Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación de la Agencia Nacional de Promoción Científica Tecnológica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P., y B.H.C. son becarios de CONICET. D.D.M. y G.R.L. son miembros de la Carrera de Investigación de CONICET. Estamos agradecidos a Gonzalo Lamberto (INMET) por el análisis de LC-MS/MS y la discusión útil. Ramiro Ortega y María Soledad Casasola han realizado rodajes y ediciones en coche desde la Dirección de Comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia y Políticas Internacionales, Universidad Nacional de Rosario en Rosario, Argentina.

1. Preparación 1-AG-d5
NOTA: Para obtener 1-AG-d5 como estándar interno deuterated para ensayos de cuantificación, siga el protocolo como se detalla a continuación.
<ol><li>Protección diferencial<ol>
<li>Para proteger únicamente los alcoholes primarios, primero agregue 38 mg de glicerol-d8 a un tubo de reacción de 10 ml utilizando una pipeta Pasteur y agregue un agitador magnético.</li>
		<li>Añadir 5 ml de diclorometano anhidro (DCM) utilizando una ...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. 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I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

Los endocannabinoides son una clase de lípidos que se han implicado en la regulación de la formación de dauer en C. elegans7. Más específicamente, la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados (PUF) es importante para el tráfico de colesterol y el desarrollo reproductivo de gusanos. Aquí se revela que 2-AG, un ácido araquidónico que contiene endocannabinoide, es responsable de restitución de la larva dauer a su ciclo normal en gusanos que han deteriorado el metabolismo del cole...

Los endocannabinoides regulan múltiples procesos biológicos en una variedad de organismos y se conservan mediadores de lípidos1. Los primeros endocannabinoides descubiertos y más bien caracterizados son anandamida (arachidonoylethanolamida, AEA) y 2-arachidonoyl glicerol (2-AG). Los endocannabinoides juegan muchos papeles críticos, incluyendo los involucrados en los sistemas de recompensa cerebral, así como la adicción a las drogas, memoria, estado de ánimo, y procesos metabólicos2. AEA y 2-AG sólo se sintetizan cuando es necesario y tienen una vida útil corta, y se degradan a través de la retoma de proteínas de transporte y la hidrólisis3.
El uso de modelos animales como Caenorhabditis elegans (C. elegans) se ha convertido en importante para estudiar la gran variedad de procesos biológicos incluyendo apoptosis, señalización celular, ciclo celular, polaridad celular, regulación genética, metabolismo, envejecimiento, y determinación del sexo4,5. Además, C. elegans es un excelente modelo para estudiar las funciones fisiológicas de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). AEA se ha identificado en C. elegans y se reduce bajo restricción dietética6. Esta deficiencia extiende la vida útil del nematodo a través de un mecanismo de restricción dietética que puede ser suprimido por la suplementación con el endocannabinoide. Recientemente, se descubrió que 2-AG y AEA desempeñan un papel fundamental en la regulación del tráfico de colesterol en C. elegans7. Más importante aún, se determinó que la suplementación con 2-AG exógeno puede rescatar el arresto de Dauer, que es causado por el deterioro del tráfico de colesterol en Niemann-Pick tipo C1 C. elegans mutantes.
Para comprender mejor la relación de 2-AG con el tráfico de colesterol y otros procesos biológicos en el nematodo (es decir, señalización monoaminérgica, nocicepción y locomoción), es crucial estudiar este metabolito endógeno y cómo es afectados en determinadas condiciones ambientales y dietéticas8,9,10,11,12,13. Por lo tanto, es imperativo diseñar y optimizar un método para detectar y cuantificar las 2-AG endógenas en C. elegans que sea fácil de usar para científicos de diferentes campos, especialmente aquellos que estudian el comportamiento del nematodo en relación con esto Endocannabinoide.
En 2008, Lethonen y sus compañeros de trabajo lograron identificar 2-AG y AEA en C. elegans utilizando los métodos analíticos de LC-MS14. En 2011, lograron expandir esta técnica a otros endocannabinoides15. Trabajos más recientes han mostrado otros métodos analíticos que han tenido éxito en la detección y cuantificación de endocannabinoides en C. elegans,incluyendo espectrometría de masas y GC-MS16,17,18, y ha también se ha informado de que métodos analíticos similares pueden ampliarse a otros modelos19.
Los métodos analíticos previamente notificados utilizados para cuantificar 2-AG en muestras biológicas suelen implicar el uso de normas deuterated que se adquieren comercialmente y requieren disponibilidad para la compra20,21. Muchos estándares analíticos para la cuantificación LC-MS/MS de endocannabinoides están disponibles comercialmente de diferentes proveedores. Sin embargo, son caros, son sensibles y se oxidan con el tiempo, debido a la presencia de múltiples enlaces dobles. Las versiones más comunes de estas normas se basan en el ácido araquidónico octa-deuterated y son adecuadas para la cuantificación mediante dilución isótopo LC-MS/MS14,22. Además, la mayoría de estas normas se sustituyen en la posición 2 del glicerol, haciéndolos inestables en la mayoría de las condiciones, ya que son propensos a la migración de acilo19,23.
Para superar las dificultades asociadas con los costos y la estabilidad de estas normas deuteradas, se presenta un método conveniente y sencillo para preparar un estándar analítico basado en glicerol-d5. La secuencia para preparar la norma penta-deuterated requiere un procedimiento de tres pasos que da como resultado el estándar 1-AG-d5, que es estable y no se somete a migración de acil (el problema principal cuando se pretende sintetizar 2-monoacilglycerols).
El objetivo principal aquí es mostrar un método simple y reproducible para estudiar 2-AG en C. elegans, incluyendo la síntesis del estándar deuterated analítico, la preparación y extracción de las muestras de nematodos, y el análisis por LC-MS/MS (Figura 1 ). Este procedimiento sintético es alcanzable sin el sofisticado conocimiento de síntesis orgánica o equipo especial, por lo que es adecuado para científicos de diferentes campos que están estudiando el comportamiento de C. elegans bajo influencia endocannabinoide. El método también se puede expandir a otros modelos de estudio, por lo que es útil para diferentes objetivos. La norma, preparada como se ha informado aquí, se ha aplicado para desarrollar con éxito un método cromatográfico rápido y fiable que permita la detección y cuantificación efectivas de 2-AG de manera reproducible.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

