Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
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Ces travaux ont été soutenus par une subvention de recherche de l'Agencia Nacional de Promocion Cient-fica y Tecnol-gica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P., et B.H.C. sont boursiers de CONICET. D.d.M. et G.R.L. sont membres de la carrière de recherche de CONICET. Nous remercions Gonzalo Lamberto (INMET) pour l'analyse LC-MS/MS et la discussion utile. Le tournage et le montage vidéo ont été réalisés par Ramiro Ortega et Maria Soledad Casasola de Direccion de Comunicacion de la Ciencia, Facultad de Ciencia Polàtica y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario à Rosario, Argentine.

1. 1-AG-d5 préparation
REMARQUE : Pour obtenir 1-AG-d5 comme norme interne diluée pour les tests de quantification, suivez le protocole comme détaillé ci-dessous.
<ol><li>Protection différentielle<ol>
<li>Pour protéger uniquement les alcools primaires, ajoutez d'abord 38 mg de glycérol-d8 à un tube de réaction de 10 ml à l'aide d'une pipette Pasteur et ajoutez un agitateur magnétique.</li>
		<li>Ajouter 5 ml de dichlorométhane anhydre (DCM) à l'a...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence.">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li><li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms.">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine:+a+simple+model+for+a+complex+discipline.">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li><li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves.">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).</li><li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves.">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).</li><li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

Les endocannabinoïdes sont une classe de lipides qui ont été impliqués dans la régulation de la formation dauer dans C. elegans7. Plus précisément, la synthèse des acides gras polyinsaturés (PUFA) est importante pour le trafic de cholestérol et le développement reproducteur des vers. Il est révélé ici que 2-AG, un acide arachidonique contenant de l'endocannabinoïde, est responsable de restituer la larve dauer à son cycle normal dans les vers qui ont altéré le métabolism...

