Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענק מחקר של הסוכנות הלאומי Tecnológica y של המחקר (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., פ, ו B.H.C. הם ברנשים מ CONICET. D.d.M. ו G.R.L. הם חברי הקריירה המחקר של CONICET. אנו מודים לגונזלו לאמברטו (INMET) עבור ניתוח LC-MS/MS ודיון מועיל. הירי והעריכה של וידאו נעשה על ידי רמירו אורטגה ומריה סולאסולה Casasola מכיוון הבימוי של האופרה דה לה סינסיה, Faculøy דה Ciencia לראנוטיקה הביננייונאלס, אוניברסיהנאסיונאל דה רוסאריו ברוסאריו, ארגנטינה.

1.1-AG-d5 הכנה
הערה: לקבלת 1-AG-d5 כסטנדרט פנימי שניוני עבור כימות הכמת, בצע את הפרוטוקול כמפורט להלן.
<ol><li>הגנה דיפרנציאלית<ol>
<li>רק כדי להגן על האלכוהול הראשי, ראשית להוסיף 38 מ"ג של גליצרול-d8 כדי צינור התגובה 10 מ ל באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף מערבב מגנטי.</li>
		<li>הוסף ...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence.">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li><li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms.">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine:+a+simple+model+for+a+complex+discipline.">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li><li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves.">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).</li><li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves.">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).</li><li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

אנדוקנבינואידים הם מחלקה של שומנים כי היו מעורבים בוויסות של היווצרות dauer ב -C. אלגיה7. באופן ספציפי יותר, סינתזה של חומצות שומן רב בלתי רווי (PUFAs) חשוב עבור סחר בכולסטרול ואת התפתחות הרבייה של תולעים. הוא נחשף כאן 2-AG, חומצה ארכידונית המכילה אנדוקאנביאיד, אחראי על restituting הזחל ...