Este trabajo presenta un método para preparar un estándar analítico para analizar 2-arachidonoyl glicerol (2-AG) cualitativa y cuantitativamente mediante cromatografía líquida-electrospray ionización-espectrometría de masas tándem (LC-ESI-MS/MS). Los endocannabinoides son mediadores de lípidos conservados que regulan múltiples procesos biológicos en una variedad de organismos. En C. elegans,2-AG se ha encontrado que poseen diferentes funciones, incluyendo la modulación de la formación de dauer y el metabolismo del colesterol. Este informe describe un método para superar las dificultades asociadas con los costos y la estabilidad de las normas deuteradas necesarias para la cuantificación de 2 AG. El procedimiento para la síntesis de la norma es simple y se puede realizar en cualquier laboratorio, sin necesidad de experiencia en síntesis orgánica o equipo especial. Además, se describe una modificación del método de Folch para extraer el estándar deuterated de la cultura C. elegans. Por último, se describe un método cuantitativo y analítico para detectar 2-AG utilizando el análogo 1-AG-d5 etiquetado isotópicamente estable, que proporciona resultados fiables en una ejecución cromatográfica rápida. El procedimiento es útil para estudiar las múltiples funciones de 2-AG en C. elegans mientras que también es aplicable a otros estudios de metabolitos en diferentes organismos.

Un análogo etiquetado isotópicamente fue sintetizado con éxito a partir de d8-glicerol y ácido araquidónico disponibles comercialmente utilizando un método sintético de 3 pasos(Figura 2, Figura 3). Estos pasos son sencillos y no requieren equipos sofisticados, condiciones especialmente controladas o costosos reactivos. Por lo tanto, este método es robusto y puede extenderse con éxito para sintetizar monoacilgl...

