Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et forskningsstipendium fra Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P. og B.H.C. er stipendiater fra CONICET. D.d.M. og G.R.L. er medlemmer af CONICETS forskningskarriere. Vi er taknemmelige for Gonzalo Lamberto (INMET) for LC-MS/MS analyse og hjælpsom diskussion. Video optagelse og-redigering er blevet udført af Ramiro Ortega og María Soledad Casasola fra Dirección de Comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario i Rosario, Argentina.

1.1-AG-d5 forberedelse
Bemærk: for at opnå 1-AG-d5 som en deutereret intern standard for kvantificerings analyser, Følg protokollen som beskrevet nedenfor.
<ol><li>Differentieret beskyttelse<ol>
<li>For kun at beskytte primære alkoholer skal der først tilsættes 38 mg glycerol-d8 til et 10 ml reaktions slange med en Pasteur-pipette og tilsættes en magnetisk omrører.</li>
		<li>Der tilsættes 5 mL vandfri dichlormethan (DCM) ved hjælp af en 5 mL Hamilt...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence.">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li><li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms.">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine:+a+simple+model+for+a+complex+discipline.">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li><li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves.">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).</li><li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves.">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).</li><li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

Endocannabinoider er en klasse af lipider, som har været impliceret i reguleringen af Dauer dannelse i C. elegans7. Mere specifikt, syntesen af flerumættede fedtsyrer (PUFAs) er vigtig for kolesterol handel og reproduktiv udvikling af orme. Det er afsløret her, at 2-AG, en arachidonsyre, der indeholder endocannabinoid, er ansvarlig for at restituere Dauer larve til sin normale cyklus i orme, der har nedsat kolesterol metabolisme7.
I b...

Endocannabinoider regulere flere biologiske processer i en række organismer og er bevaret lipid mediatorer1. De første opdagede og mest velkarakteriserede endocannabinoider er anandamid (arachidonoylethanolamid, AEA) og 2-arachidonoyl glycerol (2-AG). Endocannabinoider spille mange kritiske roller, herunder dem, der er involveret i hjernen belønning systemer samt stofmisbrug, hukommelse, humør, og metaboliske processer2. AEA og 2-AG er kun syntetiseret når det er nødvendigt og har korte levetid, og de nedbrydes gennem transport protein reuptake og hydrolyse3.
Brugen af dyremodeller som Caenorhabditis elegans (C. elegans) er blevet vigtigt at studere de mange forskellige biologiske processer, herunder apoptose, celle signalering, celle cyklus, celle polaritet, genregulering, metabolisme, aldring, og kønsbestemmelse4,5. Derudover er C. elegans en glimrende model til at studere de fysiologiske roller af flerumættede fedtsyrer (pufas). AEA er blevet identificeret i C. elegans og er reduceret under kosten begrænsning6. Denne mangel forlænger levetiden af fyrretræsnematoden gennem en kost begrænsning mekanisme, der kan undertrykkes af tilskud med endocannabinoid. For nylig blev det opdaget, at 2-AG og AEA spiller grundlæggende roller i reguleringen af kolesterol handel i C. elegans7. Endnu vigtigere, det blev fastslået, at tilskud med udefrakommende 2-AG kan redde Dauer anholdelse, som er forårsaget af den svækkede kolesterol handel i Niemann-pick type C1 C. elegans mutanter.
For at få en bedre forståelse af 2-ag's forhold til kolesterol handel og andre biologiske processer i fyrretræsnematoden (dvs. monoaminerge signalering, nociception og bevægelse), er det afgørende at studere denne endogene metabolit og hvordan det er påvirket under visse miljømæssige og ernæringsmæssige forhold8,9,10,11,12,13. Derfor er det bydende nødvendigt at designe og optimere en metode til at detektere og kvantificere endogene 2-AG i C. elegans , der er enkel at bruge for forskere i forskellige områder, især dem, der studerer nematode adfærd i forhold til denne endocannabinoide.