Les endocannabinoïdes régulent plusieurs processus biologiques dans une variété d'organismes et sont des médiateurs lipidiques conservés1. Les premiers endocannabinoïdes découverts et les plus bien caractérisés sont l'anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) et le glycérol 2-arachidonoyl (2-AG). Les endocannabinoïdes jouent de nombreux rôles critiques, y compris ceux impliqués dans les systèmes de récompense du cerveau ainsi que la toxicomanie, la mémoire, l'humeur, et les processus métaboliques2. AEA et 2-AG ne sont synthétisés qu'en cas de besoin et ont une courte durée de vie, et ils sont dégradés par le transport de la reprise de protéines et de l'hydrolyse3.
L'utilisation de modèles animaux comme Caenorhabditis elegans (C. elegans) est devenue importante pour étudier la grande variété de processus biologiques, y compris l'apoptose, la signalisation cellulaire, le cycle cellulaire, la polarité cellulaire, la régulation des gènes, le métabolisme, le vieillissement, et la détermination du sexe4,5. En outre, C. elegans est un excellent modèle pour étudier les rôles physiologiques des acides gras polyinsaturés (PUFA). L'AEA a été identifiée chez C. elegans et est réduite en vertu de la restriction alimentaire6. Cette insuffisance prolonge la durée de vie du nématode par un mécanisme diététique de restriction qui peut être supprimé par la supplémentation avec l'endocannabinoïde. Récemment, il a été découvert que 2-AG et AEA jouent un rôle fondamental dans la réglementation du trafic de cholestérol dans C. elegans7. Plus important encore, il a été déterminé que la supplémentation avec exogène 2-AG peut sauver l'arrestation dauer, qui est causée par le trafic de cholestérol altéré dans Niemann-Pick type C1 C. elegans mutants.
Pour mieux comprendre la relation de 2-AG avec le trafic de cholestérol et d'autres processus biologiques dans le nématode (c.-à-d. la signalisation monoaminergique, la nociception et la locomotion), il est crucial d'étudier ce métabolite endogène et comment il est affectés dans certaines conditions environnementales et diététiques8,9,10,11,12,13. Par conséquent, il est impératif de concevoir et d'optimiser une méthode pour détecter et quantifier endogène 2-AG dans C. elegans qui est simple à utiliser pour les scientifiques de différents domaines, en particulier ceux qui étudient le comportement du nématode par rapport à cette endocannabinoïde.
En 2008, Lethonen et ses collègues ont réussi à identifier 2-AG et AEA dans C. elegans en utilisant les méthodes d'analyse LC-MS14. En 2011, ils ont réussi à étendre cette technique à d'autres endocannabinoïdes15. Des travaux plus récents ont montré d'autres méthodes analytiques qui ont réussi à détecter et à quantifier les endocannabinoïdes chez C. elegans, y compris la spectrométrie de masse et GC-MS16,17,18, et il a également signalé que des méthodes analytiques similaires peuvent être étendues à d'autres modèles19.
Les méthodes analytiques précédemment signalées utilisées pour quantifier le 2-AG dans les échantillons biologiques impliquent habituellement l'utilisation de normes diluées qui sont acquises commercialement et nécessitent une disponibilité pour l'achat20,21. De nombreuses normes analytiques pour la quantification des endocannabinoïdes LC-MS/MS sont disponibles dans le commerce auprès de différents fournisseurs. Néanmoins, ils sont chers, sont sensibles, et s'oxydent au fil du temps, en raison de la présence de multiples liaisons doubles. Les versions les plus courantes de ces normes sont basées sur l'acide arachidonique delué d'octa et conviennent à la quantification par dilution isotopique LC-MS/MS14,22. En outre, la plupart de ces normes sont substituées dans la position 2 du glycérol, les rendant instables dans la plupart des conditions puisqu'elles sont sujettes à la migration d'acyl19,23.
Pour surmonter les difficultés associées aux coûts et à la stabilité de ces normes deuterated, une méthode commode et simple est présentée pour préparer une norme analytique basée sur le glycérol-d5. La séquence pour préparer la norme penta-deuterated exige une procédure en trois étapes qui a comme conséquence la norme 1-AG-d5, qui est stable et ne subit pas la migration d'acyl (la question principale en visant à synthétiser 2-monoacylglycerols).
L'objectif principal ici est de montrer une méthode simple et reproductible pour étudier 2-AG dans C. elegans, y compris la synthèse de la norme analytique deuterated, la préparation et l'extraction des échantillons de nématode, et l'analyse par LC-MS/MS (Figure 1 ). Cette procédure synthétique est réalisable sans la connaissance sophistiquée de synthèse organique ou l'équipement spécial, le rendant approprié pour des scientifiques de différents domaines qui étudient le comportement de C. elegans sous l'influence endocannabinoïde. La méthode est également extensible à d'autres modèles d'étude, ce qui la rend utile pour différentes cibles. La norme, préparée comme indiqué ici, a été appliquée pour développer avec succès une méthode chromatographique rapide et fiable qui permet une détection efficace et la quantification de 2-AG d'une manière reproductible.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

Ce travail présente une méthode pour préparer une norme analytique pour analyser le glycérol 2-arachidonoyl (2-AG) qualitativement et quantitativement par la spectrométrie de masse d'ionisation-tandem de chromatographie-électrospray (LC-ESI-MS/MS). Les endocannabinoïdes sont des médiateurs lipidiques conservés qui régulent plusieurs processus biologiques dans une variété d'organismes. Dans C. elegans, 2-AG s'est avéré posséder différents rôles, y compris la modulation de la formation dauer et le métabolisme du cholestérol. Ce rapport décrit une méthode pour surmonter les difficultés associées aux coûts et à la stabilité des normes deuterated exigées pour la quantification de 2-AG. La procédure de synthèse de la norme est simple et peut être effectuée dans n'importe quel laboratoire, sans avoir besoin d'expertise en synthèse organique ou d'équipement spécial. En outre, une modification de la méthode de Folch pour extraire la norme deuterated de la culture de C. elegans est décrite. Enfin, une méthode quantitative et analytique pour détecter 2-AG à l'aide de l'analogue stable étiqueté isotopique 1-AG-d5 est décrite, ce qui fournit des résultats fiables dans une course à la chromatographie rapide. La procédure est utile pour étudier les rôles multiples de 2-AG dans C. elegans tout en étant applicable à d'autres études de métabolites dans différents organismes.