אנדוקאנבינואידים לווסת תהליכים ביולוגיים מרובים במגוון של אורגניזמים הם שמרו מגשרים השומנים1. הגילוי הראשון והטוב ביותר המאופיין באנדוקאנבינואידים הם אנאנדאמיד (ארכאדונאוליטהלתנולאמיד, איה) ו-2-ארכאיקסיקסיל גליצרול (2-AG). אנדוקאנבינואידים לשחק תפקידים קריטיים רבים, כולל אלה המעורבים במערכות תגמול המוח, כמו גם התמכרות לסמים, זיכרון, מצב רוח, ותהליכים מטבוליים2. איה ו-2-AG הם רק מסונתז בעת הצורך ויש להם חיים קצרים משתרע, והם מושפל דרך חלבון התחבורה ספיגה חוזרת הידרוליזה3.
השימוש במודלים של בעלי חיים כמו האלמרנים (C. אלגיה) הפך חשוב ללמוד את המגוון הגדול של תהליכים ביולוגיים כולל אפופטוזיס, איתות תא, מחזור התא, קוטביות התא, תקנה גנים, חילוף חומרים, הזדקנות, וקביעת מין4,5. בנוסף, הג הוא מודל מצוין לחקר התפקידים הפיזיולוגיים של חומצות שומן רב בלתי רוויות (pufas). איה זוהתה ב -C. אלגיה ומצטמצמת תחת הגבלת תזונה6. מחסור זה מרחיב את תוחלת החיים של נמטודות באמצעות מנגנון הגבלה תזונתיים שניתן לדכא על ידי תוספת עם אנדוקאנביאיד. לאחרונה, נתגלה כי 2-AG ו-איה משחקים תפקידים בסיסיים בוויסות סחר בכולסטרול בג7. חשוב מכך, נקבע כי התוספת עם אקסוגני 2-AG יכול להציל את מעצר דאואר, אשר נגרמת על ידי סחר הכולסטרול לקוי של נימן לבחור סוג C1 C. אלגיה מוטציות.
כדי להשיג הבנה טובה יותר של יחסי 2-AG עם סחר בכולסטרול ותהליכים ביולוגיים אחרים ב נמטודות (כלומר, איתות monoaminergic, נוקטונזיה ו תנועה), זה חיוני לחקור את המטסוגזה אנדודוגלי ואיך זה מושפע בתנאים סביבתיים ותזונתיים מסוימים8,9,10,11,12,13. לכן, זה הכרחי לעצב ולמטב את השיטה כדי לזהות ולכמת אנדוגני 2-AG ב C. אלגיה כי הוא פשוט לשימוש עבור מדענים של שדות שונים, במיוחד אלה הלומדים את התנהגותו של nematode ביחס זה . בסדר, אנדוקנביאיד
בשנת 2008, לטונטן ועמיתים לעבודה הצליחו לזהות 2-AG ו -"איה" ב-C. אלגיה באמצעות שיטות אנליטיות LC-MS14. ב 2011, הם הצליחו להרחיב את הטכניקה הזאת לאנדוקנבינואידים אחרים15. העבודה האחרונה הראתה שיטות אנליטיות אחרות אשר הצליחו באיתור וכימות אנדוקנבינואידים ב -C. אלגיה, כולל ספקטרומטר מסה ו-GC-MS16,17,18, והוא חייב דווח גם כי ניתן להרחיב שיטות אנליטיות דומות למודלים אחרים19.
בעבר דיווחו שיטות אנליטיות המשמשות לכימות 2-AG בדגימות ביולוגיות כוללות בדרך כלל את השימוש בתקנים דאוטים הנרכשים מסחרית ודורשים זמינות לרכישה20,21. סטנדרטים אנליטיים רבים עבור כימות LC-MS/MS של אנדוקאנבינואידים הם זמינים מסחרית מספקים שונים. עם זאת, הם יקרים, רגישים, ולהיות תחמוצת לאורך זמן, עקב נוכחות של איגרות חוב כפולות מרובות. הגרסאות השכיחות ביותר של תקנים אלה מבוססים על החומצה הארכידונית של octa-שניוני ומתאימות לקוונפיקציה על ידי דילול האיזוטופ LC-ms/ms14,22. כמו כן, רוב הסטנדרטים הללו מוחלף במיקום 2 של גליצרול, מה שהופך אותם לא יציבים ברוב התנאים מאז הם נוטים הגירה acyl19,23.
כדי להתגבר על הקשיים הקשורים לעלויות וליציבות של הסטנדרטים הללו, שיטה נוחה ופשוטה מוצגת להכנת תקן אנליטי המבוסס על גליצרול-d5. הרצף שמטרתו להכין את התקן המחומש מחייב הליך שלושה שלבים התוצאתו תקן 1-AG-d5, אשר יציב ואינו עובר הגירה acyl (הבעיה העיקרית כאשר מכוון לסנתז 2-monoacylglycerols).
המטרה העיקרית כאן היא להראות שיטה פשוטה ומנויית ללמוד 2-AG ב -C. אלגיה, כולל סינתזה של תקן הניתוח האנליטי, ההכנה והחילוץ של דגימות נמטודות, וניתוח על ידי LC-ms/MS (איור 1 ). הליך סינתטי זה הוא השגה ללא הידע סינתזה אורגני מתוחכם או ציוד מיוחד, מה שהופך אותו מתאים למדענים מתחומים שונים אשר לומדים את ההתנהגות C. אלגיה תחת השפעה אנדוקנביאיד. השיטה גם ניתנת להרחבה לדגמי מחקר אחרים, מה שהופך אותו לשימושי עבור מטרות שונות. התקן, שהוכן כפי שדווח כאן, הוחל בהצלחה לפתח שיטת כרומטוגרפית מהירה ואמינה המאפשרת זיהוי וכימות יעילים של 2-AG באופן שאינו מתפקד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