I 2008 lykkedes det for Leth onen og kolleger at identificere 2-AG og AEA i C. elegans ved hjælp af LC-MS analytiske metoder14. I 2011, de formåede at udvide denne teknik til andre endocannabinoider15. Nyere arbejde har vist andre analytiske metoder, der har haft succes med at påvise og kvantificere endocannabinoider i C. elegans, herunder massespektrometri og GC-MS 16,17,18, og det har også blevet rapporteret, at lignende analytiske metoder kan udvides til andre modeller19.
Tidligere rapporterede analysemetoder, der anvendes til kvantificering af 2-AG i biologiske prøver, indebærer normalt brug af deutererede standarder, der er erhvervet kommercielt, og som kræver tilgængelighed for købet20,21. Mange analytiske standarder for LC-MS/MS kvantificering af endocannabinoider er kommercielt tilgængelige fra forskellige udbydere. Ikke desto mindre, de er dyre, er følsomme, og bliver oxideret over tid, på grund af tilstedeværelsen af flere dobbelt obligationer. De mest almindeligt forekommende versioner af disse standarder er baseret på den OCTA-deutererede arachidonsyre og egner sig til kvantificering ved isotop fortynding LC-MS/MS14,22. Også, de fleste af disse standarder er erstattet i position 2 af glycerol, hvilket gør dem ustabile under de fleste betingelser, da de er tilbøjelige til acyl migration19,23.
For at overvinde vanskelighederne forbundet med omkostningerne og stabiliteten af disse er standarder, en bekvem og enkel metode er præsenteret for at udarbejde en analytisk standard baseret på glycerol-d5. Sekvensen til at forberede Penta-deuterated standard kræver en tre-trins procedure, der resulterer i standard 1-AG-d5, som er stabil og ikke undergår acyl migration (det vigtigste spørgsmål, når de sigter mod at syntetisere 2-monoacylglyceroler).
Hovedformålet er her at vise en enkel og reproducerbar metode til at studere 2-AG i C. elegans, herunder syntesen af den analytiske er standard, klargøring og ekstraktion af fyrretræsnematoden prøverne, og analyse af LC-MS/MS (figur 1 ). Denne syntetiske procedure er opnåelig uden den sofistikerede organiske syntese viden eller specialudstyr, hvilket gør det velegnet til forskere fra forskellige områder, der studerer C. elegans opførsel under endocannabinoide indflydelse. Metoden kan også udvides til andre studie modeller, hvilket gør den anvendelig til forskellige mål. Standarden, udarbejdet som rapporteret her, er blevet anvendt til med succes at udvikle en hurtig og pålidelig kromatografi metode, der giver mulighed for effektiv påvisning og kvantificering af 2-AG i en reproducerbar måde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

Dette arbejde præsenterer en metode til at udarbejde en analytisk standard til analyse af 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) kvalitativt og kvantitativt ved væskekromatografi-elektro spray ionisering-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoider er bevaret lipid mediatorer, der regulerer flere biologiske processer i en række organismer. I C. elegans, 2-AG har været fundet at besidde forskellige roller, herunder graduering af Dauer dannelse og kolesterol metabolisme. I denne rapport beskrives en metode til at overvinde de vanskeligheder, der er forbundet med omkostninger og stabilitet i de deutererede standarder, der kræves til kvantificering af 2 AG. Proceduren for syntesen af standarden er enkel og kan udføres i ethvert laboratorium, uden behov for organisk syntese ekspertise eller særligt udstyr. Desuden er en ændring af Folch metode til at udtrække den er standard fra C. elegans kultur er beskrevet. Endelig beskrives en kvantitativ og analytisk metode til påvisning af 2-AG ved hjælp af den stabile isotopisk mærkede analoge 1-AG-d5 , som giver pålidelige resultater i en hurtig kromatografisk kørsel. Proceduren er nyttig til at studere de mange roller 2-AG i C. elegans , mens også gælder for andre undersøgelser af metabolitter i forskellige organismer.

