Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium der Agencia Nacional de Promocién Cientéfica y Tecnol-gica (ANPCyT, PICT 2014-3693) unterstützt. J.F.d.L., G.P. und B.H.C. sind Fellows von CONICET. D.d.M. und G.R.L. sind Mitglieder der Forschungskarriere von CONICET. Wir danken Gonzalo Lamberto (INMET) für die LC-MS/MS Analyse und hilfreiche Diskussion. Die Videoaufnahmen und -bearbeitungen wurden von Ramiro Ortega und Maria Soledad Casasola von Direccién de Comunicacién de la Ciencia, Facultad de Ciencia Polética y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario in Rosario, Argentinien, durchgeführt.

1. 1-AG-d5 Zubereitung
HINWEIS: Um 1-AG-d5 als deuterated internen Standard für Quantifizierungstests zu erhalten, befolgen Sie das Protokoll wie unten beschrieben.
<ol><li>Differenziellschutz<ol>
<li>Um nur Primäralkohole zu schützen, fügen Sie zunächst 38 mg Glycerin-d8 mit einer Pasteur-Pipette in ein 10 ml-Reaktionsrohr und einen Magnetischen Rührer hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 5 ml wasserfreies Dichlormethan (DCM) mit einer 5 ml Hamilton Spritze hi...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence.">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li><li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms.">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine:+a+simple+model+for+a+complex+discipline.">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li><li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves.">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).</li><li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves.">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).</li><li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

Endocannabinoide sind eine Klasse von Lipiden, die in die Regulierung der Dauerbildung in C. elegans7verwickelt sind. Genauer gesagt ist die Synthese von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) wichtig für den Cholesterinhandel und die fortpflanzungsfördernde Entwicklung von Würmern. Hier zeigt sich, dass 2-AG, eine Arachidonsäure, die Endocannabinoid enthält, für die Wiederherstellung der Dauerlarve in ihrem normalen Zyklus bei Würmern verantwortlich ist, die den Cholesterinst...

Endocannabinoide regulieren mehrere biologische Prozesse in einer Vielzahl von Organismen und sind konservierte Lipidmediatoren1. Die ersten entdeckten und am besten charakterisierten Endocannabinoide sind Anandamid (Arachidonoylethanolamid, AEA) und 2-Arachidonoylglycerol (2-AG). Endocannabinoide spielen viele kritische Rollen, einschließlich derer in Gehirn BelohnungSysteme sowie Drogenabhängigkeit beteiligt, Speicher, Stimmung, und Stoffwechselprozesse2. AEA und 2-AG werden nur bei Bedarf synthetisiert und haben kurze Lebensdauern, und sie werden durch Transportproteinrückaufnahme und Hydrolyse3abgebaut.
Die Verwendung von Tiermodellen wie Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist wichtig geworden, um die große Vielfalt biologischer Prozesse zu untersuchen, einschließlich Apoptose, Zellsignalisierung, Zellzyklus, Zellpolarität, Genregulation, Stoffwechsel, Alterung, und Geschlechtsbestimmung4,5. Darüber hinaus ist C. elegans ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der physiologischen Rollen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs). AEA wurde in C. elegans identifiziert und wird unterDiät-Beschränkung6 reduziert. Dieser Mangel verlängert die Lebensdauer der Nematode durch einen diätetischen Restriktionsmechanismus, der durch Supplementierung mit dem Endocannabinoid unterdrückt werden kann. Kürzlich wurde entdeckt, dass 2-AG und AEA eine grundlegende Rolle bei der Regulierung des Cholesterinhandels in C. elegans7spielen. Noch wichtiger war, dass die Supplementierung mit exogenen 2-AG dauer arrest retten kann, die durch den beeinträchtigten Cholesterinhandel bei Niemann-Pick Typ C1 C. elegans Mutanten verursacht wird.
