Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et forskningsstipend fra Agencia Nacional de Promoción Científica y tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., GP og B.H.C. er stipendiater fra CONICET. D.d.M. og GRL er medlemmer av forsknings karrieren til CONICET. Vi er takknemlige til Gonzalo Lamberto (INMET) for LC-MS/MS analyse og nyttig diskusjon. Video opptak og redigering har blitt gjort av Ramiro Ortega og María Soledad Casasola fra Dirección de Comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario i Rosario, Argentina.

1.1-AG-d5 forberedelse
Merk: for å få 1-AG-d5 som en deuterert intern standard for kvantifisering analyser, følg protokollen som beskrevet nedenfor.
<ol><li>Differensial beskyttelse<ol>
<li>For å bare beskytte primære alkoholer, først legge 38 mg glyserol-d8 til en 10 ml reaksjons rør ved hjelp av en Pasteur pipette og legge til en magnetisk rører.</li>
		<li>Tilsett 5 mL vannfri diklormetan (DCM) ved hjelp av et 5 mL Hamilton sprøyte, og fyll røret...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence.">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li><li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms.">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine:+a+simple+model+for+a+complex+discipline.">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li><li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves.">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).</li><li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves.">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).</li><li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

Endocannabinoids er en klasse av lipider som har vært innblandet i regulering av dauer dannelse i C. elegans7. Mer spesifikt, er syntesen av flerumettede fettsyrer (Fuf) viktig for kolesterol handel og den reproduktive utviklingen av ormer. Det er avslørt her at 2-AG, en arachidonic syre som inneholder endocannabinoid, er ansvarlig for restituting dauer Larven til normal syklus i ormer som har nedsatt kolesterol metabolisme7.
Gitt den ...

Endocannabinoids regulere flere biologiske prosesser i en rekke organismer og er bevart lipid meglere1. Den første oppdaget og mest godt preget endocannabinoids er anandamid (arachidonoylethanolamide, AEA) og 2-arachidonoyl glyserol (2-AG). Endocannabinoids spiller mange kritiske roller, inkludert de som er involvert i hjerne belønningssystemer, samt narkotikaavhengighet, minne, humør og metabolske prosesser2. AEA og 2-AG er bare syntetisert ved behov og har kortlevetid spenn, og de er degradert gjennom transport protein reopptak og hydrolyse3.
Bruken av dyremodeller som Caenorhabditis elegans (C. elegans) har blitt viktig å studere det store utvalget av biologiske prosesser inkludert apoptose, celle signalering, celle syklus, celle polaritet, gen regulering, metabolisme, aldring, og sex besluttsomhet4,5. I tillegg er C. elegans en utmerket modell for å studere de fysiologiske rollene til flerumettede fettsyrer (fuf). AEA har blitt identifisert i C. elegans og er redusert under kosttilskudd restriksjon6. Denne mangelen forlenger levetiden til nematode gjennom et kosttilskudd Begrensnings mekanisme som kan undertrykkes av tilskudd med endocannabinoid. Nylig ble det oppdaget at 2-AG og AEA spille fundamentale roller i regulering av kolesterol handel i C. elegans7. Enda viktigere var det fastslått at tilskudd med eksogene 2-AG kan redde dauer arrest, som er forårsaket av nedsatt kolesterol handel i Niemann-Pick type C1 C. elegans mutanter.
For å få en bedre forståelse av 2-AG forhold til kolesterol handel og andre biologiske prosesser i nematode (dvs. monoaminergic signalering, Nociception og bevegelse), er det avgjørende å studere denne endogene metabolitten og hvordan det er påvirket under visse miljø-og diett forhold8,9,10,11,12,13. Derfor er det viktig å designe og optimalisere en metode for å oppdage og kvantifisere endogene 2-AG i C. elegans som er enkel å bruke for forskere i ulike felt, spesielt de som studerer nematode atferd i forhold til dette endocannabinoid.
