Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

这项工作得到了国家科学与技术发展协会（ANPCyT，PICT，2014-3693年）的研究赠款的支持。J.F.d.L.、G.P.和B.H.C.是来自CONICET的研究员。D.D.M.和G.R.L.是CONICET研究事业的成员。我们感谢冈萨洛·兰贝托（INMET）的LC-MS/MS分析和有益的讨论。拉米罗·奥尔特加和玛丽亚·索莱达·卡萨索拉拉来自阿根廷罗萨里奥国立罗萨里奥国立体育学院，国际学院。

1. 1-AG-d5准备
注：为了获得1-AG-d5作为定量检测的内部标准，请遵循如下详细协议。
<ol><li>差分保护<ol>
<li>为了只保护原发性酒精，首先使用巴斯德移液器在10 mL反应管中加入38毫克甘油-d8，然后加入磁搅拌器。</li>
		<li>使用 5 mL 汉密尔顿注射器加入 5 mL 无水二氯甲烷 （DCM），并用干 N2填充管，产生惰性大气。</li>
		<li>使用装满蒸馏乙酸乙酸的...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence.">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li><li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms.">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine:+a+simple+model+for+a+complex+discipline.">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li><li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves.">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).</li><li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves.">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).</li><li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

内分泌大麻素是一类脂质，在C.elegans7中涉及对种黄的调节。更具体地说，多不饱和脂肪酸（PUFAs）的合成对胆固醇贩运和蠕虫的生殖发育非常重要。据此间透露，2-AG是一种含有内分泌大麻素的甲壳类酸，负责使达尔幼虫在胆固醇代谢受损的蠕虫中恢复其正常周期。
鉴于最近发现的2-AG在提高胆固醇贩运和其他生物过程的重要性，以及...

内分泌大麻素调节多种生物过程中的多种生物过程，并保存脂质中介1。首次发现且特征最良好的内分泌大麻素是安丹酰胺（阿拉基诺诺醇酰胺，AEA）和2-阿拉奇诺诺基甘油（2-AG）。内分泌大麻素起许多关键作用，包括那些参与大脑奖励系统以及毒瘾，记忆，情绪和代谢过程2。AEA和2-AG仅在需要时合成，寿命短，通过运输蛋白再摄入和水解3降解。
使用动物模型，如Caenorhabditis elegans （C. elegans）已成为研究各种生物过程，包括凋亡、 细胞信号、 细胞周期、 细胞极性、 基因调控、 代谢、 老化、和性别决定4，5。此外，C. elegans是研究多不饱和脂肪酸 （PUFAs） 生理作用的极佳模型。AEA已在C.elegans中被识别，并在饮食限制6下减少。这种缺陷通过膳食限制机制延长线虫的寿命，这种机制可以通过补充内分泌大麻素来抑制。最近，人们发现2-AG和AEA在管制C.elegans7的胆固醇贩运方面起着基础性作用。更重要的是，它确定，补充外源性2-AG可以拯救牛逮捕，这是由在尼曼-皮克C1型C.elegans突变体中胆固醇贩运受损引起的。
为了更好地了解2-AG与线虫中胆固醇贩运和其他生物过程的关系（即单胺能信号、异位信号和运动），研究这种内源代谢物及其表现至关重要受某些环境和饮食条件影响8、9、10、11、12、13。因此，必须设计和优化一种检测和量化C.elegan中内源性2-AG的方法，这种方法对于不同领域的科学家来说都很简单，特别是那些研究线虫行为的人。内分泌大麻素。
2008 年，Lethonen 和同事使用 LC-MS 分析方法14成功识别了C. elegan 的2-AG 和 AEA。2011年，他们成功地将这项技术推广到其他内分泌大麻素15。最近的研究已经表明，其他分析方法已经成功地检测和量化了C.elegans中的内分泌大麻素，包括质谱和GC-MS 16、17、18，并且它有另据报道，类似的分析方法可以扩展到其他型号19。
以前报告用于量化生物样品中2-AG的分析方法通常涉及使用商业上获取的脱化标准，并要求购买20、21。用于内分泌大麻素的LC-MS/MS定量的许多分析标准可从不同供应商获得。然而，它们价格昂贵，敏感，并且随着时间的推移变得氧化，因为存在多个双键。这些标准最常见的版本是基于八度脱化的阿拉奇酮酸，适合通过同位素稀释LC-MS/MS14，22定量。此外，这些标准大多被替换为甘油的位置2，使它们在大多数条件下不稳定，因为它们容易发生丙基迁移19，23。
为了克服与这些去水标准的成本和稳定性相关的困难，提出了一种方便而简单的方法来准备基于甘油-d5的分析标准。准备五角星标准的顺序需要三步程序，结果为标准的1-AG-d5，这是稳定的，不进行丙基迁移（在旨在合成2个单酸甘油时的主要问题）。
这里的主要目标是展示一种简单且可重复的方法，用于研究C.elegans中的2-AG，包括分析化标准的综合、线虫样品的制备和提取，以及LC-MS/MS的分析（图1）).这种合成程序在没有精密的有机合成知识或特殊设备的情况下是可以实现的，因此适合不同领域的科学家，他们正在研究在内分泌素影响下对C.elegans的行为。该方法还可以扩展到其他研究模型，使其适用于不同的目标。此处报告的标准已应用于成功开发一种快速可靠的色谱方法，以便以可重现的方式有效检测和定量 2-AG。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

