Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di ricerca dell'Agencia Nacional de Promociàn Cient-fica y Tecnol'gica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P., e B.H.C. sono compagni di CONICET. D.d.M. e G.R.L. sono membri della Carriera di ricerca di CONICET. Siamo grati a Gonzalo Lamberto (INMET) per l'analisi LC-MS/MS e una discussione utile. Le riprese e l'editing video sono state effettuate da Ramiro Ortega e Maria Soledad Casasola di Direcciàn de Comunicaciàn de la Ciencia, Facultad de Ciencia Poàtica y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario a Rosario, Argentina.

1. 1-AG-d5 preparazione
NOTA: Per ottenere 1-AG-d5 come standard interno deuterato per i test quantificanti, seguire il protocollo come descritto di seguito.
<ol><li>Protezione differenziale<ol>
<li>Per proteggere solo gli alcoli primari, aggiungere prima 38 mg di glicerol-d8 a un tubo di reazione da 10 mL utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere un agitatore magnetico.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di dicloromagno (DCM) utilizzando una siringa Hamilton da 5...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence.">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li><li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms.">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine:+a+simple+model+for+a+complex+discipline.">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li><li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves.">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).</li><li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves.">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).</li><li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

Gli endocannabinoidi sono una classe di lipidi che sono stati implicati nella regolazione della formazione di dauer in C. elegans7. Più specificamente, la sintesi di acidi grassi polinsaturi (PUFA) è importante per il traffico di colesterolo e lo sviluppo riproduttivo dei vermi. Si rivela qui che 2-AG, un acido arachidonico contenente endocannabinoidi, è responsabile della restituzione della larva dauer al suo ciclo normale in vermi che hanno alterato il metabolismo del colesterolo<sup...

