Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett forskningsanslag från Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P., och B.H.C. är stipendiater från CONICET. D.d.M. och GRL är medlemmar i forskningskarriären för CONICET. Vi är tacksamma för att Gonzalo Lamberto (INMET) för LC-MS/MS analys och hjälpsam diskussion. Videoupptagning och-redigering har gjorts av Ramiro Ortega och María Soledad Casasola från Dirección de Comunicación de La Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario i Rosario, Argentina.

1.1-AG-d5 förberedelse
Anmärkning: för att erhålla 1-AG-d5 som en deuterad intern standard för kvantifiering analyser, följ protokollet som beskrivs nedan.
<ol><li>Differentiellt skydd<ol>
<li>För att endast skydda primära alkoholer, tillsätt först 38 mg glycerol-d8 till en 10 ml reaktions slang med en Pasteur pipett och tillsätt en magnetisk omrörare.</li>
		<li>Tillsätt 5 mL vattenfri diklormetan (DCM) med hjälp av en 5 mL Hamilton-spruta och ...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence.">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li><li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms.">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine:+a+simple+model+for+a+complex+discipline.">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li><li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves.">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).</li><li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves.">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).</li><li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

Endocannabinoids är en klass av lipider som har varit inblandade i regleringen av varaktighet formation i C. elegans7. Mer specifikt är syntesen av fleromättade fettsyror (PUFAs) viktigt för kolesterol handel och reproduktiva utvecklingen av maskar. Det avslöjas här att 2-AG, en arakidonsyra syra innehåller endocannabinoid, är ansvarig för att restitutera den varaktighet larv till sin normala cykel i maskar som har nedsatt kolesterol metabolism7.
<p cl...

Endocannabinoids reglera flera biologiska processer i en mängd olika organismer och bevaras Lipidmediatorer1. Den första upptäckta och mest välkarakteriserade Endocannabinoids är anandamid (arachidonoylethanolamide, AEA) och 2-arachidonoyl glycerol (2-AG). Endocannabinoids spela många viktiga roller, inklusive de som deltar i hjärnan belöningssystem samt narkotikamissbruk, minne, humör, och metaboliska processer2. AEA och 2-AG är endast syntetiserade när det behövs och har korta livslängder, och de bryts ned genom transport protein återupptaget och hydrolys3.
Användningen av djurmodeller som Caenorhabditis elegans (C. elegans) har blivit viktigt att studera den stora variationen av biologiska processer inklusive apoptos, cellsignalering, cell cykel, cellpolaritet, genreglering, metabolism, åldrande, och könsbestämning4,5. Dessutom är C. elegans en utmärkt modell för att studera de fysiologiska rollerna av fleromättade fettsyror (pufas). AEA har identifierats i C. elegans och reduceras enligt diet restriktioner6. Denna brist förlänger livslängden på Nematoden genom en mekanism för dietrestriktioner som kan dämpas av tillskott med endocannabinoid. Nyligen upptäcktes att 2-AG och AEA spelar grundläggande roller i regleringen av kolesterol handel i C. elegans7. Ännu viktigare, det bestämdes att tillskott med exogena 2-AG kan rädda varaktighet gripande, som orsakas av nedsatt kolesterol handel i Niemann-Pick typ C1 C. elegans mutanter.
För att få en bättre förståelse av 2-AG: s relation med kolesterol handel och andra biologiska processer i Nematoden (dvs., monoaminerga signalering, nociception och förflyttning), är det viktigt att studera denna endogena metabolit och hur det är påverkas under vissa miljö-och diet förhållanden8,9,10,11,12,13. Därför är det viktigt att utforma och optimera en metod för att upptäcka och kvantifiera endogena 2-AG i C. elegans som är enkel att använda för forskare inom olika områden, särskilt de som studerar nematode beteende i förhållande till denna endocannabinoida.