Um ein besseres Verständnis der Beziehung der 2-AG zum Cholesterinhandel und anderen biologischen Prozessen im Nematode (d. h. monoaminergische Signalisierung, Nozieption und Fortbewegung) zu erlangen, ist es entscheidend, diesen endogene Metaboliten zu untersuchen und wie er unter bestimmten Umwelt- und Ernährungsbedingungen betroffen8,9,10,11,12,13. Daher ist es unerlässlich, eine Methode zur Erkennung und Quantifizierung von endogenen 2-AG in C. elegans zu entwerfen und zu optimieren, die für Wissenschaftler verschiedener Bereiche einfach zu verwenden ist, insbesondere für diejenigen, die das Verhalten der Nematode in Bezug auf diese Endocannabinoid.
2008 gelang es Lethonen und Kollegen, 2-AG und AEA in C. elegans mit LC-MS-Analysemethoden zu identifizieren14. Im Jahr 2011 gelang es ihnen, diese Technik auf andere Endocannabinoide zu erweitern15. Neuere Arbeiten haben andere analytische Methoden gezeigt, die erfolgreich bei der Detektion und Quantifizierung von Endocannabinoiden in C. elegans,einschließlich Massenspektrometrie und GC-MS16,17,18, und es hat es wurde auch berichtet, dass ähnliche Analysemethoden auf andere Modelle erweitert werden können19.
Zuvor gemeldete Analysemethoden zur Quantifizierung von 2-AG in biologischen Proben beinhalten in der Regel die Verwendung von deuterated Standards, die kommerziell erworben werden und Verfügbarkeit für den Kauf erfordern20,21. Viele analytische Standards für die LC-MS/MS-Quantifizierung von Endocannabinoiden sind von verschiedenen Anbietern kommerziell erhältlich. Dennoch sind sie teuer, sind empfindlich und oxidieren im Laufe der Zeit, aufgrund des Vorhandenseins mehrerer Doppelbindungen. Die gängigsten Versionen dieser Normen basieren auf der octa-deuterated arachidonsäure und sind für die Quantifizierung durch Isotopverdünnung LC-MS/MS14,22geeignet. Auch, die meisten dieser Standards sind in Position 2 des Glycerins ersetzt, so dass sie unter den meisten Bedingungen instabil sind, da sie anfällig für Acylmigrationsind 19,23.
Um die Schwierigkeiten zu überwinden, die mit den Kosten und der Stabilität dieser deuterated Standards verbunden sind, wird eine bequeme und einfache Methode zur Vorbereitung eines analytischen Standards auf der Grundlage von Glycerin-d5vorgestellt. Die Reihenfolge zur Vorbereitung des penta-deuterated-Standards erfordert ein dreistufiges Verfahren, das zu dem Standard 1-AG-d5führt, das stabil ist und keiner Acylmigration unterzogen wird (das Hauptproblem bei der Synthese von 2-Monoacylglycerolen).
Das Hauptziel besteht darin, eine einfache und reproduzierbare Methode zur Untersuchung von 2-AG in C. eleganszu zeigen, einschließlich der Synthese des analytischen deuterated Standards, der Herstellung und Extraktion der Nematodenproben und der Analyse durch LC-MS/MS (Abbildung 1 ). Dieses synthetische Verfahren ist ohne das ausgeklügelte organische Synthesewissen oder spezielle Ausrüstung erreichbar, so dass es für Wissenschaftler aus verschiedenen Bereichen geeignet ist, die das Verhalten von C. elegans unter endocannabinoidem Einfluss untersuchen. Die Methode ist auch auf andere Studienmodelle erweiterbar, was sie für verschiedene Ziele nützlich macht. Die hier erstellte Norm wurde angewendet, um erfolgreich ein schnelles und zuverlässiges chromatographisches Verfahren zu entwickeln, das eine effektive Detektion und Quantifizierung von 2-AG in reproduzierbarer Weise ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

