Name: synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-09-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Bu çalışma Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693) tarafından desteklenmiştir. J.F.d.L., G.P., ve B.H.C. CONICET'ten arkadaşlar. D.D.M. ve G.R.L. CONICET Araştırma Kariyeri üyesidir. Biz Gonzalo Lamberto (INMET) LC-MS / MS analizi ve yararlı tartışma için müteşekkiriz. Video çekimi ve kurgusu Dirección de Comunicación de la Ciencia'dan Ramiro Ortega ve María Soledad Casasola tarafından yapılmıştır, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Rosario, Arjantin'deki Universidad Nacional de Rosario.

1. 1-AG-d5 hazırlığı
NOT: 1-AG-d5'i nicelik selahtları için deuterated iç standart olarak elde etmek için aşağıdaki protokolü uygulayın.
<ol><li>Diferansiyel koruma<ol>
<li>Sadece birincil alkolleri korumak için, ilk bir Pasteur pipet kullanarak 10 mL reaksiyon tüpü gliserol-d8 38 mg ekleyin ve manyetik karıştırıcı ekleyin.</li>
		<li>5 mL Hamilton şırıngası kullanarak 5 mL susuz diklorotan (DCM) ekleyin ve tüpe kuru N2 il...

<ol>
	<li>McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endocannabinoid+system.">Evolutionary origins of the endocannabinoid system.</a> Gene. 370, 64-74 (2006).</li><li>Le Foll, B., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB1+receptor+antagonists+as+promising+new+medications+for+drug+dependence.">Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).</li><li>Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+the+treatment+of+gastrointestinal+inflammation+and+symptoms.">Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms.</a> Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+in+regenerative+medicine:+a+simple+model+for+a+complex+discipline.">Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline.</a> Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).</li><li>Galles, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+in+Caenorhabditis+elegans+are+essential+for+the+mobilization+of+cholesterol+from+internal+reserves.">Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).</li><li>Kurihara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Arachidonoylglycerol+and+Anandamide+Oppositely+Modulate+Norepinephrine+Release+from+the+Rat+Heart+Sympathetic+Nerves.">2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+Serotonergic+Food+Signal+Stimulating+Sensory-Mediated+Aversive+Behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).</li><li>Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+signaling+regulates+regenerative+axon+navigation+in+Caenorhabditis+elegans+via+the+GPCRs+NPR-19+and+NPR-32.">Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32.</a> Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).</li><li>Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Activate+Monoaminergic+Signaling+to+Modulate+Key+C.+elegans+Behaviors.">Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).</li><li>Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-edema+and+analgesic+properties+of+&#916;9-tetrahydrocannabinol+(THC).">Anti-edema and analgesic properties of &#916;9-tetrahydrocannabinol (THC).</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).</li><li>Mills, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoamines+and+neuropeptides+interact+to+inhibit+aversive+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).</li><li>Lehtonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+endocannabinoids+in+nematodes+and+human+brain+tissue+by+liquid+chromatography+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).</li><li>Aarnio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+Elegans+Mutants+Predict+Regulation+of+Fatty+Acids+and+Endocannabinoids+by+the+CYP-35A+Gene+Family.">Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family.</a> Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).</li><li>Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+EI-GC/MS+method+for+the+accurate+quantification+of+anti-aging+compound+oleoylethanolamine+in+C.+elegans.">A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans.</a> Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).</li><li>Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Stimulate+the+TRP+Channel-Dependent+Release+of+Both+Serotonin+and+Dopamine+to+Modulate+Behavior+in+C.+elegans.">Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).</li><li>Batugedara, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth-Derived+Endocannabinoids+That+Have+Effects+on+Host+Immunity+Are+Generated+during+Infection.">Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+2-arachidonoylglycerol,+1-arachidonoylglycerol+and+arachidonic+acid+in+mouse+brain+tissue+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+UPLC-MS/MS+quantification+of+the+endocannabinoids+2-arachidonoyl+glycerol+(2AG),+1-arachidonoyl+glycerol+(1AG),+and+anandamide+in+human+plasma:+Minimization+of+matrix-effects,+2AG/1AG+isomerization+and+degradation+by+toluene+solvent+extraction.">Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction.</a> Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).</li><li>Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+simultaneous+determination+of+N-arachidonoylethanolamine,+N-oleoylethanolamine,+N-palmitoylethanolamine+and+2-arachidonoylglycerol+in+human+cells.">A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).</li><li>Keereetaweep, J., Chapman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+Analysis+of+Endocannabinoid+Signaling:+Targeted+Metabolite+Identification+and+Quantification.">Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification.</a> Neural Plasticity. , (2016).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Zoerner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endocannabinoids+in+biological+systems+by+chromatography+and+mass+spectrometry:+a+comprehensive+review+from+an+analytical+and+biological+perspective.">Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).</li></ol>

Endocannabinoidler C. elegans7dauer oluşumunun düzenlenmesinde rol yapmış lipidlerin bir sınıfıdır. Daha spesifik olarak, çoklu doymamış yağ asitlerinin (PUPO) sentezi kolesterol ticareti ve solucanların üreme gelişimi için önemlidir. Burada 2-AG, endokannabinoid içeren bir araşidonik asit, bozulmuş kolesterolmetabolizmasıvar solucanlarda normal döngüsüne dauer larva geri sorumlu olduğu ortaya 7 .
Kolesterol tica...

