Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Эта работа была поддержана исследовательским грантом Национального агенсии Промсвязьбанка Кьентифика и Текнологика (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P. и B.H.C. являются стипендиатами CONICET. D.d.M. и G.R.L. являются членами исследовательской карьеры CONICET. Мы благодарны Гонсало Ламберто (INMET) за анализ LC-MS/MS и полезное обсуждение. Видеосъемка и редактирование было сделано Рамиро Ортега и Мария Соледад Касасола из Direccion де Comunicacion де ла Сьенсия, Факультет Сиенсия Политика у Relaciones Internacionales, Университет Национальный Росарио в Росарио, Аргентина.

1. 1-AG-d5 подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения 1-AG-D5 в качестве deuterated внутреннего стандарта для количественного анализов, следуйте протоколу, как описано ниже.
<ol><li>Дифференциальная защита<ol>
<li>Чтобы защитить только первичные спирты, сначала добавьте 38 мг глицер...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence.">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li><li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms.">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine:+a+simple+model+for+a+complex+discipline.">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li><li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves.">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).</li><li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves.">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).</li><li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

Эндоканнабиноиды являются классом липидов, которые были вовлечены в регулирование формирования dauer в C. elegans7. В частности, синтез полиненасыщенных жирных кислот (ПУФА) имеет важное значение для торговли холестерином и репродуктивного развития червей. Здесь показано, ч...

Эндоканнабиноиды регулируют несколько биологических процессов в различных организмах и сохраняют липидных посредников1. Первыми обнаруженными и наиболее хорошо характерными эндоканнабиноидами являются анандамид (арачидонайлетоламид, АЕА) и 2-арачидойный глицерол (2-AG). Эндоканнабиноиды играют много важных ролей, в том числе тех, кто участвует в системах вознаграждения мозга, а также наркомании, памяти, настроения и метаболических процессов2. AEA и 2-AG синтезируются только тогда, когда это необходимо и имеют короткий срок службы, и они деградируют через перенастройку транспортного белка и гидролиз3.
Использование животных моделей, как Caenorhabditis elegans (C. elegans) стало важным для изучения большого разнообразия биологических процессов, включая апоптоз, сигнализация клеток, клеточный цикл, клеточная полярность, регуляция генов, метаболизм, старение, и определение пола4,5. Кроме того, C. elegans является отличной моделью для изучения физиологической роли полиненасыщенных жирных кислот (ПУФА). AEA был выявлен в C. elegans и уменьшается в соответствии с диетическим ограничением6. Этот дефицит продлевает срок службы нематод через механизм диетического ограничения, которые могут быть подавлены добавками с эндоканнабиноидом. Недавно было обнаружено, что 2-AG и AEA играют основополагающую роль в регулировании торговли холестерином в C. elegans7. Что еще более важно, было установлено, что добавки с экзогенными 2-AG может спасти dauer арест, который вызван нарушениями торговли холестерином в Niemann-Pick типа C1 C. elegans мутантов.
Чтобы лучше понять связь 2-AG с торговлей холестерином и другими биологическими процессами в нематоде (т.е. моноаминерской сигнализации, ноцицепции и передвижения), крайне важно изучить этот эндогенный метаболит и как это пострадавших при определенных экологических и диетических условиях8,9,10,11,12,13. Поэтому крайне важно разработать и оптимизировать метод обнаружения и количественной оценки эндогенных 2-AG в C. elegans, который прост в использовании для ученых различных областей, особенно тех, кто изучает поведение нематод в связи с этим эндоканнабиноид.
В 2008 году Летхонен и его коллеги с помощью аналитических методов LC-MS удалось выявить 2-AG и AEA в C. elegans с помощью аналитических методов LC-MS14. В 2011 году им удалось расширить эту технику на другие эндоканнабиноиды15. Более поздние работы показали другие аналитические методы, которые были успешными в обнаружении и количественной оценке эндоканнабиноидов в C. elegans, в том числе масс-спектрометрии и GC-MS16,17,18, и он также сообщалось, что аналогичные аналитические методы могут быть расширены на другие модели19.
Ранее сообщалось аналитических методов, используемых для количественной оценки 2-AG в биологических образцов, как правило, включают в себя использование deuterated стандартов, которые приобретаются на коммерческой основе и требуют наличия для покупки20,21. Многие аналитические стандарты для LC-MS/MS количественной оценки эндоканнабиноидов коммерчески доступны у различных поставщиков. Тем не менее, они дорогие, чувствительны, и окисляются с течением времени, из-за наличия нескольких двойных облигаций. Наиболее распространенные версии этих стандартов основаны на окта-деютированной арахидоновой кислоты и подходят для количественной оценки с помощью изотопного разбавления LC-MS/MS14,22. Кроме того, большинство из этих стандартов заменяются в положении 2 глицерола, что делает их нестабильными в большинстве условий, поскольку они склонны к ацил-миграции19,23.
Для преодоления трудностей, связанных с затратами и стабильностью этих дейтерированных стандартов, представлен удобный и простой метод подготовки аналитического стандарта на основеглицерола-d 5. Последовательность для подготовки пента-деутерированный стандарт требует трехступенчатой процедуры, что приводит к стандартной 1-AG-D5, которая является стабильной и не подвергается ацил миграции (основной вопрос при направлении синтеза 2-monoacylglycerols).
Основная цель здесь заключается в том, чтобы показать простой и воспроизводимый метод для изучения 2-AG в C. elegans, в том числе синтез аналитического deuterated стандарта, подготовка и извлечение образцов нематод, и анализ LC-MS/MS (Рисунок 1 ). Эта синтетическая процедура достижима без сложных знаний органического синтеза или специального оборудования, что делает ее подходящей для ученых из разных областей, которые изучают поведение C. elegans под влиянием эндоканнабиноидов. Этот метод также может быть расширен по другим исследовательским моделям, что делает его полезным для различных целей. Стандарт, подготовленный, как сообщалось здесь, был применен для успешного разработки быстрого и надежного хроматографического метода, который позволяет эффективно обнаруживать и количественно 2-AG воспроизводимым образом.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