עבודה זו מציגה שיטה להכנת תקן אנליטי לניתוח 2-ארכאיקסיקסיל (2-AG) באיכות ובכמת של נוזלים כרומטוגרפיה-אלקטרולינון-ספקטרוגרפית מאסיבית (LC-ESI-MS/MS). אנדוקנבינואידים נשמרים מתווכים השומנים המסדירים תהליכים ביולוגיים מרובים במגוון של אורגניזמים. ב C. אלגיה, 2-AG נמצא בעלי תפקידים שונים, כולל אפנון של היווצרות דאואר ומטבוליזם הכולסטרול. דו ח זה מתאר שיטה להתגבר על הקשיים הקשורים לעלויות וליציבות של התקנים החיצוניים הדרושים לקוונפיקציה של 2-AG. ההליך לסינתזה של התקן הוא פשוט יכול להתבצע בכל מעבדה, ללא צורך מומחיות סינתזה אורגנית או ציוד מיוחד. בנוסף, מתוארת שינוי של השיטה של Folch לחלץ את התקן הדאומנטי מתרבות C. אלגיה . בסופו של דבר, שיטה כמותית ואנליטית לזהות 2-AG באמצעות isotopically יציבה התווית אנלוגי 1-AG-d5 מתואר, אשר מספק תוצאות אמינות לרוץ מהיר כרומאטוגרפי. הנוהל הוא שימושי עבור לימוד תפקידים מרובים של 2-AG ב C. אלגיה בעוד להיות ישימה למחקרים אחרים של מטבוליטים באורגניזמים שונים.

אנלוגי isotopically שכותרתו היה בהצלחה מסונתז מ-d זמין מסחרית של8-גליצרול וחומצה ארכידונית באמצעות שיטת 3-צעד סינתטי (איור 2, איור 3). שלבים אלה הם פשוטים ואינם דורשים ציוד מתוחכם, תנאים מבוקרים במיוחד, או ריאגנטים יקר. לכן, שיטה זו איתנה וניתן...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

עבודה זו מתארת שיטה חזקה וישירה כדי לזהות ולכמת את האנדוקאנמיאיד 2-ארכאינול (2-AG) ב- C. אלגיה. תקן הניתוח האנליטי הינו מוכן ומשמש לקוונפיקציה של 2-AG על ידי איזונושא דילול וכרומטוגרפיה נוזלית-אלקטרורינון-ספקטרוגרפית מאסיבית (LC-ESI-MS/MS).