Un analogue isotopique étiqueté a été synthétisé avec succès à partir de 8-glycérol et acide arachidonique disponibles dans le commerce à l'aide d'une méthode synthétique en 3 étapes ( Figure2, Figure 3). Ces étapes sont simples et ne nécessitent pas d'équipement sophistiqué, des conditions spécialement contrôlées ou des réactifs coûteux. Ainsi, cette méthode est robuste et peut être prolongée ...

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Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Ce travail décrit une méthode robuste et simple pour détecter et quantifier l'endocannabinoïde 2-arachidonoylglycérol (2-AG) dans C. elegans. Une norme analytique délutée nous a préparé et utilisé pour la quantification de 2-AG par dilution isotopique et la spectrométrie de masse d'ionisation-tandem d'ionisation d'électrospray liquide (LC-ESI-MS/MS).

Synthèse d'une norme deuterated pour la quantification de 2-Arachidonoylglycerol à Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Les endocannabinoïdes sont des médiateurs lipidiques conservés qui régulent de multiples processus biologiques dans une variété d’organismes. Les premiers endocannabinoïdes découverts sont l’anandamide et le 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. Le nématode C.elegans est un modèle animal puissant pour étudier une grande variété de processus biologiques.Récemment, nous avons découvert que 2-AG joue un rôle fondamental dans la régulation du trafic de cholestérol chez C.elegans. C’est pourquoi il est devenu impératif de concevoir et d’optimiser une méthode d’étude de l’endogène 2-AG par détection et quantification chez C.elegans. Les méthodes d’analyse précédemment signalées pour quantifier 2-AG dans les échantillons biologiques impliquent habituellement l’utilisation de normes déroutées qui sont acquises commercialement sont nécessaires pour les avoir disponibles à l’achat.Néanmoins, ils sont coûteux, et en raison de la présence de multiples liaisons doubles, sont sensibles à s’oxyder au fil du temps. La version la plus courante des normes est basée sur l’acide arachidonique octadeuterated étant approprié pour la quantification par dilution d’isotope, par chromatographie liquide, et spectroscopie postérieure de masse. Pour surmonter les difficultés liées au coût et à la stabilité des normes de stérilisation pour quantifier 2-AG, nous avons utilisé une méthode pratique et simple pour préparer une norme analytique basée sur le deutérium-5-glycérol.La séquence de préparation de la norme pénétérite nécessite une procédure en trois étapes. Être possible d’être conservé sous la forme protégée jusqu’à ce qu’il soit nécessaire. L’objectif principal de ces travaux est de montrer une méthode complète pour étudier 2-AG dans C.elegans de la synthèse de la norme analytique stérilisée à la préparation et l’extraction des échantillons de nématodes et enfin, l’analyse par chromatographie liquide et spectroscopie de masse.Pour obtenir 1-AG stérilisé comme norme interne de stérilisation pour des analyses de quantification suivent un protocole en trois étapes. Afin de ne protéger que les alcools primaires, ajoutez d’abord 38 milligrammes de glycérol stérilisé à un tube de réaction de 10 millilitres à l’aide d’une pipette Pasteur et ajoutez un agitateur magnétique. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de DCM anhydre à l’aide d’une seringue Hamilton de cinq millilitres et remplissez le tube d’azote sec pour donner une atmosphère inerte.Préparer un bain à l’aide d’un flacon peu profond de Dewar rempli d’acétate d’éthyle distillé. Remplissez le tube de réaction hermétiquement fermé à l’intérieur du bain et refroidissez-le en ajoutant lentement l’azote liquide à l’acétate d’éthyle jusqu’à ce que le solvant soit congelé. Attention, le liquide bout violemment à température ambiante et peut causer de graves brûlures en cas de contact avec les yeux et la peau.Ensuite, ajouter 54 milligrammes de collidine anhydre à l’aide d’une seringue Hamilton. Attention, la collidine est volatile et a une odeur très forte et désagréable. À 70 milligrammes de terbutile-diméthyl-céylchlorure et remuer le tout pendant trois heures à moins 78 degrés sur un agitateur magnétique.Ajouter deux millilitres de saumure pour étancher la réaction. Extraire la solution avec deux millilitres de dichloromethane distillé trois fois à l’aide d’un entonnoir séparé gardant les extraits organiques à chaque fois. Ensuite, mélanger les trois extraits organiques et sécher sur de la sulfite de sodium.Purifier le mélange