本工作提出了一种通过液相色谱-电喷雾电化-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）定性和定量分析2-阿拉基诺诺基甘油（2-AG）的分析标准的方法。内分泌大麻素是调节多种生物的多种生物过程的保存脂质中介物。在C.elegans中，2-AG被发现具有不同的作用，包括调节达瑙形成和胆固醇代谢。本报告描述了一种克服与2-AG量化所需的去化标准的成本和稳定性相关的困难的方法。标准合成程序简单，可在任何实验室进行，无需有机合成专业知识或特殊设备。此外，还描述了Folch从C.elegans文化中提取分离标准的方法的修改。最后，描述了一种使用稳定等位标记模拟1-AG-d5检测2-AG的定量和分析方法，在快速色谱运行中提供了可靠的结果。该程序可用于研究 2-AG 在C. elegan 中的多重作用，同时也适用于不同生物体中代谢物的其他研究。

一个同位素标记的模拟成功地合成了从市售的d8-甘油和阿拉奇酮酸使用3步合成方法（图2，图3）。这些步骤简单明了，不需要精密的设备、特殊控制的条件或昂贵的试剂。因此，这种方法是健壮的，可以成功地扩展到合成含有不同脂肪酸的甘油酯。
1-AG-d5采用核磁光...

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Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

这项工作描述了一个强大和直接的方法，以检测和量化内分泌大麻素2-阿拉基诺诺甘醇（2-AG）在C.elegans。我们通过同位素稀释和液相色谱-电喷雾电化-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）制备并用于2-AG定量的分析化标准。