I 2008 lyktes Lethonen og kollegaer i å identifisere 2-AG og AEA i C. elegans ved hjelp av LC-MS analytiske metoder14. I 2011 klarte de å utvide denne teknikken til andre endocannabinoids15. Nyere arbeid har vist andre analytiske metoder som har lykkes i å oppdage og kvantifisere endocannabinoids i C. elegans, inkludert Mass massespektrometri og GC-MS16,17,18, og det har også blitt rapportert at lignende analytiske metoder kan utvides til andre modeller19.
Tidligere rapportert analytiske metoder som brukes for kvantifisere 2-AG i biologiske prøver vanligvis innebære bruk av deuterert standarder som er kommersielt ervervet og krever tilgjengelighet for kjøpet20,21. Mange analytiske standarder for LC-MS/MS kvantifisering av endocannabinoids er kommersielt tilgjengelig fra ulike tilbydere. Likevel, de er dyre, er følsomme, og blir oksidert over tid, på grunn av tilstedeværelsen av flere doble obligasjoner. De vanligste versjonene av disse standardene er basert på oktav-deuterert arachidonic syre og er egnet for kvantifisering av isotop fortynning LC-MS/MS14,22. Også de fleste av disse standardene er erstattet i posisjon 2 av glyserol, noe som gjør dem ustabile under de fleste forhold siden de er utsatt for acyl migrasjon19,23.
For å overvinne vanskelighetene knyttet til kostnader og stabilitet i disse deuterert standarder, en praktisk og enkel metode er presentert for å utarbeide en analytisk standard basert på glyserol-d5. Sekvensen for å forberede Penta-deuterert standard krever en tre-trinns prosedyre som resulterer i standard 1-AG-d5, som er stabil og ikke gjennomgår acyl migrasjon (Hovedproblemet når satsing å syntetisere 2-monoacylglycerols).
Hovedmålet her er å vise en enkel og reproduserbar metode for å studere 2-AG i C. elegans, inkludert syntese av analytiske deuterert standard, utarbeidelse og ekstraksjon av nematode prøvene, og analyse av LC-MS/MS (figur 1 ). Denne syntetiske prosedyren er oppnåelig uten sofistikert Organisk syntese kunnskap eller spesialutstyr, noe som gjør det egnet for forskere fra ulike felt som studerer C. elegans oppførsel under endocannabinoid innflytelse. Metoden kan også utvides til andre studie modeller, noe som gjør det nyttig for ulike mål. Standarden, utarbeidet som rapportert her, har blitt brukt for å lykkes utvikle en rask og pålitelig kromatografiske metode som gjør det mulig for effektiv påvisning og kvantifisering av 2-AG i en reproduserbar måte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

Dette arbeidet presenterer en metode for å utarbeide en analytisk standard for å analysere 2-arachidonoyl glyserol (2-AG) kvalitativt og kvantitativt av flytende kromatografi-electrospray ionisering-tandem Mass massespektrometri (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids er bevart lipid meglere som regulerer flere biologiske prosesser i en rekke organismer. I C. elegans, 2-AG har blitt funnet å ha ulike roller, inkludert modulering av dauer dannelse og kolesterol metabolisme. Denne rapporten beskriver en metode for å overvinne vanskelighetene knyttet til kostnader og stabilitet i deuterert standarder som kreves for 2-AG kvantifisering. Prosedyren for syntese av standarden er enkel og kan utføres i ethvert laboratorium, uten behov for Organisk syntese ekspertise eller spesialutstyr. Dessuten, en modifisering av Folch ' metoden å ekstra det deuterert målestokk fra C. elegans kulturen er beskrevet. Til slutt, en kvantitativ og analytisk metoden å merker 2-AG benytter det stabile isotopically benevnt analog 1-AG-d5 er beskrevet, hvilke skaffer pålitelig resultater inne en rask-kromatografiske løpe. Fremgangsmåten er nyttig for å studere flere roller av 2-AG i C. elegans samtidig som gjelder for andre studier av metabolitter i ulike organismer.