brut par chromatographie de colonne en utilisant le gel de silice comme phase stationnaire et un gradient d’acétate d’hexane éthylique augmentant de 100% à partir de 100% d’hexane et se terminant avec de l’acétate 100% éthylique. Pour cette étape d’estérification, ajouter 10 milligrammes du produit précédemment indiqué à un tube de réaction de 10 millilitres à l’aide d’une pippette Pasteur et ajouter un agitateur magnétique. Ajouter deux millilitres de DCM anhydre à l’aide d’une seringue Hamilton de cinq millilitres et remplir le tube d’azote sec pour donner une atmosphère inerte.Refroidir la solution à zéro degré à l’aide d’un bain de glace. Annonce 36 milligrammes d’acide arachidonique à l’aide d’une micropipette réglable à plusieurs volumes et remuer. Ajouter ensuite 15 milligrammes de 40-méthyl-aminopyridine et remuer.Ajouter 15 milligrammes de diacylpropylcarbodiimid à l’aide d’une micropipette réglable à plusieurs volumes et remuer. Ajouter deux millilitres d’eau pour étancher la réaction, puis extraire la solution avec deux millilitres de DCM distillé trois fois à l’aide d’un entonnoir séparateur. Combinez les trois extraits organiques et séchez sur la sulfite de sodium, purifiez le mélange brut par chromatographie de colonne utilisant le gel de silice comme phase stationnaire un gradient d’acétate d’éthyle puis 10% croissant à partir de 100% d’hexane et terminant avec 50 50% d’acétate d’éthyle hexane.Enfin, pour l’étape de dépprotection, ajouter 15 milligrammes du produit précédemment synthétisé à un tube de réaction de 10 millilitres à l’aide d’une pipette Pasteur et ajouter un agitateur magnétique. Ajouter deux millilitres de tétrahydrofuran anhydre à l’aide d’une seringue Hamilton de cinq millilitres et remplir le tube d’azote sec pour donner une atmosphère inerte. Ensuite, refroidir la solution à zéro degré à l’aide d’un bain de glace.Ajouter 150 microlitres drop-wise d’une solution molaire de fluorure de tétrabutylammonium dans THF à l’aide d’une seringue Hamilton. Après une heure, ajouter deux millilitres d’eau pour étancher la réaction. Extraire la solution avec deux millilitres distillés DCM trois fois à l’aide d’un entonnoir séparateur.Mélanger les trois extraits organiques et sécher sur de la sulfite de sodium. Pour la procédure de blanchiment, retourner les vers sur des plaques NGM ensemencées de six centimètres. Laissez le ver pousser de deux à trois jours afin qu’il y ait beaucoup d’œufs et d’adultes gravid dans l’assiette.Une fois que vous avez beaucoup d’œufs et d’adultes, versez cinq millilitres de M9 sur l’assiette. À l’aide d’une pipette en verre, transférer les vers dans un tube de faucon de 15 millilitres. Centrifuger le tube pendant deux minutes à 2000 G et pelleter les vers.Aspiration la plupart de la M9 sans déranger la pastille de ver. Ajoutez trois millilitres de solution de blanchiment et mélangez doucement la solution en inversant pendant environ cinq minutes ou jusqu’à ce que vous voyiez une diminution du nombre de vers adultes intacts. Une fois que la plupart des corps se sont dissous, centrifugeuse à 2000 G pendant une minute.Aspiration la plupart de la solution de blanchiment sans déranger la pastille de ver. Ajouter 15 millilitres de M9 au tube et bien mélanger. Centrifugeuse à nouveau à 2000 G pendant une minute.Aspiration la plupart de la M9 sans déranger la pastille de ver. Pour la préparation de l’échantillon de ver, laissez les embryons N2 obtenus par procédure de blanchiment avait dans la nuit dans M9 tampon à 20 degrés. Puis, récolte synchronisée L1s en centrifugant le tube deux minutes à 2000 G.Laver les vers avec M9 tampon une fois de plus et quantifier le nombre de L1 vivant. Ensemencer environ 10 000 vers dans les plaques NGM avec un millilitre d’OP 50 Escherichia coli préalablement séché.Incuber les plaques au moins pendant 48 heures à 20 degrés jusqu’à ce que les vers atteignent le stade L4. Récoltez les vers à l’aide d’un tampon M9 froid dans un tube de faucon de 50 millilitres. Lavez-les une fois de plus et transférez-les dans un tube de 1,5 millilitres.Pelleter les vers par centrifugation à 2000 G pendant une minute. Éliminez la plupart des supernatants. Ensuite, plonger le tube dans de l’azote liquide et remuer à moins 80 degrés.Décongeler environ 100 microlitres de granulés de vers congelés appartenant à N2, puis ajouter 1,3 millilitres de méthanol. Après cela, sonicate l’échantillon pendant quatre minutes. Après la sonication, ajouter 1000 ppb de la norme désotériorée interne, 2,6 millilitres de