En isotopisk mærket analog blev med held syntetiseret fra kommercielt tilgængelig d8-glycerol og arachidonsyre ved hjælp af en 3-trins syntetisk metode (figur 2, figur 3). Disse trin er ligetil og kræver ikke sofistikeret udstyr, specielt kontrollerede forhold, eller dyre reagenser. Således, denne metode er robust og kan med succes udvides til at syntetisere monoacylglycerider indeholdende forskellige fedtsyrer.</...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Dette arbejde beskriver en robust og ligetil metode til at detektere og kvantificere endocannabinoide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) i C. elegans. En analytisk deutereret standard os tilberedt og anvendt til kvantificering af 2-AG ved isotop fortynding og væskekromatografi-elektro spray ionisering-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS/MS).

Syntese af en deutereret standard for kvantificering af 2-Arachidonoylglycerol i Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Endocannabinoider er bevaret lipid mæglere, der regulerer flere biologiske processer i en række forskellige organismer. De første opdagede endocannabinoider er anandamid og 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. Nematode C.elegans er en kraftfuld dyremodel til at studere en lang række biologiske processer.For nylig opdagede vi, at 2-AG spiller en grundlæggende rolle i reguleringen af kolesterolhandel med C.elegans. Derfor blev det bydende nødvendigt at designe og optimere en metode til at studere endogene 2-AG ved at detektion og kvantificering i C.elegans. Tidligere rapporterede analysemetoder til kvantificering af 2-AG i biologiske prøver indebærer normalt anvendelse af deutererede standarder, der er kommercielle erhvervede, er forpligtet til at få dem til rådighed for køb.Ikke desto mindre er de dyre, og på grund af tilstedeværelsen af flere dobbeltbindinger, er følsomme over for at få oxideret over tid. Den mest almindelige version af standarderne er baseret på, at den oktamonerede arachidonsyre er egnet til kvantificering ved isotopfortynding, ved flydende kromatografi og posterior massespektroskopi. For at overvinde de vanskeligheder, der er forbundet med omkostningerne og stabiliteten af de deutererede standarder for at kvantificere 2-AG, brugte vi en praktisk og enkel metode til at udarbejde en analytisk standard baseret på deuterium-5-glycerol.Rækkefølgen for at forberede pendeuterated standard kræver en tre trin procedure. At være muligt at blive holdt i beskyttet form, indtil det er nødvendigt. Hovedformålet med dette arbejde er at vise en fuldstændig metode til at studere 2-AG i C.elegans fra syntesen af den analytiske deutererede standard til fremstilling og ekstraktion af nematodeprøverne og endelig analysen ved flydende kromatografi og massespektroskopi.For at opnå deuterated 1-AG som en deuterated intern standard for kvantificering assays følge en tre trin protokol. For kun at beskytte primære alkoholer, først tilsættes 38 milligram glycerol deutereret til en 10 milliliter reaktionsrør ved hjælp af en Pasteur pipette og tilsæt en magnetisk omrører. Dernæst tilsættes fem milliliter vandfri DCM ved hjælp af en fem milliliter Hamilton sprøjte og fyld røret med tørt kvælstof for at give en inert atmosfære.Forbered et bad ved hjælp af en lavvandet Dewar kolbe fyldt med destilleret ethylacetat. Fyld hermetisk lukket reaktionsrør inde i badet og afkøl det ved langsomt at tilsætte flydende nitrogen til ethylacetat, indtil opløsningsmidlet er frosset. Forsigtig, væske koger voldsomt ved stuetemperatur og kan forårsage alvorlige forbrændinger, hvis de kommer i kontakt med øjne og hud.Dernæst tilsættes 54 milligram vandfri kolliderende ved hjælp af en Hamilton sprøjte. Forsigtig, collidine er flygtig og har en meget stærk og ubehagelig lugt. Ved 70 mg terbutile-dimethyl-cetylchlorid og rør alt i tre timer ved minus 78 grader på en magnetisk omrører.Tilsæt to milliliter saltlage til at slukke reaktionen. Opløsningen udvindes med to