Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door een onderzoeksbeurs van de Agencia Nacional de Promoción científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P. en B.H.C. zijn Fellows van CONICET. D.d.M. en G.R.L. zijn lid van de Onderzoeksafloop van CONICET. We zijn dankbaar Gonzalo Lamberto (INMET) voor LC-MS/MS analyse en nuttige discussie. Video-opnamen en bewerking is gedaan door Ramiro Ortega en María Soledad Casasola van Dirección de comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario in Rosario, Argentinië.

1.1-AG-d5 voorbereiding
Opmerking: voor het verkrijgen van 1-AG-d5 als een HDO interne standaard voor kwantificerings testen, volgt u het protocol zoals hieronder beschreven.
<ol><li>Differentiële bescherming<ol>
<li>Om primaire alcoholen alleen te beschermen, Voeg eerst 38 mg glycerol-d8 toe aan een 10 ml-reactie buis met behulp van een Pasteur-pipet en voeg een magnetische roerder toe.</li>
		<li>Voeg 5 mL watervrije dichloormethaan (DCM) toe met een 5 mL ...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence.">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li><li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms.">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine:+a+simple+model+for+a+complex+discipline.">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li><li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves.">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).</li><li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves.">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).</li><li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

Endocannabinoïden zijn een klasse van lipiden die betrokken zijn bij de regulatie van de Dauer formatie in C. elegans7. Specifieker, de synthese van meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFAs) is belangrijk voor de handel in cholesterol en de reproductieve ontwikkeling van wormen. Het wordt hier onthuld dat 2-AG, een arachidonzuur dat endocannabinoïde bevat, verantwoordelijk is voor het restituting van de Dauer larve tot zijn normale cyclus in wormen die een verminderd cholesterol metaboli...