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Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Este trabajo describe un método robusto y sencillo para detectar y cuantificar el endocannabinoide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) en C. elegans. Un estándar analítico deuterado nos preparó y utilizó para la cuantificación de 2-AG por dilución isotópica y cromatografía líquida-electrospray ionización-espectrometría de masas tándem (LC-ESI-MS/MS).

Síntesis de un estándar deuterated para la cuantificación de 2-Arachidonoylglycerol en Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Los endocannabinoides son mediadores lipídicos conservados que regulan múltiples procesos biológicos en una variedad de organismos. Los primeros endocannabinoides descubiertos son anandamida y 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. El nematodo C.elegans es un potente modelo animal para estudiar una gran variedad de procesos biológicos.Recientemente, descubrimos que 2-AG desempeña un papel fundamental en la regulación del tráfico de colesterol en C.elegans. Es por esto que se hizo imperativo diseñar y optimizar un método para estudiar endógeno 2-AG mediante la detección y cuantificación en C.elegans. Los métodos analíticos previamente notificados para cuantificar 2-AG en muestras biológicas generalmente implican el uso de normas deuterated que son comerciales adquiridas están obligados a tenerlos disponibles para su compra.Sin embargo, son caros, y debido a la presencia de múltiples enlaces dobles, son sensibles a oxidarse con el tiempo. La versión más común de las normas se basa en el ácido araquidónico octadeuterated siendo adecuado para la cuantificación por dilución de isótopos, por cromatografía líquida, y espectroscopia de masa posterior. Para superar las dificultades asociadas al costo y estabilidad de las normas deuterificadas para cuantificar 2-AG, utilizamos un método cómodo y sencillo para preparar un estándar analítico basado en el deuterio-5-glicerol.La secuencia para preparar el estándar pendeuterated requiere un procedimiento de tres pasos. Ser posible mantenerse en la forma protegida hasta que sea necesario. El objetivo principal de este trabajo es mostrar un método completo para estudiar 2-AG en C.elegans desde la síntesis del estándar analítico deuterated hasta la preparación y extracción de las muestras de nematodos y, por último, el análisis por cromatografía líquida y espectroscopia de masas.Para obtener 1-AG deuterated como un estándar interno deuterated para ensayos de cuantificación, siga un protocolo de tres pasos. Con el fin de proteger únicamente los alcoholes primarios, primero agregue 38 miligramos de glicerol deuterated a un tubo de reacción de 10 mililitros utilizando una pipeta Pasteur y agregue un agitador magnético. A continuación, agregue cinco mililitros de DCM anhidro utilizando una jeringa Hamilton de cinco mililitros y llene el tubo con nitrógeno seco para dar una atmósfera inerte.Prepare un baño con un matraz Dewar poco profundo lleno de acetato de etilo destilado. Llene el tubo de reacción herméticamente cerrado dentro del baño y enfríelo añadiendo lentamente nitrógeno líquido al acetato de etilo hasta que el disolvente se congele. Precaución, el líquido hierve violentamente a temperatura ambiente y puede causar quemaduras graves si está en contacto con los ojos y la piel.A continuación, agregue 54 miligramos de collidina anhidra usando una jeringa de Hamilton. Precaución, collidina es volátil y tiene un olor muy fuerte y desagradable. A 70 miligramos de terbutile-dimetil-cetilcloruro y remueva todo durante tres horas a menos 78 grados en un agitador magnético.Añadir dos mililitros de salmuera para apagar la reacción. Extraer la solución con dos mililitros de diclorometano destilado tres veces utilizando un embudo separado manteniendo los extractos orgánicos cada vez. A continuación, combine los tres extractos orgánicos y seque sobre el sulfito de sodio.Purificar la mezcla bruta por cromatografía de columna