En isotopically merket analog ble med hell syntetisert fra kommersielt tilgjengelige d8-glyserol og arachidonic syre ved hjelp av en 3-trinns syntetisk metode (figur 2, Figur 3). Disse trinnene er enkle og krever ikke avansert utstyr, spesielt kontrollerte forhold eller kostbare reagenser. Således, denne metoden er robust og kanskje være med hell utbygget å syntetisere monoacylglycerides inneholder annerledes fatty ...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Dette arbeidet beskriver en robust og grei metode for å oppdage og kvantifisere endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) i C. elegans. En analytisk deuterert standard oss forberedt og brukes for kvantifisering av 2-AG ved isotopanrikning fortynning og flytende kromatografi-electrospray ionisering-tandem Mass massespektrometri (LC-ESI-MS/MS).

Syntese av en Deuterert standard for kvantifisering av 2-Arachidonoylglycerol i Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Endocannabinoider bevares lipidmediatorer som regulerer flere biologiske prosesser i en rekke organismer. De første oppdaget endocannabinoids er anandamid og 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. Nematode C.elegans er en kraftig dyremodell for å studere et stort utvalg av biologiske prosesser.Nylig oppdaget vi at 2-AG spiller en grunnleggende rolle i reguleringen av kolesterolhandel i C.elegans. Dette er grunnen til at det ble viktig å designe og optimalisere en metode for å studere endogene 2-AG ved deteksjon og kvantifisering i C.elegans. Tidligere rapporterte analytiske metoder for å kvantifisere 2-AG i biologiske prøver innebærer vanligvis bruk av deutererte standarder som er kommersielle ervervet, er nødvendig for å ha dem tilgjengelige for kjøp.Likevel er de dyre, og på grunn av tilstedeværelsen av flere doble obligasjoner, er følsomme for å bli oksidert over tid. Den vanligste versjonen av standardene er basert på octadeuterated arachidonic acid som er egnet for kvantifisering ved isotop fortynning, ved flytende kromatografi og bakre massespektroskopi. For å overvinne vanskelighetene knyttet til kostnadene og stabiliteten til de de twittererte standardene for å kvantifisere 2-AG, brukte vi en praktisk og enkel metode for å forberede en analytisk standard basert på deuterium-5-glyserol.Sekvensen for å klargjøre den pendeutererte standarden krever en tretrinnsprosedyre. Å være mulig å bli holdt i beskyttet form til det er nødvendig. Hovedmålet med dette arbeidet er å vise en komplett metode for å studere 2-AG i C.elegans fra syntesen av den analytiske deuterated standarden til forberedelse og utvinning av nematodeprøvene og til slutt analysen av flytende kromatografi og massespektroskopi.For å skaffe deuterated 1-AG som en deuterated intern standard for kvantifisering analyser følger en tre-trinns protokoll. For å bare beskytte primære alkoholer, legg først til 38 milligram glyserol deuterated til et 10 milliliter reaksjonsrør ved hjelp av en Pasteur pipette og legg til en magnetisk rører. Deretter legger du til fem milliliter vannfri DCM ved hjelp av en fem milliliter Hamilton sprøyte og fyll røret med tørt nitrogen for å gi en inert atmosfære.Forbered et bad ved hjelp av en grunn Dewar kolbe fylt med destillert etylacetat. Fyll det hermetisk lukkede reaksjonsrøret inne i badekaret og avkjøl det ved sakte å tilsette flytende nitrogen til etylacetat til løsningsmidlet er frosset. Forsiktig væske koker voldsomt ved romtemperatur og kan forårsake alvorlige brannskader ved kontakt med øyne og hud.Deretter legger du til 54 milligram vannfri kolliderin ved hjelp av en Hamilton-sprøyte. Forsiktig, collidine er flyktig og har en veldig sterk og ubehagelig lukt. Ved 70 milligram terbutile-dimetyl-cetylklorid og rør alt i tre timer ved minus 78 grader på en magnetisk rører.Tilsett to milliliter saltlake for å slukke reaksjonen. Trekk ut løsningen med to milliliter destillert diklormetan tre ganger ved hjelp