Эта работа представляет собой метод подготовки аналитического стандарта для качественного и количественного анализа 2-арачидоилглицерола (2-AG) с помощью жидкой хроматографии-электроспрепи ионизации-тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS). Эндоканнабиноиды являются консервированными липидными посредниками, которые регулируют несколько биологических процессов в различных организмах. В C. elegans, 2-AG было установлено, обладают различными ролями, в том числе модуляция dauer формирования и метаболизмхолестерина. В настоящем докладе описывается метод преодоления трудностей, связанных с затратами и стабильностью дейтерированных стандартов, необходимых для количественной оценки 2-АГ. Процедура синтеза стандарта проста и может быть выполнена в любой лаборатории, без необходимости проведения экспертизы органического синтеза или специального оборудования. Кроме того, описана модификация метода Фолч для извлечения пониженного стандарта из культуры C. elegans. Наконец, описан количественный и аналитический метод обнаружения 2-AG с использованием стабильного изотопно помеченного аналога 1-AG-d5, который обеспечивает надежные результаты в быстрохроматографическом беге. Процедура полезна для изучения нескольких ролей 2-AG в C. elegans, а также применима к другим исследованиям метаболитов в различных организмах.

Изотопно помеченный аналог был успешно синтезированиз коммерчески доступных d 8-глицерол и арахидоновая кислота с помощью 3-ступенчатого синтетического метода(Рисунок 2, Рисунок 3). Эти шаги являются простыми и не требуют сложного ...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Эта работа описывает надежный и простой метод для обнаружения и количественной оценки эндоканнабиноидов 2-arachidonoylglycerol (2-AG) в C. elegans. Аналитический деутерированный стандарт, который мы подготовили и использовали для количественной оценки 2-AG с помощью изотопного разбавления и жидкой хроматографии-электроспрей ионизации-тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS).