utilizando gel de sílice como fase estacionaria y un gradiente de acetato de etilo de hexano 10% a partir de 100% hexano y terminando con acetato de etilo 100%. Para este paso de esterificación, añadir 10 miligramos del producto previamente indicado a un tubo de reacción de 10 mililitros utilizando un pipte Pasteur y añadir un agitador magnético. Añadir dos mililitros de DCM anhidro utilizando una jeringa Hamilton de cinco mililitros y llenar el tubo con nitrógeno seco para dar una atmósfera inerte.Enfríe la solución a cero grados usando un baño de hielo. Ad 36 miligramos de ácido araquidónico usando una micropipeta ajustable multivolta por volumen y revuelva. Luego, añadir 15 miligramos de 40-metil-aminopiridina y remover.Agregue 15 miligramos de diacylpropylcarbodiimid usando una micropipeta ajustable multivoltave y revuelva. Añadir dos mililitros de agua para apagar la reacción y luego extraer la solución con dos mililitros de DCM destilado tres veces utilizando un embudo de separación. Combinar los tres extractos orgánicos y sulfito de sodio seco sobre sodio, purificar la mezcla bruta por cromatografía de columna utilizando gel de sílice como fase estacionaria y luego un 10% aumento del gradiente de acetato de etilo de hexano a partir de 100% hexano y terminando con 50 50%acetato de etilo de hexano.Finalmente, para el paso de desprotección, añadir 15 miligramos del producto previamente sintetizado a un tubo de reacción de 10 mililitros utilizando una pipeta Pasteur y añadir un agitador magnético. Añadir dos mililitros de tetrahidrofurano anhidro utilizando una jeringa Hamilton de cinco mililitros y llenar el tubo con nitrógeno seco para dar una atmósfera inerte. A continuación, enfríe la solución a cero grados usando un baño de hielo.Añadir 150 microlitros gotas de una solución molar de fluoruro de tetrabutilamonio en THF utilizando una jeringa Hamilton. Después de una hora, agregue dos mililitros de agua para apagar la reacción. Extraiga la solución con dos mililitros destilados DCM tres veces utilizando un embudo de separación.Combine los tres extractos orgánicos y seque sobre el sulfito de sodio. Para el procedimiento de blanqueo, gire los gusanos en placas NGM de seis centímetros de semilla. Deje que el gusano crezca de dos a tres días para que haya muchos huevos y adultos gravid en el plato.Una vez que tenga un montón de huevos y adultos, vierta cinco mililitros de M9 en el plato. Con una pipeta de vidrio, transfiera los gusanos a un tubo de halcón de 15 mililitros. Centrifugar el tubo durante dos minutos a 2.000 G y peletizar los gusanos.Succiona la mayor parte del M9 sin alterar el pellet de gusano. Agregue tres mililitros de solución de blanqueo y mezcle la solución suavemente invirtiendo durante aproximadamente cinco minutos o hasta que vea una disminución en el número de gusanos adultos intactos. Una vez que la mayoría de los cuerpos se han disuelto, centrifugar a 2.000 G durante un minuto.Succionar la mayor parte de la solución de blanqueo sin alterar el pellet de gusano. Añadir 15 mililitros de M9 al tubo y mezclar bien. Centrifugar de nuevo a 2.000 G durante un minuto.Succiona la mayor parte del M9 sin alterar el pellet de gusano. Para la preparación de muestras de gusanos, deje que los embriones N2 obtenidos por procedimiento de blanqueo tuvieron durante la noche en tampón M9 a 20 grados. Luego, cosecha L1s sincronizados centrifugando el tubo dos minutos a 2.000 G.Lave los gusanos con Tampón M9 una vez más y cuantifique el número de L1 vivo. Semilla de aproximadamente 10.000 gusanos en placas NGM con un mililitro de OP 50 Escherichia coli previamente secados.Incubar las placas al menos durante 48 horas a 20 grados hasta que los gusanos alcancen la etapa L4. Cosecha los gusanos usando un tampón M9 frío en un tubo de halcón de 50 mililitros. Lávelos una vez más y transfiéralos a un tubo de 1,5 mililitros.Pele los gusanos por centrifugación a 2.000 G durante un minuto. Elimine la mayor parte del sobrenadante. A continuación, sumerja el tubo en nitrógeno líquido