milliliter destilleret dichlormethan tre gange ved hjælp af en adskilt tragt, der holder de organiske ekstrakter hver gang. Derefter kombinere de tre organiske ekstrakter og tør over natriumsulfit.Rens den rå blanding ved kolonnekromatografi ved hjælp af silicagel som den stationære fase og en 10% stigende hexanethylacetat gradient startende fra 100%hexan og efterbehandling med 100% ethylacetat. Til dette esterificeringstrin tilsættes 10 mg af produktet, der tidligere er angivet, til et 10 milliliter reaktionsrør ved hjælp af en Pasteur pippette, og der tilsættes en magnetisk omrører. Tilsæt to milliliter vandfri DCM ved hjælp af en fem milliliter Hamilton sprøjte og fyld røret med tørt kvælstof for at give en inert atmosfære.Afkøl opløsningen til nul grader ved hjælp af et isbad. Ad 36 milligram arachidonsyre ved hjælp af en multi-volumen justerbar mikropipette og rør. Derefter, tilsæt 15 milligram 40-methyl-aminopyridin og rør.Tilsæt 15 milligram diacylpropylcarbodiimid ved hjælp af en multi-volumen justerbar mikropipette og rør. Der tilsættes to milliliter vand for at slukke reaktionen, og opløsningen trækkes derefter ud med to milliliter destilleret DCM tre gange ved hjælp af en skilletragt. Kombiner de tre organiske ekstrakter og tør over natriumsulfit, rense den rå blanding ved kolonnekromatografi ved hjælp af silica gel som en stationær fase en derefter 10% stigende hexan ethyl acetat gradient startende fra 100% hexan og efterbehandling med 50 50% hexan ethylacetat.Endelig, for deprotection trin, tilsættes 15 milligram af den tidligere syntetiseret produkt til en 10 milliliter reaktionsrør ved hjælp af en Pasteur pipette og tilsæt en magnetisk omrører. Tilsæt to milliliter vandfri tetrahydrofuran ved hjælp af en fem milliliter Hamilton sprøjte og fyld røret med tørt kvælstof for at give en inert atmosfære. Derefter afkøles opløsningen til nul grader ved hjælp af et isbad.Der tilsættes 150 mikroliter, der er dråbevis af en molæreopløsning tetrabutylammoniumfluorid i THF ved hjælp af en Hamilton-sprøjte. Efter en time tilsættes to milliliter vand for at slukke reaktionen. Opløsningen udvindes med to milliliter, der er destilleret DCM tre gange ved hjælp af en skilletragt.Kombiner de tre organiske ekstrakter og tør over natriumsulfit. For blegning procedure, drej orme på seedet seks centimeter NGM plader. Tillad ormen til at vokse fra to til tre dage, så der er masser af æg og gravide voksne på pladen.Når du har masser af æg og voksne, hæld fem milliliter M9 på pladen. Ved hjælp af en glaspipette, overføre orme til en 15 milliliter falkerør. Centrifuge røret i to minutter ved 2, 000 G og pellet ormene.Sug det meste af M9 uden at forstyrre ormen pellet. Tilsæt tre milliliter blegning opløsning og bland opløsningen forsigtigt ved at vende i cirka fem minutter, eller indtil du ser et fald i antallet af intakte voksne orme. Når de fleste af de organer, der er opløst, centrifuge ved 2, 000 G i et minut.Sug det meste af blegning løsning uden at forstyrre ormen pellet. Tilsæt 15 milliliter M9 til røret og bland godt. Centrifuge igen ved 2,000 G i et minut.Sug det meste af M9 uden at forstyrre ormen pellet. For orm prøve forberedelse, lad N2 embryoner opnået ved blegning procedure havde i natten i M9 buffer ved 20 grader. Derefter høst synkroniseret L1s ved centrifugering røret to minutter ved 2, 000 G.Vask ormene med M9 buffer en gang mere og kvantificere antallet af levende L1. Frø ca 10,000 orme i NGM plader med en milliliter OP 50 Escherichia coli tidligere tørret.Inkuber pladerne mindst i 48 timer ved 20 grader, indtil ormene når L4-trin. Høst ormene ved hjælp af kolde M9 buffer i en 50 milliliter falkerør. Vask dem en gang til og overfør dem til et 1,5 milliliter rør.Pellet ormene ved centrifugering ved 2,000 G i et minut. Eliminer det meste af supernatanten. Derefter nedsænkes røret i flydende nitrogen og rør ved minus 80 grader.Tø ca. 100 mikroliter frosne ormepiller, der tilhører N2, op, og tilsæt derefter 1,3 milliliter