סינתזה של תקן שניוני לקוונפיקציה של 2-ארכידליגליליצרול באוקנאבאבדיטיס

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

אנדוקנבינואידים הם מתווכים שומנים שמורים המווסתים תהליכים ביולוגיים מרובים במגוון אורגניזמים. האנדוקנבינואידים הראשונים שהתגלו הם אננדמיד ו-2-ארכידונוילגליצרול, 2-AG. ה- nematode C.elegans הוא מודל רב עוצמה של בעלי חיים לחקר מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים.לאחרונה, גילינו כי 2-AG ממלא תפקיד בסיסי ברגולציה של סחר בכולסטרול C.elegans. זו הסיבה שזה הפך להיות הכרחי לתכנן ולייעל שיטה ללמוד אנדוגני 2-AG על ידי גילוי כימות C.elegans. שיטות אנליטיות שדווחו בעבר לכמת 2-AG בדגימות ביולוגיות בדרך כלל כרוכות בשימוש בתקנים deuterated כי הם מסחריים שנרכשו נדרשים כדי לקבל אותם זמינים לרכישה.עם זאת, הם יקרים, ובשל נוכחותם של קשרים כפולים מרובים, רגישים להתחמצן לאורך זמן. הגרסה הנפוצה ביותר של התקנים מבוססת על חומצה ארכידונית מתומן להיות מתאים לכימות על ידי דילול איזוטופ, על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרוסקופיית מסה אחורית. כדי להתגבר על הקשיים הקשורים לעלות ויציבות של התקנים deuterated לכמת 2-AG, השתמשנו בשיטה נוחה ופשוטה להכין תקן אנליטי המבוסס על deuterium-5-גליצרול.הרצף להכנת התקן הנדנוד דורש הליך בן שלושה שלבים. ניתן לשמור בצורה מוגנת עד שיהיה צורך גם. המטרה העיקרית של עבודה זו היא להראות שיטה מלאה ללמוד 2-AG ב C.elegans מן הסינתזה של תקן deuterated אנליטי הכנה והפקת דגימות נמטודה ולבסוף, הניתוח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרוסקופיה מסה.לקבלת 1-AG deuterated כסטנדרט פנימי deuterated עבור מסיונות כימות בצע פרוטוקול שלושה שלבים. על מנת להגן רק על אלכוהול ראשוני, תחילה להוסיף 38 מיליגרם של גליצרול deuterated לצינור תגובה 10 מיליליטר באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף stirrer מגנטי. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של DCM נטול מים באמצעות מזרק המילטון חמישה מיליליטר ולמלא את הצינור עם חנקן יבש לתת אווירה אינרטית.הכינו אמבטיה בעזרת בקבוק דיואר רדוד מלא באטיל אצטט מזוקק. ממלאים את צינור התגובה הסגור הרמטית בתוך האמבטיה ומצננים אותו לאט על ידי הוספת חנקן נוזלי לאתיל אצטט עד שהממס קפוא. זהירות, נוזל רותח באלימות בטמפרטורת החדר עלול לגרום לכוויות חמורות אם במגע עם העיניים והעור.לאחר מכן, להוסיף 54 מיליגרם של התנגשות נטולת מים באמצעות מזרק המילטון. זהירות, התנגשות היא נדיף ויש לו ריח חזק מאוד ולא נעים. ב 70 מיליגרם של טרבוטיל-דימתיל-cetylchloride ומערבבים הכל במשך שלוש שעות במינוס 78 מעלות על ערבוב מגנטי.מוסיפים שני מיליליטר של מי מלח כדי להירווה את התגובה. לחלץ את הפתרון עם שני מיליליטר של dichloromethane מזוקק שלוש פעמים באמצעות משפך מופרד שמירה על תמציות אורגניות בכל פעם. לאחר מכן, לשלב את שלוש תמציות אורגניות יבש מעל נתרן סולפיט.