Gli endocannabinoidi regolano i processi biologici multipli in una varietà di organismi e sono conservati mediatori lipidici1. I primi endocannabinoidi scoperti e più caratterizzati sono l'anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) e il glicerolo 2-arachidonoyl (2-AG). Gli endocannabinoidi svolgono molti ruoli critici, compresi quelli coinvolti nei sistemi di ricompensa del cervello, nonché la tossicodipendenza, la memoria, l'umore e i processi metabolici2. AEA e 2-AG sono sintetizzate solo quando necessario e hanno una breve durata di vita, e sono degradate attraverso la ricarica delle proteine di trasporto e l'idrolisi3.
L'uso di modelli animali come Caenorhabditis elegans (C. elegans) è diventato importante per studiare la grande varietà di processi biologici tra cui l'apoptosi, la segnalazione cellulare, il ciclo cellulare, la polarità cellulare, la regolazione genica, il metabolismo, l'invecchiamento, e determinazione del sesso4,5. Inoltre, C. elegans è un ottimo modello per studiare i ruoli fisiologici degli acidi grassi polinsaturi (PUFA). AEA è stato identificato in C. elegans ed è ridotto sotto la restrizione dietetica6. Questa carenza estende la durata della vita del nematode attraverso un meccanismo di restrizione dietetica che può essere soppresso dal completamento con l'endocannabinoide. Recentemente, si è scoperto che 2-AG e AEA svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione del traffico di colesterolo in C. elegans7. Ancora più importante, è stato determinato che il completamento con esogeno 2-AG può salvare l'arresto dauer, che è causato dal traffico di colesterolo alterato nei mutanti Niemann-Pick tipo C1 C. elegans.
Per comprendere meglio il rapporto tra 2-AG e il traffico di colesterolo e altri processi biologici nel nematode (ad es. segnalazione monoaminergica, nociception e locomozione), è fondamentale studiare questo metabolita endogeno e come in determinate condizioni ambientali e dietetiche8,9,10,11,12,13. Pertanto, è imperativo progettare e ottimizzare un metodo per rilevare e quantificare endogeno 2-AG in C. elegans che è semplice da usare per gli scienziati di diversi campi, in particolare quelli che studiano il comportamento del nematode in relazione a questo Endocannabinoide.
Nel 2008, Lethonen e i colleghi sono riusciti a identificare 2-AG e AEA in C. elegans utilizzando metodi analitici LC-MS14. Nel 2011 sono riusciti ad espandere questa tecnica ad altri endocannabinoidi15. Un lavoro più recente ha dimostrato altri metodi analitici che sono riusciti a rilevare e quantificare gli endocannabinoidi in C. elegans, tra cui la spettrometria di massa e GC-MS16,17,18, e ha è stato inoltre segnalato che metodi analitici simili possono essere ampliati ad altri modelli19.
I metodi analitici precedentemente riportati utilizzati per quantificare 2-AG in campioni biologici di solito comportano l'uso di standard deuterati che sono acquisiti commercialmente e richiedono disponibilità per l'acquisto20,21. Molti standard analitici per la quantificazione LC-MS/MS degli endocannabinoidi sono disponibili in commercio da diversi fornitori. Tuttavia, sono costosi, sono sensibili e si ossidano nel tempo, a causa della presenza di più obbligazioni doppie. Le versioni più comuni di questi standard sono basate sull'acido aracidonico ottuerato e sono adatte per la quantificazione mediante diluizione isotopica LC-MS/MS14,22. Inoltre, la maggior parte di questi standard sono sostituiti nella posizione 2 del glicerolo, rendendoli instabili nella maggior parte delle condizioni in quanto sono inclini alla migrazione acyl19,23.
Per superare le difficoltà concuite con i costi e la stabilità di questi standard deuterati, viene presentato un metodo comodo e semplice per preparare uno standard analitico basato sul glicerol-d5. La sequenza per preparare lo standard penta-deuterato richiede una procedura in tre fasi che si traduce nello standard 1-AG-d5, che è stabile e non subisce la migrazione acyl (il problema principale quando si mira a sintetizzare 2 monoacylglyceroli).
L'obiettivo principale qui è quello di mostrare un metodo semplice e riproducibile per studiare 2-AG in C. elegans, compresa la sintesi dello standard analitico deuterato, la preparazione e l'estrazione dei campioni di nematodi, e l'analisi da LC-MS/MS(Figura 1 ). Questa procedura sintetica è realizzabile senza la sofisticata conoscenza di sintesi organica o attrezzature speciali, che lo rende adatto per gli scienziati provenienti da diversi campi che stanno studiando il comportamento di C. elegans sotto l'influenza endocannabinoide. Il metodo è anche espandibile ad altri modelli di studio, rendendolo utile per diversi obiettivi. La norma, preparata come riportato qui, è stata applicata per sviluppare con successo un metodo cromatico veloce e affidabile che consente un rilevamento e una quantificazione efficaci di 2-AG in modo riproducibile.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

Questo lavoro presenta un metodo per preparare uno standard analitico per analizzare la glicerel 2-aracidonoyl (2-AG) qualitativamente e quantitativamente mediante cromatografia liquida-elettrospray ionization-tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS). Gli endocannabinoidi sono conservati mediatori lipidici che regolano più processi biologici in una varietà di organismi. In C. elegans, 2-AG è stato trovato per possedere ruoli diversi, tra cui la modulazione della formazione di dauer e metabolismo del colesterolo. La presente relazione descrive un metodo per superare le difficoltà associate ai costi e alla stabilità degli standard deuterati necessari per la quantificazione dei 2 AG. La procedura per la sintesi dello standard è semplice e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio, senza la necessità di competenze di sintesi organica o di attrezzature speciali. Inoltre, viene descritta una modifica del metodo di Folch per estrarre lo standard deuterato dalla cultura di C. elegans. Infine, viene descritto un metodo quantitativo e analitico per rilevare 2-AG utilizzando l'analogico 1-AG-d5 etichettato isotopicamente stabile, che fornisce risultati affidabili in una corsa fast-cromatica. La procedura è utile per studiare i molteplici ruoli di 2-AG in C. elegans, pur essendo applicabile ad altri studi di metaboliti in organismi diversi.

Un analogo con etichetta isotopica è statosintetizzato con successo da acido aracilolo e arachidonico disponibile in commercio utilizzando un metodo sintetico in 3 fasi (Figura 2, Figura 3). Questi passaggi sono semplici e non richiedono attrezzature sofisticate, condizioni appositamente controllate o costosi reagenti. Così, questo metodo è robusto e può essere esteso con successo per sintetizzare monoacylgliglycer...