Caenorhabditis elegans中 2-阿拉希多诺诺基甘油定量的分解标准合成

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

内啡肽是保守的脂质介质，调节各种生物体中的多种生物过程。首次发现的内啡肽是阿南达米德和2-阿拉奇多诺伊利塞罗尔，2AG。线虫C.elegans是研究多种生物过程的强大动物模型。最近，我们发现2-AG在调节C.elegans胆固醇贩运方面起着基础性作用。这就是为什么设计和优化一种通过C.elegans的检测和定量来研究内生2-AG的方法变得势在必行。以前报告的分析方法，以量化2AG的生物样品通常涉及使用除去标准，商业收购需要有他们可供购买。然而，它们价格昂贵，而且由于存在多个双键，因此对随着时间的推移被氧化非常敏感。标准最常见的版本是基于八度氧化氢酸，适合通过同位素稀释、液相色谱和后质谱进行定量。为了克服与2-AG的脱化标准的成本和稳定性相关的困难，我们用一种方便而简单的方法来准备基于2-5-甘油的分析标准。准备五角标准的顺序需要三个步骤。可以保持在受保护的形式，直到它需要。本工作的主要目的是展示一套完整的方法，从分析脱氧标准的合成到线虫样品的制备和提取，最后通过液相色谱和质谱分析，研究C.elegans中的2-AG。获得脱毒1-AG作为定量测定的解毒内部标准，遵循三步协议。为了只保护原醇，首先使用巴斯德移液器将38毫克甘油解至10毫升反应管中，然后加入磁搅拌器。接下来，使用五毫升汉密尔顿注射器加入五毫升无水 DCM，并在管内加入干氮，以营造惰性气氛。使用装满蒸馏乙酸乙酯的浅德瓦尔烧瓶准备一个浴缸。将密封反应管填充在浴池内，然后缓慢地将液氮加入乙酸乙酯中冷却，直到溶剂被冷冻。注意，液体在室温下剧烈沸腾，如果与眼睛和皮肤接触，可能会导致严重烧伤。接下来，使用汉密尔顿注射器添加54毫克无水对撞。注意，碰撞是挥发性，有一个非常强烈和难闻的气味。在70毫克的特丁基-二甲基-乙酰氯，并在负78度的磁搅拌器上搅拌所有东西三个小时。加入两毫升盐水以抑制反应。使用两毫升蒸馏二氯甲烷三次提取溶液，使用分离的漏斗每次保持有机提取物。然后，将三种有机提取物与硫酸钠干燥。使用柱色谱法，以硅胶作为固定相，从 100%六烷开始，以 100% 乙酸乙酯完成 10% 的六烷乙酸酯梯度，然后以 100% 乙酸乙酯完成。对于此酯化步骤，使用巴斯德皮盘将先前声明的产品添加到 10 毫升反应管中，并加入磁性搅拌器。使用五毫升汉密尔顿注射器加入两毫升无水 DCM，并在管内加入干氮，以营造惰性气氛。使用冰浴将溶液冷却到零度。使用多体积可调微管和搅拌的36毫克阿拉奇尼酸。然后，加入15毫克的40-甲基-氨基苯丙胺，搅拌。使用多体积可调微管加入15毫克二甲基丙基卡博米德，搅拌。加入两毫升水以淬火反应，然后用两毫升蒸馏DCM三次使用分离漏斗提取溶液。结合三种有机提取物和干燥的硫酸钠，用硅胶作为固定阶段通过柱色谱纯化粗混合物，然后从100%六烷开始增加乙酸六烷的六烷乙酸酯梯度，最后以50 50%乙酸乙基乙酸乙烷完成。最后，对于脱保步骤，使用巴斯德移液器将先前合成的15毫克产品加入10毫升反应管，并加入磁搅拌器。使用五毫升汉密尔顿注射器加入两毫升无水四氢素，用干氮填充管子，以营造惰性气氛。然后使用冰浴将溶液冷却到零度。使用汉密尔顿注射器在THF中加入150微升滴，在THF中加入一种四丁基酰胺氟化的摩尔溶液。一小时后，加入两毫升水来淬火。使用分离漏斗用两毫升蒸馏 DCM 三次提取溶液。将三种有机提取物和干燥的硫酸钠混合。对于漂白过程，将蠕虫转向种子六厘米的NGM板。让蠕虫从两天长到三天，这样盘子里就有很多鸡蛋和成年。一旦你有足够的鸡蛋和成人，倒五毫升的M9到盘子里。使用玻璃移液器，将蠕虫转移到15毫升猎鹰管中。在2000G下将管子离心两分钟，然后对蠕虫进行颗粒化。在不干扰蠕虫颗粒的情况下吸吸大部分 M9。加入三毫升漂白溶液，通过倒置轻轻混合溶液约五分钟，或直到看到完整的成年蠕虫数量减少。一旦大部分尸体溶解，离心机在2000G下一分钟。在不干扰蠕虫颗粒的情况下吸吸大部分漂白溶液。将15毫升M9加入管子，混合好。在2000G下再次离心一分钟。在不干扰蠕虫颗粒的情况下吸吸大部分 M9。对于蠕虫样本制备，让通过漂白程序获得的N2胚胎在M9缓冲液中过夜，温度为20度。