Endocannabinoïden reguleren meerdere biologische processen in een verscheidenheid van organismen en worden bewaard lipide-mediatoren1. De eerste ontdekte en meest goed gekarakteriseerde endocannabinoïden zijn anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) en 2-Arachidonoyl glycerol (2-AG). Endocannabinoïden spelen vele kritische rollen, met inbegrip van degenen die betrokken zijn bij hersenen beloning systemen, evenals drugsverslaving, geheugen, stemming, en metabole processen2. AEA en 2-AG zijn alleen gesynthetiseerd wanneer nodig en hebben een korte levensduur, en ze worden afgebroken door transport eiwit heropname en hydrolyse3.
Het gebruik van diermodellen zoals Caenorhabditis elegans (C. elegans) is belangrijk geworden om te bestuderen van de grote verscheidenheid van biologische processen, met inbegrip van apoptosis, cel signalering, celcyclus, celpolariteit, genregulatie, metabolisme, veroudering, en Geslachtsbepaling4,5. Daarnaast is C. elegans een uitstekend model voor het bestuderen van de fysiologische rollen van meervoudig onverzadigde vetzuren (pufas). AEA is geïdentificeerd in C. elegans en wordt verlaagd onder dieet beperking6. Dit tekort verlengt de levensduur van de nematode door middel van een dieet restrictie mechanisme dat kan worden onderdrukt door suppletie met de endocannabinoïde. Onlangs werd ontdekt dat 2-AG en AEA spelen fundamentele rollen in de regulering van de cholesterol handel in C. elegans7. Nog belangrijker, er werd vastgesteld dat suppletie met exogene 2-AG Dauer arrestatie kan redden, die wordt veroorzaakt door de verminderde cholesterol handel in Niemann-Pick type C1 C. elegans mutanten.
Om een beter begrip van 2-AG de relatie met cholesterol handel en andere biologische processen in de nematode (dat wil zeggen, monoaminerge signalering, nociception en motoriek) te krijgen, is het cruciaal om deze endogene metaboliet te bestuderen en hoe het is beïnvloed onder bepaalde milieu-en dieet omstandigheden8,9,10,11,12,13. Daarom is het noodzakelijk om te ontwerpen en optimaliseren van een methode voor het opsporen en kwantificeren van endogene 2-AG in C. elegans dat is eenvoudig te gebruiken voor wetenschappers van verschillende gebieden, vooral degenen die het gedrag van de nematode in verband met deze bestuderen endocannabinoïde.
In 2008 slaagden Lethonen en collega's erin om 2-AG en AEA in C. elegans te identificeren met behulp van LC-MS analytische methoden14. In 2011 slaagden ze erin om deze techniek uit te breiden naar andere endocannabinoïden15. Meer recent werk toont andere analytische methoden die succesvol zijn geweest bij het opsporen en kwantificeren van endocannabinoïden in C. elegans, waaronder massaspectrometrie en GC-MS16,17,18, en het heeft ook is gemeld dat soortgelijke analytische methoden kunnen worden uitgebreid naar andere modellen19.
Eerder gemelde analysemethoden voor het kwantificeren van 2-AG in biologische monsters betreffen meestal het gebruik van HDO normen die commercieel worden verworven en die beschikbaar moeten zijn voor de aankoop20,21. Veel analytische normen voor LC-MS/MS kwantificering van endocannabinoïden zijn commercieel verkrijgbaar bij verschillende aanbieders. Niettemin, ze zijn duur, zijn gevoelig, en worden geoxideerd na verloop van tijd, als gevolg van de aanwezigheid van meerdere dubbele obligaties. De meest voorkomende versies van deze normen zijn gebaseerd op het OCTA-deuterated arachidonzuur en zijn geschikt voor kwantificering door isotoop verdunning LC-MS/MS14,22. Ook, de meeste van deze normen worden vervangen in positie 2 van de glycerol, waardoor ze instabiel onder de meeste omstandigheden, omdat ze gevoelig voor acyl migratie zijn19,23.
Om de moeilijkheden in verband met de kosten en stabiliteit van deze HDO normen te overwinnen, wordt een handige en eenvoudige methode voorgesteld om een analytische norm op basis van glycerol-d5voor te bereiden. De volgorde om de penta-deuterated standaard voor te bereiden vereist een drie stappen procedure die resulteert in de standaard 1-AG-d5, die stabiel is en geen acyl migratie ondergaat (het belangrijkste probleem bij het streven naar het synthetiseren van 2-monoacylglycerolen).
Het belangrijkste doel hier is om een eenvoudige en reproduceerbare methode te tonen voor het bestuderen van 2-AG in C. elegans, inclusief de synthese van de analytische HDO norm, bereiding en extractie van de nematode monsters, en analyse door LC-MS/MS (Figuur 1 ). Deze synthetische procedure is haalbaar zonder de geraffineerde organische synthese kennis of speciale apparatuur, waardoor het geschikt is voor wetenschappers van verschillende vakgebieden die C. elegans gedrag onder endocannabinoïde invloed bestuderen. De methode is ook uitbreidbaar naar andere studiemodellen, waardoor het nuttig is voor verschillende doelen. De standaard, bereid zoals hier gerapporteerd, is toegepast om met succes een snelle en betrouwbare chromatografische methode te ontwikkelen die een effectieve detectie en kwantificering van 2-AG op een reproduceerbare manier mogelijk maakt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

Dit werk presenteert een methode om een analytische standaard te bereiden voor het analyseren van 2-Arachidonoyl glycerol (2-AG) kwalitatief en kwantitatief door vloeistofchromatografie-elektro spray ionisatie-tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoïden zijn gecondengeerde lipide-bemiddel kers die meerdere biologische processen in verschillende organismen reguleren. In C. elegans, 2-AG is gebleken dat het bezitten van verschillende rollen, met inbegrip van de modulatie van Dauer vorming en cholesterol metabolisme. Dit verslag beschrijft een methode om de moeilijkheden te overwinnen die gepaard gaan met de kosten en stabiliteit van HDO normen die voor 2-AG kwantificering vereist zijn. De procedure voor de synthese van de standaard is eenvoudig en kan worden uitgevoerd in elk laboratorium, zonder de noodzaak voor organische synthese expertise of speciale apparatuur. Daarnaast wordt een wijziging van de methode van Folch om de HDO standaard uit de C. elegans -cultuur te extraheren beschreven. Tot slot wordt een kwantitatieve en analytische methode beschreven voor het detecteren van 2-AG met behulp van de stabiele isotopisch gelabelde analoge 1-AG-d5 , die betrouwbare resultaten oplevert in een snelle chromatografische uitvoering. De procedure is nuttig voor het bestuderen van de meerdere rollen van 2-AG in C. elegans terwijl ook van toepassing op andere studies van metabolieten in verschillende organismen.