לטהר את התערובת הגולמית על ידי כרומטוגרפיה עמוד באמצעות ג'ל סיליקה כמו השלב נייח ו 10% הגדלת הקסאן אתיל אצטט שיפוע החל מ 100% הקסאן וגימור עם 100% אתיל אצטט. עבור שלב זה esterification, להוסיף 10 מיליגרם של המוצר כאמור בעבר צינור תגובה 10 מיליליטר באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף stirrer מגנטי. הוסף שני מיליליטר של DCM נטול מים באמצעות מזרק המילטון חמישה מיליליטר ולמלא את הצינור עם חנקן יבש לתת אווירה אינרטית.מצננים את הפתרון לאפס מעלות באמצעות אמבטיית קרח. Ad 36 מיליגרם של חומצה אצ'ידונית באמצעות מיקרופיגט מתכוונן רב נפח ומערבבים. לאחר מכן, מוסיפים 15 מיליגרם של 40-מתיל אמינו-פירידין ומערבבים.מוסיפים 15 מיליגרם של diacylpropylcarbodiimid באמצעות מיקרופיפט מתכוונן רב נפח ומערבבים. הוסף שני מיליליטר של מים כדי להירווה את התגובה ולאחר מכן לחלץ את הפתרון עם שני מיליליטר של DCM מזוקק שלוש פעמים באמצעות משפך מפריד. מערבבים את שלוש התמציות האורגניות ויבשים מעל נתרן סולפיט, מטהרים את התערובת הגולמית באמצעות כרומטוגרפיה של עמודה באמצעות ג'ל סיליקה כשלב נייח ואז 10% מגדילים את שיפוע האתיל אצטט הקסאן החל מ-100% הקסאן ומסיימים עם 50 50% הקסאן אתיל אצטט.לבסוף, עבור שלב deprotection, להוסיף 15 מיליגרם של המוצר מסונתז בעבר צינור תגובה 10 מיליליטר באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף stirrer מגנטי. הוסף שני מיליליטר של tetrahydrofuran נטול מים באמצעות מזרק המילטון חמישה מיליליטר ולמלא את הצינור עם חנקן יבש לתת אווירה אינרטית. ואז לקרר את הפתרון לאפס מעלות באמצעות אמבטיית קרח.הוסף 150 microliters טיפה חכם של פתרון טוחנת אחת של פלואוריד טטרה בוטילמוניום ב- THF באמצעות מזרק המילטון. לאחר שעה, מוסיפים שני מיליליטר מים כדי להרווה את התגובה. לחלץ את הפתרון עם שני מיליליטר מזוקק DCM שלוש פעמים באמצעות משפך מפריד.מערבבים את שלוש התמציות האורגניות ויבשים מעל נתרן סולפיט. עבור הליך הלבנה, להפוך תולעים על זרע שישה ס"מ NGM צלחות. אפשר לתולעת לגדול מיומיים עד שלושה ימים, כך שיש הרבה ביצים ומבוגרים gravid על הצלחת.ברגע שיש לך שפע של ביצים ומבוגרים, לשפוך חמישה מיליליטר של M9 על הצלחת. באמצעות פיפטה זכוכית, להעביר את התולעים לצינור בז 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור במשך שתי דקות ב 2, 000 G ו גלולה התולעים.יניקה רוב M9 מבלי להפריע גלולת התולעת. מוסיפים שלושה מיליליטר של תותב הלבנה ומערבבים את הפתרון בעדינות על ידי היפוך במשך כחמש דקות או עד שתראו ירידה במספר התולעים הבוגרות שלמות. ברגע שרוב הגופות התמוססו, צנטריפוגה ב 2, 000 G לדקה אחת.יניקה רוב פתרון הלבנה מבלי להפריע גלולת התולעת. מוסיפים 15 מיליליטר של M9 לצינור ומערבבים היטב. צנטריפוגה שוב ב 2, 000 G לדקה אחת.יניקה רוב M9 מבלי להפריע גלולת התולעת. להכנת דגימת תולעת, תן לעוברים N2 שהושגו על ידי הליך הלבנה היה לילה במאגר M9 ב 20 מעלות. לאחר מכן, לקצור L1s מסונכרן על ידי צנטריפוגה הצינור שתי דקות ב 2, 000 G.Wash התולעים עם חיץ M9 עוד פעם אחת לכמת את מספר L1 חי. זרעים כ 10, 000 תולעים לתוך לוחות NGM עם מיליליטר אחד של OP 50 Escherichia קולי מיובש בעבר.הדגירה את הצלחות לפחות במשך 48 שעות ב 20 מעלות עד התולעים להגיע לשלב L4. לקצור את התולעים באמצעות חיץ M9 קר בצינור בז 50 מיליליטר. לשטוף אותם עוד פעם אחת ולהעביר אותם לתוך צינור 1.5 מיליליטר.