I 2008 lyckades Lethonen och medarbetarna identifiera 2-AG och AEA i C. elegans med hjälp av LC-MS analytiska metoder14. I 2011, lyckades de att utvidga denna teknik till andra Endocannabinoids15. Nyare arbete har visat andra analytiska metoder som har varit framgångsrika i att upptäcka och kvantifiera Endocannabinoids i C. elegans, inklusive masspektrometri och GC-MS16,17,18, och det har också rapporterats att liknande analysmetoder kan utökas till andra modeller19.
Tidigare rapporterade analysmetoder som används för att kvantifiera 2-AG i biologiska prover innebär vanligtvis användning av deutderade standarder som är kommersiellt förvärvade och kräver tillgänglighet för köpet20,21. Många analytiska standarder för LC-MS/MS kvantifiering av Endocannabinoids är kommersiellt tillgängliga från olika leverantörer. Ändå, de är dyra, är känsliga, och blir oxiderade över tiden, på grund av närvaron av flera dubbelbindningar. De vanligaste versionerna av dessa standarder är baserade på den Octa-deutiska arakidsyran och är lämpliga för kvantifiering genom Isotoputspädning LC-MS/MS14,22. Också, de flesta av dessa standarder ersätts i läge 2 av glycerol, vilket gör dem instabila under de flesta förhållanden eftersom de är benägna att Acyl migration19,23.
För att övervinna de svårigheter som är förknippade med kostnaderna och stabiliteten i dessa deutade standarder, en bekväm och enkel metod presenteras för att förbereda en analytisk standard baserad på glycerol-d5. Sekvensen för att förbereda den Penta-deutererade standarden kräver ett tre stegs förfarande som resulterar i standard 1-AG-d5, som är stabil och inte genomgår Acyl migration (den viktigaste frågan när man siktar på att syntetisera 2-monoacylglycerols).
Det huvudsakliga målet här är att visa en enkel och reproducerbar metod för att studera 2-AG i C. elegans, inklusive syntesen av den analytiska deutererstandarden, beredning och extraktion av nematodproverna, och analys av LC-MS/MS (figur 1 ). Detta syntetiska förfarande är uppnåeligt utan sofistikerade organiska syntes kunskap eller speciell utrustning, vilket gör det lämpligt för forskare från olika områden som studerar C. elegans beteende under endocannabinoida inflytande. Metoden är också utbyggbar till andra studiemodeller, vilket gör den användbar för olika mål. Standarden, som utarbetats som rapporterats här, har tillämpats för att framgångsrikt utveckla en snabb och tillförlitlig kromatografisk metod som möjliggör effektiv detektering och kvantifiering av 2-AG på ett reproducerbart sätt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

Detta arbete presenterar en metod för att förbereda en analytisk standard för att analysera 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) kvalitativt och kvantitativt genom vätskekromatografi-elektrospray jonisering-tandem masspektrometri (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids är bevarade Lipidmediatorer som reglerar flera biologiska processer i en mängd olika organismer. I C. elegans, 2-AG har befunnits ha olika roller, inklusive modulering av varaktighet formation och kolesterol metabolism. I denna rapport beskrivs en metod för att övervinna de svårigheter som är förknippade med kostnaderna och stabiliteten för de deuteras standarder som krävs för beräkning av 2 AG. Förfarandet för syntes av standarden är enkel och kan utföras i alla laboratorier, utan behov av organisk syntes expertis eller särskild utrustning. Dessutom beskrivs en ändring av Folchs metod för att extrahera den deuterta standarden från kulturen i C. elegans . Slutligen beskrivs en kvantitativ och analytisk metod för att detektera 2-AG med hjälp av den stabila isotopiskt märkta analoga 1-AG-d5 , som ger pålitliga resultat i en snabb kromatografisk körning. Förfarandet är användbart för att studera de multipla rollerna av 2-AG i C. elegans och samtidigt vara tillämpliga på andra studier av metaboliter i olika organismer.