av en separert trakt som holder de organiske ekstraktene hver gang. Deretter kombinerer du de tre organiske ekstraktene og tørker over natriumsulfitt.Rens den grove blandingen etter kolonnekromatografi ved hjelp av silikagel som stasjonær fase og en 10% økende heksaneetylacetatgradient fra 100% heksan og etterbehandling med 100% etylacetat. For dette esterification trinn, legge til 10 milligram av produktet tidligere angitt til en 10 milliliter reaksjonsrør ved hjelp av en Pasteur pippette og legge til en magnetisk rører. Tilsett to milliliter vannfri DCM ved hjelp av en fem milliliter Hamilton sprøyte og fyll røret med tørt nitrogen for å gi en inert atmosfære.Avkjøl løsningen til null grader ved hjelp av et isbad. Ad 36 milligram arakidonsyre ved hjelp av en multi-volum justerbar mikropipette og røre. Deretter legger du til 15 milligram 40-metyl-aminopyridin og rør.Tilsett 15 milligram diacylpropylcarbodiimid ved hjelp av en multi-volum justerbar mikropipette og rør. Tilsett to milliliter vann for å slukke reaksjonen og trekk deretter ut løsningen med to milliliter destillert DCM tre ganger ved hjelp av en separeringstrakt. Kombiner de tre organiske ekstraktene og tørk over natriumsulfitt, rens den grove blandingen etter kolonnekromatografi ved hjelp av silikagel som en stasjonær fase og deretter 10% økende heksaneetycetatgradient fra 100% heksan og etterbehandling med 50 50% heksanetylacetat.Til slutt, for deprotection trinn, legge til 15 milligram av tidligere syntetisert produkt til en 10 milliliter reaksjonsrør ved hjelp av en Pasteur pipette og legge til en magnetisk rører. Tilsett to milliliter vannfri tetrahydrofuran ved hjelp av en fem milliliter Hamilton sprøyte og fyll røret med tørt nitrogen for å gi en inert atmosfære. Deretter avkjøles løsningen til null grader ved hjelp av et isbad.Tilsett 150 mikroliter drop-wise av en molar løsning av tetrabutylammonium fluor i THF ved hjelp av en Hamilton sprøyte. Etter en time, tilsett to milliliter vann for å slukke reaksjonen. Trekk ut løsningen med to milliliter destillert DCM tre ganger ved hjelp av en skilletrakt.Kombiner de tre organiske ekstraktene og tørk over natriumsulfitt. For bleking prosedyren, slå ormer på seeded seks centimeter NGM plater. La ormen vokse fra to til tre dager, slik at det er mange egg og gravid voksne på tallerkenen.Når du har mange egg og voksne, hell fem milliliter M9 på tallerkenen. Ved hjelp av en glasspipette, overfør ormene til et 15 milliliter falkerør. Sentrifuger røret i to minutter ved 2000 G og pellet ormene.Suge det meste av M9 uten å forstyrre orm pellet. Tilsett tre milliliter blekeoppløsning og bland løsningen forsiktig ved å invertere i omtrent fem minutter eller til du ser en reduksjon i antall intakte voksne ormer. Når de fleste av kroppene er oppløst, sentrifuge på 2000 G i ett minutt.Suge det meste av blekeløsningen uten å forstyrre ormpellet. Tilsett 15 milliliter M9 til røret og bland godt. Sentrifuge igjen på 2, 000 G i ett minutt.Suge det meste av M9 uten å forstyrre orm pellet. For ormprøveforberedelse, la N2 embryoer oppnådd ved bleking prosedyre hadde i over natten i M9 buffer ved 20 grader. Deretter høster synkroniserte L1s ved å sentrifugere røret to minutter på 2000 G.Vask ormene med M9 buffer en gang til og kvantifisere antall levende L1. Frø ca 10 000 ormer i NGM plater med en milliliter OP 50 Escherichia coli tidligere tørket.Inkuber platene minst i 48 timer ved 20 grader til ormene når L4-scenen. Høst ormene ved hjelp av kald M9 buffer i en 50 milliliter falk rør. Vask dem en gang til og overfør dem til et 1,5 milliliter rør.Pellet ormene ved sentrifugering på 2000 G i ett minutt. Eliminer det meste av det overnaturlige. Deretter dypp røret i flytende nitrogen og rør på minus 80 grader.Tin ca 100 mikroliter frossen orm pellets tilhører N2 og deretter legge til 1,3 milliliter metanol. Etter det, sonicate prøven i fire minutter. Etter sonikering, legg