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Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Questo lavoro descrive un metodo robusto e diretto per rilevare e quantificare l'endocannabinoide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. Uno standard analitico deuterato che abbiamo preparato e utilizzato per la quantificazione di 2-AG da diluizione isotopica e cromatografia liquida-elettrospray-spettrometria di massa di mitinazione -tandem (LC-ESI-MS/MS).

Sintesi di uno standard deuterato per la quantificazione di 2-Arachidonoylglycerol a Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Gli endocannabinoidi sono mediatori lipidici conservati che regolano molteplici processi biologici in una varietà di organismi. I primi endocannabinoidi scoperti sono anandamide e 2-aracidonoilglicerolo, 2-AG. Il nematode C.elegans è un potente modello animale per studiare una grande varietà di processi biologici.Recentemente, abbiamo scoperto che 2-AG svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del traffico di colesterolo nei C.elegans. Per questo motivo è diventato imperativo progettare e ottimizzare un metodo per studiare l'endogeno 2-AG rilevando e quantificando in C.elegans. I metodi analitici precedentemente riportati per quantificare la 2-AG nei campioni biologici di solito comportano l'uso di standard deuterati acquisiti commercialmente sono tenuti a averli disponibili per l'acquisto.Tuttavia, sono costosi e, a causa della presenza di più doppi legami, sono sensibili per ossidarsi nel tempo. La versione più comune degli standard si basa sul fatto che l'acido arachidonico ottauterato è adatto per la quantificazione per diluizione isotopica, per cromatografia liquida e spettroscopia di massa posteriore. Per superare le difficoltà associate al costo e alla stabilità degli standard deuterati per quantificare 2-AG, abbiamo utilizzato un metodo comodo e semplice per preparare uno standard analitico basato sul deuterio-5-glicerolo.La sequenza per preparare lo standard pendeuterated richiede una procedura in tre passaggi. Essere in grado di essere conservati in forma protetta fino a quando non è necessario. L'obiettivo principale di questo lavoro è quello di mostrare un metodo completo per studiare la 2-AG in C.elegans dalla sintesi dello standard analitico deuterato alla preparazione e all'estrazione dei campioni di nematodi e, infine, l'analisi mediante cromatografia liquida e spettroscopia di massa.Per ottenere 1-AG deuterato come standard interno deuterato per i test di quantificazione seguire un protocollo in tre gradi. Per proteggere solo gli alcoli primari, aggiungere prima 38 milligrammi di glicerolo deuterato in un tubo di reazione da 10 millilitri utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere un agitatore magnetico. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di DCM anidro utilizzando una siringa Hamilton da cinque millilitri e riempire il tubo con azoto secco per dare un'atmosfera inerte.Preparare un bagno utilizzando un pallone Dewar poco profondo riempito con acetato di etile distillato. Riempire il tubo di reazione ermeticamente chiuso all'interno del bagno e raffreddarlo lentamente aggiungendo azoto liquido all'acetato di etile fino a quando il solvente non viene congelato. Attenzione, il liquido bolle violentemente a temperatura ambiente e potrebbe causare gravi ustioni se a contatto con occhi e pelle.Quindi, aggiungere 54 milligrammi di collidina anidra usando una siringa Hamilton. Attenzione, la collidina è volatile e ha un odore molto forte e sgradevole. A 70 milligrammi di terbutile-dimetil-cetilcloruro e mescolare tutto per tre ore a meno 78 gradi su un agitatore magnetico.Aggiungere due millilitri di salamoia per placare la reazione. Estrarre la soluzione con due millilitri di diclorometano distillato tre volte utilizzando un imbuto separato mantenendo gli estratti organici ogni volta. Quindi, unire i tre estratti organici e asciugare sul solfito di sodio.Purificare la miscela grezza mediante cromatografia a colonna utilizzando il gel di silice come fase stazionaria e un gradiente di acetato di esano etilico del 10% a partire dal 100% di esano e terminando con acetato di etile al 100%. Per questa fase di esterificazione, aggiungere 10 milligrammi del prodotto precedentemente