En isotopiskt märkt analog har framgångsrikt syntetiserats från kommersiellt tillgängliga d8-glycerol och arakidonsyra Acid med en 3-stegs syntetisk metod (figur 2, figur 3). Dessa steg är enkla och kräver inte sofistikerad utrustning, särskilt kontrollerade förhållanden, eller dyra reagenser. Sålunda, denna metod är robust och kan framgångsrikt utvidgas till att syntetisera monoacylglycerides som innehåll...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Detta arbete beskriver en robust och enkel metod för att upptäcka och kvantifiera endocannabinoida 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) i C. elegans. En analytisk deuterisk standard USA beredd och används för kvantifiering av 2-AG med Isotoputspädning och vätskekromatografi-elektrospray jonisering-tandem masspektrometri (LC-ESI-MS/MS).

Syntes av en Deuterat standard för kvantifiering av 2-Arachidonoylglycerol i Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Endocannabinoider bevaras lipid mediatorer som reglerar flera biologiska processer i en mängd olika organismer. De första upptäckta endocannabinoider är anandamid och 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. Nematoden C.elegans är en kraftfull djurmodell för att studera en stor variation av biologiska processer.Nyligen upptäckte vi att 2-AG spelar en grundläggande roll i regleringen av kolesterolhandeln i C.elegans. Det är därför det blev absolut nödvändigt att utforma och optimera en metod för att studera endogen 2-AG genom detektion och kvantifiering i C.elegans. Tidigare rapporterade analysmetoder för att kvantifiera 2-AG i biologiska prover innebär vanligtvis användning av deutererade standarder som är kommersiella förvärvade krävs för att ha dem tillgängliga för inköp.Ändå är de dyra, och på grund av förekomsten av flera dubbelbindningar, är känsliga för att få oxideras över tiden. Den vanligaste versionen av standarderna är baserade på att den okadeutererade arakidonsyran är lämplig för kvantifiering genom isotoputspädning, genom vätskekromatografi och bakre masspektroskopi. För att övervinna de svårigheter som är förknippade med kostnaden och stabiliteten för de deutererade standarderna för att kvantifiera 2-AG, använde vi en bekväm och enkel metod för att förbereda en analytisk standard baserad på deuterium-5-glycerol.Sekvensen för att förbereda den pendeuterade standarden kräver en tre steg förfarande. Att vara möjligt att hållas i skyddad form tills det behövs. Huvudsyftet med detta arbete är att visa en komplett metod för att studera 2-AG i C.elegans från syntesen av den analytiska utsarmerade standarden till beredning och extraktion av nematodproverna och slutligen, analysen genom vätskekromatografi och masspektroskopi.För erhållande av deuterated 1-AG som en deuterated inre standard för kvantifiering assays följa en tre steg protokoll. För att bara skydda primära alkoholer, först lägga 38 milligram glycerol deuterated till en 10 milliliter reaktionsrör med hjälp av en Pasteur pipett och lägga till en magnetisk omrörare. Tillsätt sedan fem milliliter vattenfri DCM med hjälp av en fem milliliter Hamilton spruta och fyll röret med torrt kväve för att ge en inert atmosfär.Bered ett bad med hjälp av en grund Dewar kolv fylld med destillerat etylacetat. Fyll det hermetiskt slutna reaktionsröret inuti badet och kyl det genom att långsamt tillsätta flytande kväve i etylacetat tills lösningsmedlet är fruset. Försiktighet, vätska kokar våldsamt vid rumstemperatur och kan orsaka svåra brännskador vid kontakt med ögon och hud.Lägg sedan till 54 milligram vattenfri kolliderar med hjälp av en Hamilton spruta. Försiktighet, collidine är flyktigt och har en mycket stark och obehaglig lukt. Vid 70 milligram terbutile-dimetyl-cetylklorid och rör om allt i tre timmar vid minus 78 grader på en magnetisk omrörare.Tillsätt två milliliter saltlake för att släcka reaktionen. Extrahera lösningen med två milliliter destillerat diklormetan tre gånger