Синтез пониженного стандарта для количественной оценки 2-Arachidonoylglycerol в Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Эндоканнабиноиды являются сохраненными липидными посредниками, которые регулируют несколько биологических процессов в различных организмах. Первые обнаруженные эндоканнабиноиды анандамид и 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. Нематод C.elegans является мощной моделью животных для изучения большого разнообразия биологических процессов.Недавно мы обнаружили, что 2-AG играет основополагающую роль в регулировании оборота холестерина в C.elegans. Вот почему стало необходимо разработать и оптимизировать метод для изучения эндогенных 2-AG путем обнаружения и количественной оценки в C.elegans. Ранее сообщалось аналитические методы количественной оценки 2-AG в биологических образцах, как правило, связаны с использованием дейтетерированных стандартов, которые коммерчески приобрели необходимы, чтобы они доступны для покупки.Тем не менее, они являются дорогостоящими, и из-за наличия нескольких двойных связей, чувствительны, чтобы окислиться с течением времени. Наиболее распространенная версия стандартов основана на октадеутерированной арахидоновой кислоте, пригодной для количественной оценки путем разбавления изотопов, жидкой хроматографии и спектроскопии задней массы. Для преодоления трудностей, связанных с стоимостью и стабильностью дейтетерированных стандартов для количественной оценки 2-AG, мы использовали удобный и простой метод для подготовки аналитического стандарта на основе дейтерия-5-глицерол.Последовательность для подготовки pendeuterated стандарт требует трех этапов процедуры. Можно храниться в защищенном виде до тех пор, пока это не будет необходимо. Основная цель этой работы состоит в том, чтобы показать полный метод изучения 2-AG в C.elegans от синтеза аналитического дейтерированного стандарта до подготовки и извлечения образцов нематод и, наконец, анализа жидкой хроматографии и масс-спектроскопии.Для получения deuterated 1-AG в качестве deuterated внутреннего стандарта для количественной оценки анализы следовать трехшаговому протоколу. Для того, чтобы защитить только первичные спирты, сначала добавьте 38 миллиграммов глицерола, обжигаемого до 10 миллилитров реакционной трубки с помощью трубы Pasteur и добавьте магнитный мешалку. Затем добавьте пять миллилитров ангидроуса DCM с помощью пяти миллилитров шприца Гамильтона и заполните трубку сухим азотом, чтобы создать инертную атмосферу.Приготовьте ванну с помощью мелкой двойной колбы, наполненной дистиллированным этиловый ацетат. Заполните герметично закрытую реакционной трубку внутри ванны и охладите ее, медленно добавляя жидкий азот в этиловый ацетат до тех пор, пока растворитель не будет заморожен. Осторожно, жидкость сильно кипит при комнатной температуре и может вызвать сильные ожоги при контакте с глазами и кожей.Затем добавьте 54 миллиграмма ангидроус-коллайдера с помощью шприца Гамильтона. Осторожно, коллайдин летучий и имеет очень сильный и неприятный запах. При 70 миллиграммах тербутил-диметил-цетилхлорида и перемешайте все в течение трех часов при температуре минус 78 градусов на магнитном мешалке.Добавьте два миллилитров рассола, чтобы утолить реакцию. Извлекайте раствор двумя миллилитров дистиллированного дихлорметана три раза с помощью отдельной воронки, каждый раз сохраняя органические экстракты. Затем смешайте три органических экстракта и высушите сульфит натрия.Очистить сырую смесь колонкой хроматографии с использованием кремнезема гель в качестве стационарной фазы и 10%увеличения гексана этил ацетат градиента, начиная со 100%гексана и заканчивая 100%этил ацетат. Для этого шага эстерификации, добавить 10 миллиграммов продукта ранее заявил 10 миллилитров реакционной трубки с помощью Пиппет Пастера и добавить магнитный мешалка. Добавьте два миллилитра ангидроуса DCM с помощью пяти миллилитров шприца Гамильтона и заполните трубку сухим азотом, чтобы создать инертную атмосферу.