dichiarato a un tubo di reazione da 10 millilitri utilizzando una pippette Pasteur e aggiungere un agitatore magnetico. Aggiungere due millilitri di DCM anidro utilizzando una siringa Hamilton da cinque millilitri e riempire il tubo con azoto secco per dare un'atmosfera inerte.Raffreddare la soluzione a zero gradi utilizzando un bagno di ghiaccio. Ad 36 milligrammi di acido arachidonico utilizzando una micropipetta regolabile multi-volume e mescolare. Quindi, aggiungere 15 milligrammi di 40-metil-amminopiridina e mescolare.Aggiungere 15 milligrammi di diacilpropilcarbodiimid utilizzando una micropipetta regolabile multi-volume e mescolare. Aggiungere due millilitri di acqua per spegnere la reazione e quindi estrarre la soluzione con due millilitri di DCM distillato tre volte utilizzando un imbuto di separazione. Unire i tre estratti organici e asciugare sul solfito di sodio, purificare la miscela grezza mediante cromatografia a colonna utilizzando gel di silice come fase stazionaria e quindi gradiente di acetato di esano etilico che aumenta del 100% a partire dal 100% di esano e terminando con il 50 50% di acetato di etile esano.Infine, per la fase di deprotezione, aggiungere 15 milligrammi del prodotto precedentemente sintetizzato a un tubo di reazione da 10 millilitri utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere un agitatore magnetico. Aggiungere due millilitri di tetraidrofurano anidrofurano usando una siringa Hamilton da cinque millilitri e riempire il tubo con azoto secco per dare un'atmosfera inerte. Quindi raffreddare la soluzione a zero gradi utilizzando un bagno di ghiaccio.Aggiungere 150 microlitri per quanto riguarda una soluzione molare di fluoruro di tetrabutilammonio in THF utilizzando una siringa Hamilton. Dopo un'ora, aggiungere due millilitri di acqua per placare la reazione. Estrarre la soluzione con due millilitri distillati DCM tre volte utilizzando un imbuto di separazione.Unire i tre estratti organici e asciugare sul solfito di sodio. Per la procedura di sbiancamento, ruotare i vermi su piastre NGM di sei centimetri seminati. Lascia che il verme cresca da due a tre giorni in modo che ci siano molte uova e adulti gravidi sul piatto.Una volta che hai molte uova e adulti, versa cinque millilitri di M9 sul piatto. Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire i vermi in un tubo di falco da 15 millilitri. Centrifugare il tubo per due minuti a 2.000 G e pelletare i vermi.Aspirare la maggior parte dell'M9 senza disturbare il pellet di verme. Aggiungere tre millilitri di soluzione di sbiancamento e mescolare delicatamente la soluzione invertendo per circa cinque minuti o fino a quando non si vede una diminuzione del numero di vermi adulti intatti. Una volta che la maggior parte dei corpi si è sciolta, centrifuga a 2.000 G per un minuto.Aspirare la maggior parte della soluzione di sbiancamento senza disturbare il pellet di verme. Aggiungere 15 millilitri di M9 al tubo e mescolare bene. Centrifuga di nuovo a 2.000 G per un minuto.Aspirare la maggior parte dell'M9 senza disturbare il pellet di verme. Per la preparazione del campione di verme, lasciare che gli embrioni N2 ottenuti con procedura di sbiancamento avessero nella notte nel tampone M9 a 20 gradi. Quindi, raccogliere L1 sincronizzati centrifugando il tubo due minuti a 2.000 G.Lavare i vermi con il buffer M9 ancora una volta e quantificare il numero di L1 vivi. Seminare circa 10.000 vermi in piastre NGM con un millilitro di OP 50 Escherichia coli precedentemente essiccato.Incubare le piastre almeno per 48 ore a 20 gradi fino a quando i vermi raggiungono lo stadio L4. Raccogliere i vermi usando il tampone M9 freddo in un tubo di falco da 50 millilitri. Lavarli ancora una volta e trasferirli in un tubo da 1,5 millilitri.Pellet i vermi per centrifugazione a 2.000 G per un minuto. Elimina la maggior parte del supernatante. Quindi, immergere il tubo in azoto liquido e mescolare a meno 80 gradi.Scongelare circa 100 microlitri di pellet di vermi congelati appartenenti a N2 e quindi aggiungere 1,3 millilitri di metanolo. Dopodi tempo, sonicare il campione per quattro minuti. Dopo la sonicazione, aggiungere 1.000 ppb dello standard interno deuterato, 2,6 millilitri di cloroformio e 1,3 millilitri di 0,5 molare di cloruro di potassio, 0,08 molare di acido