y revuelva a menos 80 grados.Descongelar aproximadamente 100 microlitros de pellets de gusano congelados pertenecientes a N2 y luego añadir 1,3 mililitros de metanol. Después de eso, sonicar la muestra durante cuatro minutos. Después de la sonicación, agregue 1.000 ppb del estándar interno deuterated, 2,6 mililitros de cloroformo y 1,3 mililitros de 0,5 molares de cloruro de potasio, 0,08 molares de ácido fosfórico a una proporción final de uno a uno.Vórtice las muestras durante un minuto y luego sonicarlas en un baño de agua ultrasónica durante 15 minutos sobre hielo. Vórtice las muestras de nuevo dos veces durante un minuto y centrifugarlas durante 10 minutos a 2.000 G para inducir la separación de fase. Recoger la fase inferior en un tubo de vidrio limpio, secarlo bajo nitrógeno y resuspendrlo en 100 microlitros de acetonitrilo.Para lograr una cuantificación exitosa del endógeno 2-AG, era necesario sintetizar su análogo saturado utilizando un método de tres pasos. Posteriormente, se añadió a muestras de gusanos, extraídas y analizadas por cromatografía líquida de alto rendimiento, acopladas a espectrometría de masas. Utilizado como estándar interno, el sintético deuterated 1-AG fue la herramienta para cuantificar el metabolito endógeno.El método se optimizó utilizando las transiciones para 2-AG y para 1-AG deuterated donde se pierden moléculas de glicerol. 2-AG endógeno de las muestras de C.elegans fue detectado y cuantificado con éxito por dilución isotópica con el 1-AG sintetizado químicamente utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas. La muestra uno se preparó con el estándar deuterated 1-AG, mientras que la muestra dos sin el estándar.Dado que la concentración original del estándar deutado en la muestra uno y tres era de 1.000 ppb cada una, a partir de la relación de área máxima es posible calcular la concentración endógena de 2-AG en la muestra de 340 ppb para la muestra uno y 360 ppb para la muestra tres, dando una media de 350 ppb. Las relaciones se calcularon como una calidad entre las áreas pico de 2-AG y 1-AG deuterated, respectivamente, para dos muestras aisladas. Ambos con el estándar deuterated añadido antes de la extracción.Dada la importancia recientemente descubierta de 2-AG en la mejora del tráfico de colesterol y la falta de información de cómo los lípidos influyen en ese proceso, era necesario un método de detección confiable para este endocannabinoide. El desarrollo exitoso de un método sintético simple y robusto reportado aquí para obtener analógico deuterated 2-AG fue un paso clave de este protocolo. La mayoría de los métodos notificados para cuantificar los monoacylglycerols implican el uso de normas analíticas disponibles comercialmente, que suelen ser costosas e inestables en condiciones de almacenamiento regulares, lo que las convierte en inalcanzables para laboratorios de menor presupuesto.Sin embargo, este método resuelve esto proponiendo una síntesis de la norma utilizando materiales de partida más accesibles. El método sintético es directo sin condiciones sofisticadas necesarias, por lo que es ideal para realizar en cualquier laboratorio con un equipo mínimo y acceso a los reactivos, incluso con un presupuesto reducido. En resumen, este nuevo procedimiento describe una forma directa y reproducible de detectar y cuantificar 2-AG que ayudará a responder a algunas de las preguntas planteadas después de la descripción del papel de estos endocannabinoides en el tráfico de colesterol en C.elegans.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigación

Bioquímica

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Cuantificación de la abundancia y la carga de los niveles de ARN de transferencia en Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Un método colorimétrico para medir el contenido de hierro en plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

En Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para el Estudio de Interacciones Proteicas en Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...