Охладить раствор до нуля градусов с помощью ледяной ванны. Объявление 36 миллиграммов арахидоновой кислоты с использованием многотомной регулируемой микропипюты и перемешать. Затем добавьте 15 миллиграммов 40-метил-аминопиридин и перемешайте.Добавьте 15 миллиграммов диакилпропилкарбодиимида с помощью многотомного регулируемого микропипта и перемешайте. Добавьте два миллилитров воды, чтобы утолить реакцию, а затем извлечь раствор с двумя миллилитров дистиллированной DCM три раза с помощью разделительной воронки. Комбинат три органических экстрактов и сухой над сульфитом натрия, очистить сырую смесь колонки хроматографии с использованием кремнезема гель в качестве стационарной фазы, то 10%увеличивая гексан этил ацетат градиент, начиная со 100% гексана и заканчивая 50 50%hexane этиловый ацетат.Наконец, для шага депротекторизации добавьте 15 миллиграммов ранее синтезированного продукта в реакционной трубку 10 миллилитров с помощью пипетки Pasteur и добавьте магнитный мешалку. Добавьте два миллилитров тетрагидрофурана из ангидрогидрофурана с помощью пяти миллилитров шприца Гамильтона и заполните трубку сухим азотом, чтобы создать инертную атмосферу. Затем охладить раствор до нуля градусов с помощью ледяной ванны.Добавьте 150 микролитров капельного раствора тетрабутиламмония в THF с помощью шприца Гамильтона. Через час добавьте два миллилитров воды, чтобы утолить реакцию. Извлекайте раствор с помощью двух миллилитров дистиллированной DCM три раза с помощью разделительной воронки.Смешайте три органических экстракта и высушите сульфит натрия. Для процедуры отбеливания, поверните червей на посеянные шесть сантиметров NGM пластин. Разрешить червь расти от двух до трех дней, так что Есть много яиц и gravid взрослых на тарелке.Если у вас есть много яиц и взрослых, залить пять миллилитров M9 на тарелку. Используя стеклянную пипетку, перенесите червей в 15 миллилитров соколиной трубки. Центрифуга трубки в течение двух минут на 2000 Г и гранулы червей.Всасывание большую часть M9, не нарушая червя гранулы. Добавьте три миллилитров раствора отбеливания и смешайте раствор осторожно, инвертировать в течение примерно пяти минут или до тех пор, пока вы не увидите уменьшение числа нетронутых взрослых червей. После того, как большинство тел растворились, центрифуга на 2000 Г в течение одной минуты.Всасывание большую часть раствора отбеливания, не нарушая червя гранулы. Добавьте 15 миллилитров M9 в трубку и хорошо перемешайте. Центрифуга снова на 2000 Г в течение одной минуты.Всасывание большую часть M9, не нарушая червя гранулы. Для подготовки образца червя, пусть N2 эмбрионов, полученных путем отбеливания процедуры было в ночь в буфере M9 на 20 градусов. Затем, урожай синхронизированных L1s путем центрифугирования трубки две минуты на 2000 Г.Вымойте червей с буфером M9 еще раз и количественно количество живых L1. Семя примерно 10000 червей в NGM пластин с одним миллилитр OP 50 Escherichia coli ранее сушеные.Инкубировать пластины по крайней мере в течение 48 часов при 20 градусах, пока черви не достигнут стадии L4. Урожай червей с помощью холодного буфера M9 в 50 миллилитров соколиной трубки. Вымойте их еще раз и передать их в 1,5 миллилитров трубки.Пеллет червей центрифугации на 2000 Г в течение одной минуты. Устраните большую часть супернатанта. Затем погрузите трубку в жидкий азот и перемешайте при температуре минус 80 градусов.