med hjälp av en separerad tratt som håller de organiska extrakten varje gång. Sedan, kombinera de tre organiska extrakt och torka över natriumsulfit.Rena råblandningen genom kolonnkromatografi med kiselgel som stationär fas och en 10%ökande hexan etylacetatgradient med början från 100%hexan och avsluta med 100%etylacetat. För denna esterification steg, tillsätt 10 milligram av produkten som tidigare uppgetts till en 10 milliliter reaktionsrör med hjälp av en Pasteur pippette och lägga till en magnetisk omrörare. Tillsätt två milliliter vattenfri DCM med en fem milliliter Hamilton spruta och fyll röret med torrt kväve för att ge en inert atmosfär.Kyl lösningen till noll grader med hjälp av ett isbad. Ad 36 milligram arakidonsyra med hjälp av en flera volymer justerbar mikropipette och rör om. Sedan, tillsätt 15 milligram 40-metyl-aminopyridin och rör om.Tillsätt 15 milligram diacylpropylcarbodiimid med hjälp av en flervolymsjusterbar mikropipette och rör om. Tillsätt två milliliter vatten för att släcka reaktionen och extrahera sedan lösningen med två milliliter destillerat DCM tre gånger med hjälp av en separertratt. Kombinera de tre organiska extrakt och torka över natriumsulfit, rena råblandningen genom kolonnkromatografi med kiselgel som en stationär fas en sedan 10%öka hexan etylacetatgradienten med början från 100%hexan och efterbehandling med 50 50%hexan etylacetat.Slutligen, för deprotection steg, tillsätt 15 milligram av den tidigare syntetiserade produkten till en 10 milliliters reaktionsrör med hjälp av en Pasteur pipett och lägga till en magnetisk omrörare. Tillsätt två milliliter vattenfri tetrahydrofuran med en fem milliliter Hamilton spruta och fyll röret med torrt kväve för att ge en inert atmosfär. Kyl sedan lösningen till noll grader med hjälp av ett isbad.Tillsätt 150 mikroliter drop-vis av en molarlösning av tetrabutylammoniumfluorid i THF med hjälp av en Hamilton-spruta. Efter en timme, tillsätt två milliliter vatten för att släcka reaktionen. Extrahera lösningen med två milliliter destillerat DCM tre gånger med hjälp av en separertratt.Kombinera de tre organiska extrakten och torka över natriumsulfit. För blekning förfarandet, vänd maskar på seedade sex centimeter NGM plattor. Låt masken växa från två till tre dagar så att det finns massor av ägg och gravid vuxna på tallriken.När du har gott om ägg och vuxna, häll fem milliliter M9 på plattan. Med hjälp av en glaspipett överför du maskarna till ett 15 milliliters falcon-rör. Centrifugera röret i två minuter vid 2, 000 G och pellet maskarna.Sug de flesta av M9 utan att störa masken pelleten. Tillsätt tre milliliter blekningslösning och blanda lösningen försiktigt genom att invertera i ungefär fem minuter eller tills du ser en minskning av antalet intakta vuxna maskar. När de flesta av kropparna har upplösts, centrifug vid 2, 000 G i en minut.Sug det mesta av blekningslösningen utan att störa maskpelleten. Tillsätt 15 milliliter M9 till röret och blanda väl. Centrifugera igen vid 2, 000 G i en minut.Sug de flesta av M9 utan att störa masken pelleten. För beredning av maskprov, låt N2 embryon som erhållits genom blekning förfarande hade i natten i M9 buffert vid 20 grader. Sedan, skörda synkroniserade L1s genom centrifugering röret två minuter vid 2, 000 G.Wash maskarna med M9 buffert en gång till och kvantifiera antalet levande L1. Frö cirka 10, 000 maskar i NGM plattor med en milliliter av OP 50 Escherichia coli tidigare torkat.Inkubera plattorna minst i 48 timmar vid 20 grader tills maskarna når L4-stadiet. Skörda maskarna med hjälp av kall M9-buffert i ett 50 milliliters falkrör. Tvätta dem en gång till och överför dem till ett 1,5 milliliterrör.Pellet maskarna genom centrifugering vid 2, 000 G i en minut. Eliminera de flesta av supernatant. Sänk sedan ner röret i flytande kväve och rör om i minus 80 grader.Tina cirka 100 mikroliter av frysta maskpellets som tillhör N2 och tillsätt sedan 1,3 milliliter