Een isotopisch gelabelde analoog werd met succes gesynthetiseerd uit in de handel verkrijgbare d8-glycerol en arachidonzuur met behulp van een 3-Step synthetische methode (Figuur 2, Figuur 3). Deze stappen zijn eenvoudig en vereisen geen geavanceerde apparatuur, speciaal gecontroleerde omstandigheden of dure reagentia. Dus, deze methode is robuust en kan met succes worden uitgebreid tot synthetiseren van monoacylglycer...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Dit werk beschrijft een robuuste en ongecompliceerde methode om de endocannabinoïde 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegansop te sporen en te kwantificeren. Een analytische HDO standaard ons voorbereid en gebruikt voor de kwantificering van 2-AG door isotopen verdunning en vloeistofchromatografie-elektro spray ionisatie-tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS).

Synthese van een Deuterated norm voor de kwantificering van 2-arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Endocannabinoïden zijn geconserveerde lipidemedia mediators die meerdere biologische processen in een verscheidenheid van organismen reguleren. De eerste ontdekte endocannabinoïden zijn anandamide en 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. De nematode C.elegans is een krachtig diermodel om een grote verscheidenheid aan biologische processen te bestuderen.Onlangs ontdekten we dat 2-AG een fundamentele rol speelt bij de regulering van de cholesterolhandel in C.elegans. Daarom werd het noodzakelijk om een methode te ontwerpen en te optimaliseren om endogene 2-AG te bestuderen door detectie en kwantificering in C.elegans. Eerder gerapporteerde analysemethoden voor het kwantificeren van 2-AG in biologische monsters omvatten meestal het gebruik van gedeuterde normen die commercieel zijn verworven, zijn vereist om ze beschikbaar te hebben voor aankoop.Niettemin, ze zijn duur, en als gevolg van de aanwezigheid van meerdere dubbele obligaties, zijn gevoelig voor geoxideerd na verloop van tijd. De meest voorkomende versie van de normen zijn gebaseerd op de octadeuterated arachidonic zuur geschikt is voor kwantificering door isotoop verdunning, door vloeibare chromatografie, en achterste massa spectroscopie. Om de moeilijkheden in verband met de kosten en stabiliteit van de gedeuterated normen om 2-AG te kwantificeren te overwinnen, gebruikten we een handige en eenvoudige methode om een analytische standaard op basis van deuterium-5-glycerol voor te bereiden.De volgorde voor de voorbereiding van de pendeuterated standaard vereist een procedure van drie stappen. Mogelijk worden gehouden in de beschermde vorm totdat het nodig is. Het belangrijkste doel van dit werk is om een volledige methode te tonen om 2-AG in C.elegans te bestuderen van de synthese van de analytische deuterated standaard tot de voorbereiding en extractie van de nematodemonsters en ten slotte de analyse door vloeibare chromatografie en massaspectroscopie.Voor het verkrijgen van deuterated 1-AG als een deuterated interne standaard voor kwantificering testen volgen een drie stappen protocol. Om alleen primaire alcoholen te beschermen, voeg eerst 38 milligram glycerol deuterated aan een 10 milliliter reactiebuis met behulp van een Pasteur pipet en voeg een magnetische roerder. Voeg vervolgens vijf milliliter watervrije DCM toe met een Hamilton-spuit van vijf milliliter en vul de buis met droge stikstof om een inerte atmosfeer te geven.Bereid een bad met behulp van een ondiepe Dewar fles gevuld met gedestilleerd ethylacetaat. Vul de hermetisch gesloten reactiebuis in het bad en koel deze af door langzaam de toevoeging van vloeibare stikstof aan ethylacetaat toe te voegen totdat het oplosmiddel is bevroren. Let op, vloeistof kookt hevig bij kamertemperatuur en kan ernstige brandwonden veroorzaken bij contact met ogen en huid.Voeg vervolgens 54 milligram watervrije collidine toe met behulp van een Hamilton spuit. Let op, collidine is vluchtig en heeft een zeer sterke en onaangename geur. Bij 70 milligram terbutile-dimethyl-cetylchloride en roer alles gedurende drie uur bij min 78 graden op een magnetische roerder.Voeg twee milliliter pekel toe om de reactie te doven. Haal de oplossing met twee milliliter gedistilleerd dichloormethaan drie keer met