Diese Arbeit stellt eine Methode zur Vorbereitung eines analytischen Standards zur qualitativen und quantitativen Analyse von 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) durch Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) dar. Endocannabinoide sind konservierte Lipidmediatoren, die mehrere biologische Prozesse in einer Vielzahl von Organismen regulieren. Bei C. elegans, 2-AG wurde festgestellt, dass verschiedene Rollen besitzen, einschließlich Modulation der Dauerbildung und Cholesterinstoffwechsel. Dieser Bericht beschreibt eine Methode, um die Schwierigkeiten zu überwinden, die mit den Kosten und der Stabilität der deuterated Standards verbunden sind, die für die Quantifizierung der 2-AG erforderlich sind. Das Verfahren zur Synthese der Norm ist einfach und kann in jedem Labor durchgeführt werden, ohne dass organische Synthese-Expertise oder spezielle Ausrüstung erforderlich ist. Darüber hinaus wird eine Änderung der Folch-Methode beschrieben, um den deuterated Standard aus der C. elegans-Kultur zu extrahieren. Schließlich wird eine quantitative und analytische Methode zur Detektion von 2-AG mit dem stabilen isotopisch beschrifteten Analog 1-AG-d5 beschrieben, das zuverlässige Ergebnisse in einem schnell-chromatographischen Lauf liefert. Das Verfahren ist nützlich, um die vielfältigen Rollen der 2-AG in C. elegans zu untersuchen und gleichzeitig auf andere Untersuchungen von Metaboliten in verschiedenen Organismen anwendbar zu sein.

Ein isotopisch beschriftetes Analogon wurde erfolgreich aus handelsüblichen d 8-Glycerin und Arachidonsäure mit einem 3-stufigen synthetischen Verfahren synthetisiert (Abbildung 2, Abbildung 3). Diese Schritte sind einfach und erfordern keine ausgeklügelte Ausrüstung, speziell kontrollierte Bedingungen oder teure Reagenzien. Somit ist diese Methode robust und kann erfolgreich erweitert werden, um Monoacylglyceride ...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Diese Arbeit beschreibt eine robuste und unkomplizierte Methode, um das Endocannabinoid 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) in C. eleganszu erkennen und zu quantifizieren. Ein analytischer deuterated Standard hat wir vorbereitet und für die Quantifizierung von 2-AG durch Isotopverdünnung und Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) verwendet.

Synthese eines deuterated Standards zur Quantifizierung von 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Endocannabinoide sind konservierte Lipidmediatoren, die mehrere biologische Prozesse in einer Vielzahl von Organismen regulieren. Die ersten entdeckten Endocannabinoide sind Anandamid und 2-Arachidonoylglycerol, 2-AG. Die Nematode C.elegans ist ein leistungsfähiges Tiermodell, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen zu studieren.Kürzlich haben wir festgestellt, dass die 2-AG eine grundlegende Rolle bei der Regulierung des Cholesterinhandels in C.elegans spielt. Aus diesem Grund wurde es zwingend erforderlich, eine Methode zur Untersuchung der endogenen 2-AG durch Nachweis und Quantifizierung in C.elegans zu entwerfen und zu optimieren. Zuvor gemeldete Analysemethoden zur Quantifizierung von 2-AG in biologischen Proben beinhalten in der Regel die Verwendung von deuterated Standards, die kommerziell erworben werden müssen, um sie zum Kauf zur Verfügung zu haben.Dennoch sind sie teuer, und aufgrund des Vorhandenseins von mehreren Doppelbindungen, sind empfindlich, um im Laufe der Zeit oxidiert zu werden. Die gängigste Version der Normen basiert auf der octadeuterated arachidonsäure, die für die Quantifizierung durch Isotopenverdünnung, durch Flüssigchromatographie und hintere Massenspektroskopie geeignet ist. Um die Mitkosten und Stabilität der deuterated Standards zur Quantifizierung von 2-AG zu überwinden, haben wir eine bequeme und einfache Methode verwendet, um einen analytischen Standard auf der Grundlage von Deuterium-5-Glycerin vorzubereiten.Die Reihenfolge zur Vorbereitung des gepeuteten Standards erfordert ein dreimonatiges Verfahren. Die Möglichkeit, in der geschützten Form zu halten, bis es benötigt wird. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, eine vollständige Methode zur Untersuchung von 2-AG in C.elegans von der Synthese des analytischen deuterated Standard über die Herstellung und Extraktion der Nematodenproben und schließlich die Analyse durch Flüssigchromatographie und Massenspektroskopie zu zeigen.Zur Gewinnung von deuterated 1-AG als deuterated interner Standard für Quantifizierungstests folgen Sie einem dreistufigen Protokoll. Um nur Primäralkohole zu schützen, fügen Sie zunächst 38 Milligramm Glycerin, das mit einer Pasteurpipette zu einem 10-Milliliter-Reaktionsrohr deuteriert wird, und fügen Sie einen magnetischen Rührer hinzu. Als nächstes fügen Sie fünf Milliliter wasserfreies DCM mit einer Fünf-Milliliter Hamilton-Spritze hinzu und füllen Sie das Rohr mit trockenem Stickstoff, um eine inerte Atmosphäre zu geben.Bereiten Sie ein Bad mit einem flachen Dewar-Kolben mit destilliertem Ethylacetat gefüllt. Füllen Sie das hermetisch geschlossene Reaktionsrohr im Bad und kühlen Sie es, indem Sie den zusetzenden flüssigen Stickstoff zu Ethylacetat langsam abkühlen, bis das Lösungsmittel eingefroren ist. Vorsicht, Flüssigkeit kocht bei Raumtemperatur heftig und kann bei Kontakt mit Augen und Haut zu schweren Verbrennungen führen.Als nächstes fügen Sie 54 Milligramm wasserfreies Collidine mit einer Hamilton-Spritze hinzu. Vorsicht, Collidine ist flüchtig und hat einen sehr starken und unangenehmen Geruch. Bei 70 Milligramm Terbutil-Dimethyl-Cetylchlorid und rühren alles für drei Stunden bei minus 78 Grad auf einem magnetischen Rührer.Fügen Sie zwei Milliliter Sole hinzu, um die Reaktion zu löschen. Extrahieren Sie die Lösung mit zwei Milliliterdestilliertem Dichlormethan dreimal mit einem getrennten Trichter, der die organischen Extrakte jedes Mal hält. Dann die drei organischen Extrakte kombinieren und über Natriumsulfit trocknen.Reinigen Sie das Rohgemisch durch Säulenchromatographie mit Kieselgel als stationäre reine Phase und einem 10%steigenden Hexanethylacetatgradienten ab 100% Hexan und Endbearbeitung mit 100%ethylacetat. Für diesen Veresterungsschritt 10 Milligramm des zuvor angegebenen Produkts zu einem 10-Milliliter-Reaktionsrohr mit einem Pasteur Pippette hinzufügen und einen magnetischen Rührer hinzufügen. Fügen Sie zwei Milliliter wasserfreies DCM mit einer Fünf-Milliliter Hamilton-Spritze hinzu und füllen Sie das Rohr mit trockenem Stickstoff, um eine inerte Atmosphäre zu erhalten.Kühlen Sie die Lösung mit einem Eisbad auf null Grad. Ad 36 Milligramm Arachidonsäure mit einer multi-Volume einstellbaren Mikropipette und rühren. Dann 15 Milligramm 40-Methyl-Aminopyridin hinzufügen und rühren.Fügen Sie 15 Milligramm Diacylpropylcarbodiimid mit einer multi-Volume einstellbaren Mikropipette und rühren. Fügen Sie zwei Milliliter Wasser hinzu, um die Reaktion zu löschen und extrahieren Sie die Lösung dann mit zwei Millilitern destilliertem DCM dreimal mit einem Trenntrichter. Kombinieren Sie die drei organischen Extrakte und trocknen Sie über Natriumsulfit, reinigen Sie die Rohmischung durch Säulenchromatographie mit Kieselgel als stationäre Phase und dann 10%erhöhender Hexan-Ethylacetat-Gradient ab 100%Hexan