Оттепель примерно 100 микролитров замороженных гранул червя принадлежащих N2, а затем добавить 1,3 миллилитров метанола. После этого, sonicate образец в течение четырех минут. После соника добавьте 1000 ppb внутреннего дейтератированного стандарта, 2,6 миллилитров хлороформа и 1,3 миллилитров 0,5 молара хлорида калия, 0,08 молара фосфорной кислоты к окончательному соотношению один к одному.Vortex образцы в течение одной минуты, а затем sonicate их в ультразвуковой водяной бане в течение 15 минут на льду. Vortex образцы снова дважды в течение одной минуты и центрифугировать их в течение 10 минут на 2000 G, чтобы вызвать фазовое разделение. Соберите нижнюю фазу в чистую стеклянную трубку, высушите ее под азотом и повторно нарисуйте в 100 микролитров ацетонитрила.Для успешной количественной оценки эндогенной 2-AG необходимо было синтезировать насыщенный аналог с помощью трехшагового метода. Затем он был добавлен в образцы червей, извлечены и проанализированы высокой производительности жидкой хроматографии, в сочетании с масс-спектрометрии. Используется в качестве внутреннего стандарта, синтетический дейтетерированный 1-AG был инструментом для количественной оценки эндогенного метаболита.Метод был оптимизирован с помощью переходов для 2-AG и для дейтетерированных 1-AG, где молекулы глицерола теряются. 2-AG эндогенные из образцов C.elegans был успешно обнаружен и количественно изотопного разбавления с химически синтезированных дейтетеризированных 1-AG с использованием высокой производительности жидкой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрии. Первый образец был подготовлен с дейтетерированным стандартом 1-AG, в то время как второй образец без стандарта.Поскольку первоначальная концентрация обнародуемого стандарта в выборке 1 и 3 составила 1000 ppb каждый, из пикового соотношения площади можно рассчитать эндогенную концентрацию 2-AG в выборке 340 ppb для образца 1 и 360 ppb для выборки 3, давая в среднем 350 ppb. Коэффициенты были рассчитаны как качество между пиковыми областями 2-AG и deuterated 1-AG, соответственно, для двух изолированных образцов. Оба с deuterated стандартом добавленным ранее к извлечению.Учитывая недавно обнаруженное значение 2-AG в повышении оборота холестерина и отсутствие информации о том, как липиды влияют на этот процесс, необходимо надежный метод обнаружения этого эндоканнабиноида. Ключевым шагом этого протокола стало успешное развитие простого и надежного синтетического метода, о чем сообщалось здесь для получения дейтетерированного аналога 2-AG. Большинство зарегистрированных методов количественной оценки моноаклоглицелол связаны с использованием коммерчески доступных аналитических стандартов, которые, как правило, являются дорогостоящими и нестабильными в обычных условиях хранения, что делает их недоступными для лабораторий с более низким бюджетом.Тем не менее, этот метод решает эту проблему, предлагая синтез стандарта с использованием более доступных стартовых материалов. Синтетический метод прямо вперед без сложных условий, необходимых, что делает его идеальным для ведения в любой лаборатории с минимальным оборудованием и доступ к реакционное, даже в сокращенном бюджете. Таким образом, эта новая процедура описывает прямой и воспроизводимый способ обнаружения и количественной оценки 2-AG, который поможет ответить на некоторые вопросы, поднятые после описания роли этих эндоканнабиноидов в торговле холестерином в C.elegans.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Количественная оценка изобилие и зарядки уровней передачи РНК в Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

На основе плиты крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans: Пробоподготовка для изучения метаболические изменения при сахарном диабете

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Количественная оценка коэнзима А в клетках и тканях

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

В Vivo Hydroxyl радикальный белок следдля изучения взаимодействия белков в Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...