metanol. Efter det, sonikera provet i fyra minuter. Efter ultraljudsbehandling, tillsätt 1, 000 ppb av den inre deuterated standarden, 2,6 milliliter av kloroform, och 1,3 milliliter av 0,5 molar av kaliumklorid, 0,08 molar av fosforsyra till ett slutligt förhållande av en till en.Vortexa proverna i en minut och sedan sonikera dem i ett ultraljud vattenbad i 15 minuter på is. Vortexa proverna igen två gånger i en minut och centrifug dem i 10 minuter vid 2, 000 G för att inducera fasskiljning. Samla den nedre fasen i ett rent glasrör, torka den under kväve, och resuspend det i 100 mikroliter acetonitril.För att uppnå en lyckad kvantifiering av den endogena 2-AG, var det nödvändigt att syntetisera det är mättad analog med hjälp av en tre steg metod. Efteråt, det lades till mask prover, extraheras och analyseras av högpresterande vätskekromatografi, kopplade till masspektrometri. Används som en intern standard, den syntetiska deuterated 1-AG var verktyget för att kvantifiera den endogena metaboliten.Metoden optimerades med hjälp av övergångarna för 2-AG och för deutenterade 1-AG där glycerolmolekyler går förlorade. 2-AG endogena från C.elegans proverna upptäcktes framgångsrikt och kvantifieras genom isotopisk utspädning med den kemiskt syntetiserade deuterized 1-AG med hjälp av högpresterande vätskekromatografi kopplade till masspektrometri. Prov ett var beredd med deuterated standard 1-AG, medan prov två utan standarden.Eftersom den ursprungliga koncentrationen av deutraterad standard i prov ett och tre var av 1, 000 ppb vardera, från toppareaförhållandet är det möjligt att beräkna den endogena koncentrationen av 2-AG i provet på 340 ppb för prov ett och 360 ppb för prov tre, vilket ger ett genomsnitt på 350 ppb. Nyckeltalen beräknades som en kvalitet mellan toppområdena 2-AG respektive deuterated 1-AG för två isolerade prover. Båda med deuterated standard lagts tidigare till extraktion.Med tanke på den nyligen upptäckta betydelsen av 2-AG i förbättringen av kolesterol handel och brist på information om hur lipider påverkar den processen, det var nödvändigt en tillförlitlig detektionsmetod för denna endocannabinooid. Den framgångsrika utvecklingen av en enkel och robust syntetisk metod som rapporteras här för att erhålla deuterated analog 2-AG var ett viktigt steg i detta protokoll. De flesta av de rapporterade metoderna för att kvantifiera monoacylglycerols innebär användning av kommersiellt tillgängliga analytiska standarder, som vanligtvis är dyra och instabila under regelbundna lagringsförhållanden, vilket gör dem till en onåbar för lägre budget laboratorier.Denna metod löser dock detta genom att föreslå en syntes av standarden med hjälp av mer tillgängliga utgångsmaterial. Den syntetiska metoden är rakt fram utan sofistikerade förhållanden som behövs, vilket gör den idealisk att utföras i alla laboratorium med minimal utrustning och tillgång till reaktanter, även i en minskad budget. Sammanfattningsvis beskriver detta nya förfarande ett rakt fram och reproducerbart sätt att upptäcka och kvantifiera 2-AG som kommer att bidra till att besvara några av de frågor som tas upp efter beskrivningen av dessa endocbinannaoids roll i kolesterol handel med C.elegans.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantifiering av överflödet och laddning nivåer av överföring RNAs i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetrisk metod för att mäta järnhalten i växter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Tallrik-baserade storskalig odling av Caenorhabditis elegans: provberedning för studie av metabola förändringar i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifiering av coenzym A i celler och vävnader

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vi

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolering av aktiv caenorhabditis elegans kärnextrakt och rekonstitution för in vitro-transkription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...