und beenden mit 50 50%Hexan-Ethylacetat.Zum Deprotection-Schritt 15 Milligramm des zuvor synthetisierten Produkts mit einer Pasteur-Pipette in ein 10 Milliliter-Reaktionsrohr geben und einen Magnetrührer hinzufügen. Fügen Sie zwei Milliliter wasserfreies Tetrahydrofuran mit einer fünf Milliliter Hamilton Spritze und füllen Sie das Rohr mit trockenem Stickstoff, um eine inerte Atmosphäre zu geben. Dann kühlen Sie die Lösung auf null Grad mit einem Eisbad.Fügen Sie 150 Mikroliter tropfenweise von einer molaren Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in THF mit einer Hamilton-Spritze hinzu. Nach einer Stunde zwei Milliliter Wasser hinzufügen, um die Reaktion zu löschen. Extrahieren Sie die Lösung mit zwei Millilitern destillierten DCM dreimal mit einem Trenntrichter.Kombinieren Sie die drei organischen Extrakte und trocknen Sie über Natriumsulfit. Für das Bleichverfahren Würmer auf gesäte sechs Zentimeter NGM-Platten drehen. Lassen Sie den Wurm von zwei bis drei Tagen wachsen, so dass es viele Eier und gravid Erwachsene auf dem Teller.Sobald Sie viele Eier und Erwachsene haben, gießen Sie fünf Milliliter M9 auf den Teller. Mit einer Glaspipette die Würmer in ein 15 Milliliter Falkenrohr geben. Zentrifugieren Sie das Rohr für zwei Minuten bei 2.000 G und pellet die Würmer.Saugen Sie den größten Teil des M9, ohne das Schneckenpellet zu stören. Fügen Sie drei Milliliter Bleichlösung hinzu und mischen Sie die Lösung vorsichtig, indem Sie etwa fünf Minuten invertieren oder bis Sie eine Abnahme der Anzahl intakter würmer sehen. Sobald sich die meisten Körper aufgelöst haben, zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 2.000 G.Absaugen Sie den größten Teil der Bleichlösung, ohne das Schneckenpellet zu stören. 15 Milliliter M9 in die Röhre geben und gut mischen. Zentrifugieren Sie wieder bei 2.000 G für eine Minute.Saugen Sie den größten Teil des M9, ohne das Schneckenpellet zu stören. Zur Herstellung von Schneckenproben ließen N2-Embryonen, die durch Bleichen erhalten wurden, über Nacht im M9-Puffer bei 20 Grad. Dann, Ernte synchronisiert L1s durch Zentrifugieren der Röhre zwei Minuten bei 2 000 G.Wash die Würmer mit M9 Puffer ein anderes Mal und quantifizieren die Anzahl der live L1. Samen etwa 10.000 Würmer in NGM-Platten mit einem Milliliter OP 50 Escherichia coli zuvor getrocknet.Inkubieren Sie die Platten mindestens für 48 Stunden bei 20 Grad, bis die Würmer die L4-Stufe erreichen. Ernten Sie die Würmer mit kaltem M9-Puffer in einem 50 Milliliter Falkenrohr. Waschen Sie sie noch einmal und übertragen Sie sie in ein 1,5 Milliliter Rohr.Pellet die Würmer durch Zentrifugation bei 2.000 G für eine Minute. Beseitigen Sie den größten Teil des Überstandes. Dann tauchen Sie die Röhre in flüssigen Stickstoff und rühren bei minus 80 Grad.Etwa 100 Mikroliter gefrorene N2-Wurmpellets auftauen und dann 1,3 Milliliter Methanol hinzufügen. Danach die Probe vier Minuten lang beschallen. Nach der Beschallung 1 000 ppb des internen deuterated Standards, 2,6 Milliliter Chloroform und 1,3 Milliliter 0,5 Mol Kaliumchlorid, 0,08 Mol Phosphorsäure zu einem Endverhältnis von eins zu eins hinzufügen.Wirbeln Sie die Proben für eine Minute und beschallen Sie sie dann in einem Ultraschall-Wasserbad für 15 Minuten auf Eis. Wirbeln Sie die Proben zweimal für eine Minute und zentrifugieren Sie sie für 10 Minuten bei 2.000 G, um eine Phasentrennung zu induzieren. Die untere Phase in ein sauberes Glasrohr einsammeln, unter Stickstoff trocknen und in 100 Mikroliter Acetonitril wieder aufhängen.Um eine erfolgreiche Quantifizierung der endogenen 2-AG zu erreichen, war es notwendig, ihre gesättigte Analogie mit einer dreistufigen Methode zu synthetisieren. Anschließend wurde es Wurmproben hinzugefügt, extrahiert und analysiert durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, gekoppelt an Massenspektrometrie. Als interner Standard wurde die synthetisch deuterated 1-AG verwendet, um den endogenen Metaboliten zu quantifizieren.Das Verfahren wurde mit den Übergängen für 2-AG und für deuterated 1-AG optimiert, bei denen Glyzerinmoleküle verloren gehen. 