chloroforme, et 1,3 millilitres de 0,5 molaire de chlorure de potassium, 0,08 molaire d’acide phosphorique à un rapport final de un à un.Vortex les échantillons pendant une minute, puis sonicate dans un bain d’eau ultrasonique pendant 15 minutes sur la glace. Vortex les échantillons à nouveau deux fois pendant une minute et les centrifuger pendant 10 minutes à 2000 G pour induire la séparation de phase. Recueillir la phase inférieure dans un tube de verre propre, le sécher sous azote, et le resuspendre en 100 microlitres d’acétyltrile.Pour parvenir à une quantification réussie de l’endogène 2-AG, il était nécessaire de synthétiser son analogique saturé en utilisant une méthode en trois étapes. Par la suite, il a été ajouté à des échantillons de vers, extraits et analysés par chromatographie liquide haute performance, couplée à la spectrométrie de masse. Utilisé comme norme interne, le synthétique stérilisé 1-AG était l’outil pour quantifier le métabolite endogène.La méthode a été optimisée en utilisant les transitions pour 2-AG et pour 1-AG stérilisé où les molécules de glycérol sont perdues. 2-AG endogène des échantillons de C.elegans a été détecté avec succès et quantifié par dilution isotopique avec le 1-AG stérilisé chimiquement synthétisé utilisant la chromatographie liquide de haute performance couplée à la spectrométrie de masse. L’échantillon un a été préparé avec la norme 1-AG désutérée, tandis que l’échantillon deux sans la norme.Étant donné que la concentration initiale de la norme déutée dans l’échantillon un et trois était de 1 000 ppb chacun, à partir du rapport de zone maximale, il est possible de calculer la concentration endogène de 2-AG dans l’échantillon de 340 ppb pour l’échantillon un et de 360 ppb pour l’échantillon trois, ce qui donne une moyenne de 350 ppb. Les ratios ont été calculés comme une qualité entre les zones de pointe de 2-AG et de 1-AG stérilisé, respectivement, pour deux échantillons isolés. Les deux avec la norme stérilisé ajouté avant l’extraction.Compte tenu de l’importance récemment découverte de 2-AG dans l’amélioration du trafic de cholestérol et le manque d’information sur la façon dont les lipides influencent ce processus, il était nécessaire une méthode de détection fiable pour cet endocannabinoïde. Le développement réussi d’une méthode synthétique simple et robuste rapportée ici pour obtenir l’analogique stérilisé 2-AG était une étape clé de ce protocole. La plupart des méthodes signalées pour quantifier les monoacylglycérols impliquent l’utilisation de normes analytiques disponibles dans le commerce, qui sont généralement coûteuses et instables dans des conditions de stockage régulières, ce qui en fait un inaccessible pour les laboratoires à petit budget.Toutefois, cette méthode résout ce problème en proposant une synthèse de la norme à l’aide de matériaux de départ plus accessibles. La méthode synthétique est simple sans conditions sophistiquées nécessaires, ce qui le rend idéal pour être effectué dans n’importe quel laboratoire avec un équipement minimal et l’accès aux ré reactants, même dans un budget réduit. En résumé, cette nouvelle procédure décrit une façon simple et reproductible de détecter et de quantifier 2-AG qui aidera à répondre à certaines des questions soulevées après la description du rôle de ces endocannabinoïdes dans le trafic de cholestérol chez C.elegans.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

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Recherche

Biochimie

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Quantification de l’abondance et la recharge des niveaux d’ARN de transfert chez Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

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Une méthode Simple pour le criblage à haut débit chimique chez Caenorhabditis Elegans

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Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

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Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

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Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

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Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

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Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

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Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

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