behulp van een gescheiden trechter houden van de organische extracten elke keer. Combineer vervolgens de drie organische extracten en droog over natriumsulfaat.Zuiver het ruwe mengsel door kolomchromatografie met silicagel als de stationaire fase en een 10% toenemende hexaan ethylacetaat gradiënt vanaf 100% hexaan en afwerking met 100% ethylacetaat. Voor deze esterificatiestap voegt u 10 milligram van het product toe die eerder aan een 10 milliliter reactiebuis is vermeld met behulp van een Pasteur pippette en voeg een magnetische roerder toe. Voeg twee milliliter watervrije DCM met behulp van een vijf milliliter Hamilton spuit en vul de buis met droge stikstof om een inerte atmosfeer te geven.Koel de oplossing tot nul graden met behulp van een ijsbad. Advertentie 36 milligram arachidonic zuur met behulp van een multi-volume verstelbare micropipet en roer. Voeg vervolgens 15 milligram 40-methyl-aminopyridine toe en roer.Voeg 15 milligram diacylpropylcarbodiimid toe met behulp van een multi-volume verstelbare micropipet en roer. Voeg twee milliliter water toe om de reactie te blussen en haal de oplossing vervolgens drie keer met twee milliliter gedestilleerde DCM uit met behulp van een scheidingstrechter. Combineer de drie organische extracten en droog over natriumsulfaat, zuiver het ruwe mengsel door kolomchromatografie met behulp van silica gel als een stationaire fase een dan 10% toenemende hexaan ethylacetaat gradiënt vanaf 100%hexaan en afwerking met 50 50%hexaan ethylacetaat.Tot slot, voor de deprotectie stap, voeg 15 milligram van het eerder gesynthetiseerde product aan een 10 milliliter reactiebuis met behulp van een Pasteur pipet en voeg een magnetische roerder. Voeg twee milliliter watervrije tetrahydrofuran toe met behulp van een Hamilton-spuit van vijf milliliter en vul de buis met droge stikstof om een inerte atmosfeer te geven. Koel vervolgens de oplossing af tot nul graden met behulp van een ijsbad.Voeg 150 microliters drop-wise van een molaire oplossing van tetrabutylammonium fluoride in THF met behulp van een Hamilton spuit. Voeg na een uur twee milliliter water toe om de reactie te doven. Haal de oplossing met twee milliliter gedestilleerde DCM drie keer met behulp van een scheidingstrechter.Combineer de drie organische extracten en droog over natriumsulfaat. Voor de bleekprocedure, draai wormen op gezaaide zes centimeter NGM platen. Laat de worm groeien van twee tot drie dagen, zodat er veel eieren en gravid volwassenen op het bord.Zodra u veel eieren en volwassenen, giet vijf milliliter M9 op het bord. Met behulp van een glazen pipet, breng de wormen naar een 15 milliliter valk buis. Centrifuge de buis gedurende twee minuten op 2,000 G en pellet de wormen.Zuig het grootste deel van de M9 zonder de worm pellet te verstoren. Voeg drie milliliter bleekoplossing toe en meng de oplossing voorzichtig door ongeveer vijf minuten om te keren of totdat u een afname van het aantal intacte volwassen wormen ziet. Zodra de meeste lichamen zijn opgelost, centrifuge op 2,000 G gedurende een minuut.Zuig het grootste deel van de bleekoplossing zonder de wormpellet te verstoren. Voeg 15 milliliter M9 toe aan de buis en meng goed. Centrifuge weer op 2.000 G voor een minuut.Zuig het grootste deel van de M9 zonder de worm pellet te verstoren. Voor worm monster voorbereiding, laat N2 embryo's verkregen door bleken procedure had in 's nachts in M9 buffer op 20 graden. Oogst vervolgens gesynchroniseerde L1's door de buis twee minuten te centrifugeren op 2.000 G.Was de wormen nog een keer met M9-buffer en kwantificeer het aantal levende L1. Zaad ongeveer 10.000 wormen in NGM-platen met een milliliter OP 50 Escherichia coli eerder gedroogd.Broed de platen minstens 48 uur bij 20 graden tot de wormen het L4-stadium bereiken. Oogst de wormen met behulp van koude M9 buffer in een 50 milliliter valk buis. Was ze nog een keer en breng ze in een 1,5 milliliter buis.Pellet de wormen door centrifugatie op 2,000 G gedurende een minuut. Elimineer het grootste deel van de supernatant. Dompelen vervolgens de buis onder in vloeibare stikstof en roer bij min 80 graden.Ontdooi ongeveer 100 microliter bevroren wormpellets die behoren tot N2 en voeg vervolgens 1,3 milliliter methanol toe. Daarna, sonicate het