2-AG endogen aus den C.elegans Proben wurde erfolgreich nachgewiesen und durch Isotopverdünnung mit der chemisch synthetisierten deuterisierten 1-AG mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt an Massenspektrometrie quantifiziert. Probe eins wurde mit der deuterated Standard 1-AG hergestellt, während Probe zwei ohne Denstandard.Da die ursprüngliche Konzentration des deutrated Standards in der Probe eins und drei bei jeweils 1 000 ppb lag, ist es aus dem Spitzenflächenverhältnis möglich, die endogene Konzentration von 2-AG in der Probe von 340 ppb für Probe eins und 360 ppb für Probe drei zu berechnen, was einem Durchschnitt von 350 ppb entspricht. Die Verhältnisse wurden als Qualität zwischen den Spitzenflächen von 2-AG bzw. deuterated 1-AG für zwei isolierte Proben berechnet. Beide mit dem deuterated Standard vor der Extraktion hinzugefügt.Angesichts der kürzlich entdeckten Bedeutung der 2-AG für die Verbesserung des Cholesterinhandels und des Mangels an Informationen darüber, wie Lipide diesen Prozess beeinflussen, war es notwendig, eine zuverlässige Nachweismethode für dieses Endocannabinoid zu entwickeln. Die erfolgreiche Entwicklung einer einfachen und robusten synthetischen Methode, die hier berichtet wurde, um deuterated analog 2-AG zu erhalten, war ein wichtiger Schritt dieses Protokolls. Die meisten der gemeldeten Methoden zur Quantifizierung von Monoacylglycerolen beinhalten die Verwendung kommerziell verfügbarer analytischer Standards, die in der Regel teuer und instabil unter regelmäßigen Lagerungsbedingungen sind, was sie zu einem unerreichbaren für Laboratorien mit niedrigerem Budget macht.Diese Methode löst dies jedoch, indem sie eine Synthese des Standards unter Verwendung leichter zugänglicher Ausgangsmaterialien vorschlägt. Die synthetische Methode ist geradlinig ohne ausgeklügelte Bedingungen erforderlich, so dass es ideal in jedem Labor mit minimaler Ausrüstung und Zugang zu Reaktanten durchgeführt werden, auch in einem reduzierten Budget. Zusammenfassend beschreibt dieses neue Verfahren eine geradlinige und reproduzierbare Art und Weise, 2-AG zu erkennen und zu quantifizieren, die helfen wird, einige der Fragen zu beantworten, die nach der Beschreibung der Rolle dieser Endocannabinoide beim Cholesterinhandel in C.elegans aufgeworfen wurden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Ein kolorimetrischen Verfahren zur Messung der Eisengehalt in Pflanzen

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Platte-basierte Large-Scale Anbau von Caenorhabditis Elegans: Probenvorbereitung für die Studie von Stoffwechselveränderungen bei Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Quantifizierung von Coenzym A in Zellen und Geweben

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting zur Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen bei Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolierung von aktivem Caenorhabditis elegans Kernextrakt und Rekonstitution für in vitro Transkription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...