methanol. Derefter sonikere prøven i fire minutter. Efter sonikering tilsættes 1.000 ppb af den interne deutererede standard, 2,6 milliliter chloroform og 1,3 milliliter 0,5 kindtand kaliumchlorid, 0,08 molar fosforsyre til et endeligt forhold på 1 til 1.Vortex prøverne i et minut og derefter sonikere dem i et ultralydsvandbad i 15 minutter på is. Vortex prøverne igen to gange i et minut og centrifuge dem i 10 minutter ved 2, 000 G for at fremkalde fase adskillelse. Opsaml den nederste fase i et rent glasrør, tør det under kvælstof, og resuspend det i 100 mikroliter acetonitrile.For at opnå en vellykket kvantificering af den endogene 2-AG, var det nødvendigt at syntetisere det mættet analog ved hjælp af en tre trins metode. Bagefter blev det tilføjet til ormeprøver, udvundet og analyseret af højtydende flydende kromatografi, koblet til massespektrometri. Den syntetiske deutererede 1-AG, der blev brugt som en intern standard, var værktøjet til at kvantificere den endogene metabolit.Metoden blev optimeret ved hjælp af overgange til 2-AG og for deuterated 1-AG, hvor glycerol molekyler går tabt. 2-AG endogene fra C.elegans prøverne blev med succes opdaget og kvantificeret ved isotopfortynding med kemisk syntetiseret deuteriseret 1-AG ved hjælp af højtydende væskekromatografi koblet til massespektrometri. Prøve et blev udarbejdet med den deutererede standard 1-AG, mens prøve to uden standard.Da den oprindelige koncentration af deuteret standard i prøve 1 og 3 var på 1.000 ppb hver, er det fra toparealforholdet muligt at beregne den endogene koncentration af 2-AG i stikprøven på 340 ppb for prøve 1 og 360 ppb for prøve tre, hvilket giver et gennemsnit på 350 ppb. Forholdet blev beregnet som en kvalitet mellem de toppede områder på henholdsvis 2-AG og deuterated 1-AG for to isolerede prøver. Begge med den deutererede standard tilføjet tidligere til ekstraktion.I betragtning af den nyligt opdagede betydning af 2-AG i forbedringen af kolesterol handel og manglende oplysninger om, hvordan lipider påvirke denne proces, det var nødvendigt en pålidelig påvisning metode til denne endocannabinoide. Den vellykkede udvikling af en enkel og robust syntetisk metode rapporteret her for at opnå deuterated analog 2-AG var et vigtigt skridt i denne protokol. De fleste af de rapporterede metoder til kvantificering af monoacylglyceroler indebærer anvendelse af kommercielt tilgængelige analytiske standarder, som normalt er dyre og ustabile under regelmæssige opbevaringsforhold, hvilket gør dem utilgængelige for laboratorier med lavere budget.Men denne metode løser dette ved at foreslå en syntese af standarden ved hjælp af mere tilgængelige udgangsmaterialer. Den syntetiske metode er ligetil uden avancerede nødvendige forhold, hvilket gør den ideel til at blive udført i ethvert laboratorium med minimalt udstyr og adgang til reaktanter, selv i et reduceret budget. Sammenfattende beskriver denne nye procedure en ligetil og reproducerbar måde at opdage og kvantificere 2-AG på, som vil bidrage til at besvare nogle af de spørgsmål, der rejses efter beskrivelsen af disse endocannabinoiders rolle i kolesterolhandel med C.elegans.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantificering af overfloden og opladning niveauer af overførsel RNA'er i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetriske metode til måling af jernindhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plade-baserede storstilet dyrkning af Caenorhabditis elegans: forberedelse af prøver til undersøgelse af stofskifteforandringer i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantificering af coenzym A i celler og væv

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

I Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for studiet af proteininteraktioner i Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolering af aktiv caenorhabditis elegans nukleare ekstrakt og rekonstitution for In Vitro Transskription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...