monster voor vier minuten. Voeg na sonicatie 1.000 ppb van de interne deuterated norm, 2,6 milliliter chloroform en 1,3 milliliter van 0,5 molair kaliumchloride, 0,08 molar fosforzuur toe aan een definitieve verhouding van één op één.Vortex de monsters voor een minuut en vervolgens sonicate ze in een ultrasoon waterbad voor 15 minuten op ijs. Vortex de monsters opnieuw twee keer gedurende een minuut en centrifugeren ze gedurende 10 minuten op 2,000 G om fasescheiding te induceren. Verzamel de onderste fase in een schone glazen buis, droog het onder stikstof, en resuspend het in 100 microliter van acetonitril.Om een succesvolle kwantificering van de endogene 2-AG te bereiken, was het noodzakelijk om het verzadigde analoge te synthetiseren met behulp van een driestapsmethode. Daarna werd het toegevoegd aan wormmonsters, geëxtraheerd en geanalyseerd door hoogwaardige vloeibare chromatografie, gekoppeld aan massaspectrometrie. Gebruikt als een interne standaard, de synthetische deuterated 1-AG was het instrument om de endogene metaboliet kwantificeren.De methode werd geoptimaliseerd met behulp van de overgangen voor 2-AG en voor deuterated 1-AG waar glycerol moleculen verloren gaan. 2-AG endogene uit de C.elegans monsters werd met succes gedetecteerd en gekwantificeerd door isotopenverdunning met de chemisch gesynthetiseerde gedeuteriseerde 1-AG met behulp van high performance vloeibare chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie. Monster één werd bereid met de deuterated standaard 1-AG, terwijl monster twee zonder de norm.Aangezien de oorspronkelijke concentratie van de standaard in monster één en drie van 1,000 ppb per stuk bedroeg, is het uit de piekareaalverhouding mogelijk om de endogene concentratie van 2-AG te berekenen in het monster van 340 ppb voor monster één en 360 ppb voor monster drie, wat een gemiddelde van 350 ppb geeft. De verhoudingen werden berekend als een kwaliteit tussen de piekgebieden van respectievelijk 2-AG en dedeuterated 1-AG voor twee geïsoleerde monsters. Beide met de deuterated standaard toegevoegd voorafgaand aan de extractie.Gezien het onlangs ontdekte belang van 2-AG in de verbetering van de cholesterolhandel en het gebrek aan informatie over hoe lipiden dat proces beïnvloeden, was het noodzakelijk een betrouwbare detectiemethode voor deze endocannabinoïde. De succesvolle ontwikkeling van een eenvoudige en robuuste synthetische methode die hier wordt gerapporteerd om deuterated analoge 2-AG te verkrijgen was een belangrijke stap van dit protocol. De meeste van de gerapporteerde methoden voor het kwantificeren van monoacylglycerols omvatten het gebruik van commercieel beschikbare analytische normen, die meestal duur en instabiel zijn onder reguliere opslagomstandigheden, waardoor ze onbereikbaar zijn voor laboratoria met een lager budget.Deze methode lost dit echter op door een synthese van de standaard voor te stellen met behulp van meer toegankelijke uitgangsmaterialen. De synthetische methode is rechttoe rechtaan zonder geavanceerde omstandigheden nodig, waardoor het ideaal is om te worden uitgevoerd in elk laboratorium met minimale apparatuur en toegang tot reactanten, zelfs in een beperkt budget. Samengevat beschrijft deze nieuwe procedure een rechttoe rechtaan en reproduceerbare manier om 2-AG op te sporen en te kwantificeren, die zal helpen om een aantal van de vragen te beantwoorden die naar aanleiding van de beschrijving van de rol van deze endocannabinoïden bij de cholesterolhandel in C.elegans worden gesteld.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Een colorimetrische methode voor het meten van ijzergehalte in planten

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plaat gebaseerde grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans: bereiding van de monsters voor de studie van de metabole veranderingen bij Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kwantificering van co-enzym A in cellen en weefsels

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting voor de studie van eiwitinteracties in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolatie van actief caenorhabditis elegans nucleair extract en reconstitutie voor in vitro transcriptie

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...