til 1000 ppb av den interne deutererte standarden, 2,6 milliliter kloroform og 1,3 milliliter av 0,5 molar kaliumklorid, 0,08 molar fosforsyre til et endelig forhold på en til en.Vortex prøvene i ett minutt og deretter sonikere dem i et ultralydvannbad i 15 minutter på is. Vortex prøvene igjen to ganger i ett minutt og sentrifuge dem i 10 minutter ved 2, 000 G for å indusere fase separasjon. Samle den nedre fasen i et rent glassrør, tørk det under nitrogen, og gjenoppliv den i 100 mikroliter acetonitril.For å oppnå en vellykket kvantifisering av endogene 2-AG, var det nødvendig å syntetisere det er mettet analog ved hjelp av en tretrinns metode. Etterpå ble det lagt til ormprøver, ekstrahert og analysert av høy ytelse flytende kromatografi, kombinert med massespektrometri. Brukt som en intern standard, syntetisk deuterated 1-AG var verktøyet for å kvantifisere endogene metabolitten.Metoden ble optimalisert ved hjelp av overgangene for 2-AG og for deuterated 1-AG hvor glyserolmolekyler går tapt. 2-AG endogene fra C.elegans-prøvene ble vellykket oppdaget og kvantifisert ved isotopisk fortynning med kjemisk syntetisert deuterized 1-AG ved hjelp av høyytelses flytende kromatografi kombinert med massespektrometri. Prøve en ble utarbeidet med den deuterated standard 1-AG, mens prøve to uten standard.Siden den opprinnelige konsentrasjonen av deutrated standard i prøve en og tre var av 1, 000 ppb hver, fra toppområdet forholdet er det mulig å beregne endogene konsentrasjonen av 2-AG i prøven på 340 ppb for prøve en og 360 ppb for prøve tre, noe som gir et gjennomsnitt på 350 ppb. Forholdet ble beregnet som en kvalitet mellom toppområdene på henholdsvis 2-AG og deuterated 1-AG for to isolerte prøver. Begge med den deuterated standarden lagt tidligere til ekstraksjon.Gitt den nylig oppdagede betydningen av 2-AG i forbedring av kolesterolhandel og mangel på informasjon om hvordan lipider påvirker denne prosessen, var det nødvendig en pålitelig deteksjonsmetode for denne endocannabinoid. Den vellykkede utviklingen av en enkel og robust syntetisk metode rapportert her for å få deuterated analog 2-AG var et viktig skritt i denne protokollen. De fleste av de rapporterte metodene for å kvantifisere monoacylglycerols innebærer bruk av kommersielt tilgjengelige analytiske standarder, som vanligvis er dyre og ustabile under vanlige lagringsforhold, noe som gjør dem til en utilgjengelig for lavere budsjettlaboratorier.Denne metoden løser imidlertid dette ved å foreslå en syntese av standarden ved hjelp av mer tilgjengelige startmaterialer. Den syntetiske metoden er rett frem uten sofistikerte forhold som trengs, noe som gjør den ideell for å bli utført i ethvert laboratorium med minimalt utstyr og tilgang til reaktanter, selv i et redusert budsjett. Oppsummert beskriver denne nye prosedyren en rett frem og reproduserbar måte å oppdage og kvantifisere 2-AG som vil bidra til å svare på noen av spørsmålene som er reist etter beskrivelsen av rollen til disse endocannabinoidene i kolesterolhandel i C.elegans.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantifisering av overflod og lading nivåer av overføring RNAs i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Kolorimetrisk metode for å måle jerninnhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskala kolorimetrisk analyser av intracellulær laktat og Pyruvate i Rundormer Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-baserte stor skala dyrking av Caenorhabditis elegans: Sample forberedelse for studiet av metabolske forandringer i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifisering av koenzym A i celler og vev

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for studiet av proteininteraksjoner i Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolering av aktiv caenorhabditt elegans kjernefysisk ekstrakt og rekonstituering for in vitro transkripsjon

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...