גלולה התולעים על ידי צנטריפוגה ב 2, 000 G לדקה אחת. לחסל את רוב העל-טבעי. לאחר מכן, לטבול את הצינור בחנקן נוזלי ומערבבים במינוס 80 מעלות.להפשיר כ 100 microliters של כדורי תולעת קפואים השייכים N2 ולאחר מכן להוסיף 1.3 מיליליטר של מתנול. לאחר מכן, sonicate המדגם במשך ארבע דקות. לאחר sonication, להוסיף 1, 000 ppb של התקן deuterated הפנימי, 2.6 מיליליטר של כלורופורם, ו 1.3 מיליליטר של 0.5 טוחנת של אשלגן כלורי, 0.08 טוחנת של חומצה זרחונית ליחס סופי של אחד לאחד.Vortex הדגימות במשך דקה אחת ולאחר מכן sonicate אותם באמבט מים קולי במשך 15 דקות על קרח. Vortex הדגימות שוב פעמיים במשך דקה אחת צנטריפוגה אותם במשך 10 דקות ב 2, 000 G כדי לגרום להפרדת פאזה. לאסוף את השלב התחתון לתוך צינור זכוכית נקי, לייבש אותו תחת חנקן, ו resuspend אותו 100 microliters של אצטוניטריל.כדי להשיג כימות מוצלח של 2-AG אנדוגני, היה צורך לסנתז אותו אנלוגי רווי באמצעות שיטה שלושה שלבים. לאחר מכן, הוא נוסף לדגימות תולעת, מופק ונותח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, יחד עם ספקטרומטריית מסה. משמש כסטנדרט פנימי, deuterated סינתטי 1-AG היה הכלי לכמת את המטבוליט אנדוגני.השיטה עברה אופטימיזציה באמצעות המעברים עבור 2-AG ועל deuterated 1-AG שבו מולקולות גליצרול הולכים לאיבוד. 2-AG אנדוגני מדגימות C.elegans זוהה בהצלחה וכמת על ידי דילול איזוטופי עם 1-AG deuterized מסונתז כימית באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים יחד עם ספקטרומטריית מסה. מדגם אחד הוכן עם תקן deuterated 1-AG, בעוד מדגם שניים ללא התקן.מאז הריכוז המקורי של תקן deutrated מדגם אחד ושלוש היה של 1, 000 ppb כל אחד, מיחס אזור השיא ניתן לחשב את הריכוז אנדוגני של 2-AG המדגם של 340 ppb עבור מדגם אחד ו 360 ppb עבור מדגם שלוש, נותן ממוצע של 350 ppb. היחסים חושבו כאיכות בין אזורי השיא של 2-AG ו- 1-AG deuterated, בהתאמה, עבור שתי דגימות מבודדות. שניהם עם תקן deuterated הוסיף הקודם לחילוץ.בהתחשב בחשיבות שהתגלתה לאחרונה של 2-AG בשיפור של סחר בכולסטרול וחוסר מידע של איך שומנים משפיעים על תהליך זה, זה היה הכרחי שיטת זיהוי אמין עבור אנדוקנבינואיד זה. הפיתוח המוצלח של שיטה סינתטית פשוטה וחזקה שדווחה כאן כדי להשיג אנלוגי deuterated 2-AG היה צעד מפתח של פרוטוקול זה. רוב השיטות המדווחות לכימות monoacylglycerols כרוכות בשימוש בתקנים אנליטיים זמינים מסחרית, שהם בדרך כלל יקרים ולא יציבים בתנאי אחסון רגילים, מה שהופך אותם לבלתי נגישים למעבדות בעלות תקציב נמוך יותר.עם זאת, שיטה זו פותרת זאת על ידי הצעת סינתזה של התקן באמצעות חומרי התחלה נגישים יותר. השיטה הסינתטית היא ישר קדימה ללא תנאים מתוחכמים הדרושים, מה שהופך אותו אידיאלי להתבצע בכל מעבדה עם ציוד מינימלי וגישה למגיעים, גם בתקציב מופחת. לסיכום, הליך חדש זה מתאר דרך ישר קדימה לשחזור של גילוי וכמות 2-AG שיסייע לענות על כמה שאלות שהועלו לאחר תיאור התפקיד של אנדוקנבינואידים אלה בסחר בכולסטרול C.elegans.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

ב Vivo הידרוקסיל חלבון רדיקלי מדפיס הדפסה לחקר אינטראקציות חלבונים באלבוראבאבדיטיס האלאים

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...