然后，收获同步L1，在2000G下将管子离心两分钟，再用M9缓冲液清洗蠕虫，并量化活L1的数量。将大约1万只蠕虫播种到NGM板中，用一毫升OP 50 Escherichia大肠杆菌先前干燥。在20度下孵育板至少48小时，直到蠕虫到达L4级。使用冷M9缓冲液在50毫升猎鹰管中收获蠕虫。洗一次，并转移到1.5毫升管。在2000G下离心一分钟，将蠕虫挖碎。消除大部分上一液。然后，将管浸入液氮中，在零下80度下搅拌。解冻约100微升属于N2的冷冻蠕虫颗粒，然后加入1.3毫升甲醇。之后，对样品进行四分钟的声波化。声化后，加入1000ppb的内部脱氧标准，2.6毫升氯仿，1.3毫升0.5摩尔氯化钾，0.08摩尔磷酸，最终比例为1比1。将样品旋涡1分钟，然后在超声波水浴中对样品进行声波化，在冰上进行15分钟。再次对样品进行两次涡流，一分钟，在2000G下将样品离心10分钟，以诱导相分离。将下相收集到干净的玻璃管中，在氮气下干燥，然后重新放入100微升的乙酰气中。为了实现内源2-AG的成功定量，有必要使用三步法合成其饱和模拟。之后，它被添加到蠕虫样品中，通过高性能液相色谱提取和分析，并结合质谱法。作为内部标准，合成脱毒1-AG是量化内源代谢物的工具。该方法使用2-AG和脱氧1-AG的转方进行了优化，其中甘油分子丢失。C.elegans 样品中的 2-AG 内源性通过同位素稀释成功检测和量化，使用化学合成的 1-AG，使用高性能液相色谱法与质谱法相结合。样本 1 使用脱化标准 1-AG 制备，而样本 2 未使用标准。由于样品1和3中原来除化标准的浓度为1000ppb，因此从峰值面积比可以计算样品1和样品360ppb的样品中2-AG的内源性浓度，3样本的360ppb，平均为350ppb。比率计算为两个分离样本的 2-AG 和脱化 1-AG 峰值区域之间的质量。两者都与脱吸标准添加到提取之前。鉴于最近发现的2-AG在提高胆固醇贩运方面的重要性，以及缺乏脂质如何影响这一过程的信息，因此有必要对这种内啡肽进行可靠的检测。成功开发一种简单而健壮的合成方法，获得脱化模拟2-AG是该协议的关键步骤。所报告的单烷甘油量化方法大多数涉及使用市售分析标准，这些标准在常规储存条件下通常昂贵且不稳定，因此对于预算较低的实验室来说，这些标准是无法达到的。但是，此方法通过提出使用更易访问的起始材料对标准进行综合计算来解决这个问题。合成方法无需复杂条件即可直接使用，因此即使在预算减少的情况下，在任何设备最少且可接触反应物的实验室中即可进行。总之，这个新程序描述了一种直接和可重复的检测和量化2-AG的方法，这将有助于回答在描述这些内啡肽在C.elegans胆固醇贩运中的作用后提出的一些问题。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱用于研究蛋白质结构与动态

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

科研

生物化学

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

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丰度和收费水平的转移 Rna 在大肠杆菌中的量化

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Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

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In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

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Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

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活性 秀丽隐杆线 虫核提取物的分离及重建用于 体外 转录

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...