اللامائية باستخدام حقنة هاملتون. الحذر، والاصطدام متقلبة ولها رائحة قوية جدا وغير سارة. في 70 ملليغرام من تيربوتيل-ديميثيل-سيتيلكلوريد ويحرك كل شيء لمدة ثلاث ساعات في ناقص 78 درجة على مُنقل مغناطيسي.إضافة مليلتر اثنين من محلول ملحي لإخماد رد الفعل. استخراج الحل مع مليلترين من ثنائي كلوروميثان المقطر ثلاث مرات باستخدام قمع منفصلة حفظ المستخلصات العضوية في كل مرة. ثم، والجمع بين مستخلصات العضوية الثلاثة وتجف على كبريتيت الصوديوم.تنقية الخليط الخام حسب الكروماتوغرافيا العمود باستخدام هلام السيليكا كمرحلة ثابتة و10٪ زيادة الهيكسين خلات التدرج بدءا من 100٪ hexane والتشطيب مع 100٪ خلات الإيثيل. لهذه الخطوة استرة، إضافة 10 ملليغرام من المنتج ذكر سابقا إلى أنبوب تفاعل 10 ملليلتر باستخدام pippette باستور وإضافة مُحرك مغناطيسي. إضافة ملليلتر من DCM اللامائية باستخدام حقنة هاملتون خمسة ملليلتر وملء الأنبوب مع النيتروجين الجاف لإعطاء جو خامل.تبريد الحل إلى الصفر درجة باستخدام حمام الجليد. إعلان 36 ملليغرام من حمض arachidonic باستخدام ميكروبليت قابل للتعديل متعددة الحجم ويحرك. ثم، إضافة 15 ملليغرام من 40-ميثيل-أمينوبريدين ويحرك.إضافة 15 ملليغرام من diacyl بروبيل كاربوديميد باستخدام ميكرويبيت قابل للتعديل متعددة الحجم ويحرك. إضافة ملليلترين من الماء لإخماد رد الفعل ثم استخراج الحل مع مليلترين من المقطر DCM ثلاث مرات باستخدام قمع فصل. الجمع بين مستخلصات العضوية الثلاثة والجافة على كبريتيت الصوديوم، وتنقية الخليط الخام حسب الكروماتوغرافيا العمود باستخدام هلام السيليكا كمرحلة ثابتة ثم زيادة 10٪ تدرج خلات الإيثيل الهيكسان بدءا من 100٪ هيكسان والانتهاء مع 50 50٪ هيكسان خلات الإيثيل.وأخيرا، بالنسبة لخطوة إزالة الحماية، إضافة 15 ملليغرام من المنتج توليفها سابقا إلى أنبوب تفاعل 10 ملليلتر باستخدام ماصة باستور وإضافة مُنَجِّر مغناطيسي. إضافة ملليلترين من رباعية هيدروفوران اللامائية باستخدام حقنة هاملتون خمسة ملليلتر وملء الأنبوب مع النيتروجين الجاف لإعطاء جو خامل. ثم تبريد الحل إلى الصفر درجات باستخدام حمام جليدي.إضافة 150 ميكرولترات قطرة الحكمة من محلول واحد الضرس من فلوريد رباعي البوتيوم في THF باستخدام حقنة هاملتون. بعد ساعة واحدة، إضافة ملليلتر من الماء لإخماد رد الفعل. استخراج الحل مع اثنين ملليلتر المقطر DCM ثلاث مرات باستخدام مسار فصل القمع.الجمع بين مستخلصات العضوية الثلاثة وتجف على كبريتيت الصوديوم. لإجراء التبييض، بدوره الديدان على بذور ستة سنتيمترات لوحات NGM. السماح للدودة أن تنمو من يومين إلى ثلاثة أيام بحيث يكون هناك الكثير من البيض والبالغين جرافيد على لوحة.مرة واحدة لديك الكثير من البيض والبالغين، صب خمسة ملليلتر من M9 على لوحة. باستخدام ماصة زجاجية، نقل الديدان إلى أنبوب صقر 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة دقيقتين في 2،000 G وبيلي الديدان.شفط معظم M9 دون إزعاج بيليه دودة. إضافة ثلاثة ملليلترات من حل التبييض وخلط الحل بلطف عن طريق عكس لمدة خمس دقائق تقريبا أو حتى ترى انخفاضا في عدد الديدان الكبار سليمة. مرة واحدة قد حل معظم الهيئات، الطرد المركزي في 2،000 G لمدة دقيقة واحدة.شفط معظم محلول التبييض دون إزعاج بيليه الدودة. إضافة 15 ملليلتر من M9 إلى الأنبوب واخلط جيدا. جهاز طرد مركزي مرة أخرى في 2،000 G لمدة دقيقة واحدة.شفط معظم M9 دون إزعاج بيليه دودة. لإعداد عينة دودة، واسمحوا الأجنة N2 التي تم الحصول عليها عن طريق إجراء التبييض كان في ليلة وضحاها في M9 العازلة في 20 درجة. ثم، حصاد متزامنة L1s عن طريق الطرد المركزي الأنبوب دقيقتين في 2، 000 G.Wash الديدان مع M9 العازلة مرة أخرى، وقياس عدد من L1 الحية. بذور ما يقرب من 10،000 الديدان في لوحات NGM مع ملليلتر واحد من OP 50 Escherichia القولونية المجففة سابقا.احتضان لوحات على الأقل لمدة 48 ساعة في 20 درجة حتى الديدان تصل إلى مرحلة L4. حصاد الديدان باستخدام المخزن المؤقت M9 الباردة في أنبوب الصقر 50 ملليلتر. غسلها مرة واحدة أكثر ونقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.