fosforico ad un rapporto finale di uno a uno.Vortice i campioni per un minuto e poi sonicarli in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 15 minuti sul ghiaccio. Vortice i campioni di nuovo due volte per un minuto e centrifugarli per 10 minuti a 2.000 G per indurre la separazione di fase. Raccogliere la fase inferiore in un tubo di vetro pulito, asciugarla sotto azoto e rimotivarla in 100 microlitri di acetonitrile.Per ottenere una quantificazione di successo dell'endogeno 2-AG, è stato necessario sintetizzare il suo analogo saturo usando un metodo in tre fase. Successivamente, è stato aggiunto a campioni di vermi, estratto e analizzato da cromatografia liquida ad alte prestazioni, accoppiata alla spettrometria di massa. Utilizzato come standard interno, il sintetico deuterato 1-AG era lo strumento per quantificare il metabolita endogeno.Il metodo è stato ottimizzato utilizzando le transizioni per 2-AG e per 1-AG deuterato dove si perdono molecole di glicerolo. L'endogeno 2-AG dei campioni di C.elegans è stato rilevato e quantificato con successo mediante diluizione isotopica con la 1-AG deuterizzata chimicamente sintetizzata utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa. Il campione uno è stato preparato con lo standard deuterato 1-AG, mentre il campione due senza lo standard.Poiché la concentrazione originale della norma deutrata nel campione uno e tre era di 1.000 ppb ciascuna, dal rapporto area di picco è possibile calcolare la concentrazione endogena di 2-AG nel campione di 340 ppb per il campione uno e 360 ppb per il terzo campione, dando una media di 350 ppb. I rapporti sono stati calcolati come qualità tra le aree di picco di 2-AG e 1-AG deuterate, rispettivamente, per due campioni isolati. Entrambi con lo standard deuterato aggiunto prima all'estrazione.Data l'importanza recentemente scoperta di 2-AG nel miglioramento del traffico di colesterolo e la mancanza di informazioni su come i lipidi influenzano quel processo, era necessario un metodo di rilevamento affidabile per questo endocannabinoide. Il successo dello sviluppo di un metodo sintetico semplice e robusto riportato qui per ottenere 2-AG analogico deuterato è stato un passo chiave di questo protocollo. La maggior parte dei metodi segnalati per quantificare i monoacilglyceroli comportano l'uso di standard analitici disponibili in commercio, che di solito sono costosi e instabili in condizioni di conservazione regolari, rendendoli irraggiungibili per i laboratori a basso budget.Tuttavia, questo metodo risolve questo problema proponendo una sintesi dello standard utilizzando materie prime più accessibili. Il metodo sintetico è semplice senza bisogno di condizioni sofisticate, rendendolo ideale per essere eseguito in qualsiasi laboratorio con attrezzature minime e accesso ai reagenti, anche con un budget ridotto. In sintesi, questa nuova procedura descrive un modo semplice e riproducibile di rilevare e quantificare 2-AG che aiuterà a rispondere ad alcune delle domande sollevate dopo la descrizione del ruolo di questi endocannabinoidi nel traffico di colesterolo in C.elegans.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Ricerca

Biochimica

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

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Quantificazione di abbondanza e ricarica i livelli di RNA di trasferimento in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Un metodo colorimetrico per la misurazione del ferro contenuto nelle piante

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

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Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

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Piastra-base di coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Quantificazione del Coenzevia A nelle cellule e nei tessuti

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

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Impronta proteica radicale in vivo Hydroxyl per lo studio delle interazioni proteiche in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

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Isolamento dell'estratto nucleare attivo di Caenorhabditis elegans e ricostituzione per la trascrizione in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...