بيليه الديدان عن طريق الطرد المركزي في 2، 000 غ لمدة دقيقة واحدة. القضاء على معظم المناط. ثم غمر الأنبوب في النيتروجين السائل ويحرك في ناقص 80 درجة.ذوبان ما يقرب من 100 ميكرولترات من الكريات دودة المجمدة التي تنتمي إلى N2 ثم إضافة 1.3 ملليلتر من الميثانول. بعد ذلك، سونيكات العينة لمدة أربع دقائق. بعد سونيكيشن، إضافة 1، 000 ppb من معيار deuterated الداخلية، 2.6 ملليلتر من الكلوروفورم، و 1.3 ملليلتر من 0.5 مول من كلوريد البوتاسيوم، 0.08 مول من حمض الفوسفوريك إلى نسبة نهائية من واحد إلى واحد.دوامة العينات لمدة دقيقة واحدة ثم سونيكات لهم في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة على الجليد. دوامة العينات مرة أخرى مرتين لمدة دقيقة واحدة والطرد المركزي لهم لمدة 10 دقائق في 2،000 G للحث على فصل المرحلة. جمع المرحلة السفلى في أنبوب زجاجي نظيف، وتجفيفه تحت النيتروجين، وإعادة نقيب في 100 ميكرولتر من الأسيتونيتريل.لتحقيق الكم الناجح من 2-AG الذاتية، كان من الضروري توليف انها التناظرية المشبعة باستخدام طريقة خطوة ثلاث. بعد ذلك، تمت إضافته إلى عينات الدودة، واستخراج وتحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء، إلى جانب قياس الطيف الكتلي. يستخدم كمعيار داخلي، كان 1-AG الاصطناعية أداة لقياس المستقلب الداخلي.تم تحسين الأسلوب باستخدام التحولات ل2-AG و deuterated 1-AG حيث يتم فقدان جزيئات الجلسرين. 2-AG الذاتية من العينات C.elegans تم الكشف عنها بنجاح وكميا عن طريق التخفيف النظائري مع 1-AG توليفها كيميائيا باستخدام الكروماتوغرافيا السائل عالية الأداء مقترنة بالمسح الطيفي الشامل. تم إعداد عينة واحدة مع معيار deuterated 1-AG، في حين عينة اثنين دون المعيار.وبما أن التركيز الأصلي للمعيار المُنَحَد في العينة الأولى وثلاثة كان من 000 1 جزء في المليار لكل من كل منه، فمن نسبة منطقة الذروة، من الممكن حساب التركيز الداخلي البالغ 2-AG في العينة التي تبلغ 340 جزء في المليار للعينة الأولى و360 جزء في المليار للعينة الثالثة، مما يعطي متوسط 350 جزء في المليار. وقد حسبت النسب كجودة بين مناطق الذروة من 2-AG و 1-AG، على التوالي، لعينتين معزولتين. كلاهما مع معيار deuterated وأضاف سابقا لاستخراج.ونظرا لأهمية اكتشفت مؤخرا من 2-AG في تعزيز الاتجار بالكوليسترول ونقص المعلومات عن كيفية تأثير الدهون على هذه العملية, كان من الضروري وسيلة الكشف موثوق لهذا endocannabinoid. وكان نجاح تطوير طريقة بسيطة وقوية الاصطناعية ذكرت هنا للحصول على deuterated التناظرية 2-AG خطوة رئيسية في هذا البروتوكول. معظم الأساليب المبلغ عنها لتحديد أحادية الغالوريسيرول تنطوي على استخدام المعايير التحليلية المتاحة تجاريا, التي عادة ما تكون مكلفة وغير مستقرة في ظل ظروف التخزين العادية, مما يجعلها لا يمكن الوصول إليها للمختبرات ذات الميزانية المنخفضة.ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تحل هذا من خلال اقتراح توليف المعيار باستخدام مواد بداية أكثر سهولة. الطريقة الاصطناعية هي مباشرة إلى الأمام دون الظروف المتطورة اللازمة، مما يجعلها مثالية ليتم تنفيذها في أي مختبر مع الحد الأدنى من المعدات والوصول إلى المواد المتفاعلة، حتى في ميزانية مخفضة. باختصار، يصف هذا الإجراء الجديد طريقة مباشرة إلى الأمام وقابلة للتكرار للكشف عن وقياس كمية 2-AG التي من شأنها أن تساعد على الإجابة على بعض الأسئلة التي أثيرت بعد وصف دور هذه endocannabinoids في الاتجار بالكولسترول في C.elegans.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

أسلوب قياس ألوان لقياس محتوى الحديد في النباتات

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

زراعة الواسعة النطاق على أساس لوحة ايليجانس كاينورهابديتيس: "إعداد نموذج" "دراسة التعديلات الأيضي" في مرض السكري

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

القياس الكمي لانزيم A في الخلايا والانسجه

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

في فيفو هيدروكسيل الجذر البروتين البصمة لدراسة التفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

عزل نشط Caenorhabditis elegans استخراج النووية وإعادة تشكيل للنسخ في المختبر

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...