Endofanbinoidler çeşitli organizmalarda birden fazla biyolojik süreci düzenler ve lipid aracıları korunur1. İlk keşfedilen ve en iyi karakterize endanabinoidler anandamid (arachidonoylethanolamide, AEA) ve 2-arachidonoyl gliserol (2-AG). Endokannabinoidler beyin ödül sistemleri nin yanı sıra uyuşturucu bağımlılığı, bellek, ruh hali ve metabolik süreçler de dahil olmak üzere birçok kritik rol oynamaktadır2. AEA ve 2-AG sadece gerektiğinde sentezlenir ve kısa kullanım ömrüne sahiptirler ve taşıma protein geri alımı ve hidroliz3ile bozulurlar.
Caenorhabditis elegans gibi hayvan modellerinin kullanımı(C. elegans)apoptoz, hücre sinyalizasyonu, hücre döngüsü, hücre polaritesi, gen regülasyonu, metabolizma, yaşlanma, ve cinsiyet belirleme4,5. Ayrıca, C. elegans çoklu doymamış yağ asitlerinin (PUFA) fizyolojik rollerini incelemek için mükemmel bir modeldir. AEA C. elegans tespit edilmiştir ve diyet kısıtlaması6altında azalır. Bu eksiklik endofanabinoid ile takviyesi ile bastırılabilir bir diyet kısıtlama mekanizması ile nematod ömrünü uzatır. Son zamanlarda, 2-AG ve AEA C. elegans7kolesterol ticaretinin düzenlenmesinde temel rol oynadığı keşfedilmiştir. Daha da önemlisi, bu eksojen 2-AG ile takviyesi Dauer arrest, Niemann-Pick tip C1 C. elegans mutantlar bozulmuş kolesterol ticareti neden olduğu kurtarma olabilir tespit edilmiştir.
2-AG'nin kolesterol ticareti ve nematoddaki diğer biyolojik süreçlerle (yani monoaminik sinyalizasyon, nosisepsiyon ve lokomotion) olan ilişkisini daha iyi anlamak için, bu endojen metabolitin incelenmesi ve nasıl olduğu bazı çevre ve beslenme koşulları altında etkilenen8,9,10,11,12,13. Bu nedenle, farklı alanlardaki bilim adamları için kullanımı kolay olan C. elegans'ta endojen 2-AG'yi tespit etmek ve ölçmek için bir yöntem tasarlamak ve optimize etmek zorunludur, özellikle de nematodun bu konudaki davranışlarını inceleyenler için. endkannabinoid.
2008 yılında, Lethonen ve iş arkadaşları LC-MS analitik yöntemler14kullanarak C elegans 2-AG ve AEA tespit başardı. 2011 yılında, diğer endokannabinoidler15bu tekniği genişletmek başardı. Daha yeni çalışmalar, c. elegansendokannabinoidlerin saptandırıp ölçülmesinde başarılı olan diğer analitik yöntemler göstermiştir , kütle spektrometresi ve GC-MS16dahil,17,18, ve ayrıca benzer analitik yöntemlerdiğer modellere genişletilebilirbildirilmiştir 19.
Biyolojik numunelerde 2-AG'nin ölçülmesi için kullanılan daha önce bildirilen analitik yöntemler genellikle ticari olarak edinilen ve satın alma için kullanılabilirlik gerektiren deuterated standartların kullanımını içerir20,21. Endofabinoidlerin LC-MS/MS sayısallaştırılması için birçok analitik standart farklı sağlayıcılardan ticari olarak mevcuttur. Yine de, onlar pahalı, duyarlı, ve zaman içinde okside olmak, birden fazla çift bağ varlığı nedeniyle. Bu standartların en yaygın sürümleri okta-deuterated araşidonik asit dayanmaktadır ve izotop seyreltme LC-MS/MS14tarafından nicelleştirmek için uygundur,22. Ayrıca, bu standartların çoğu gliserol pozisyon 2 ikame edilir, onlar asil göç eğilimli beri çoğu koşullar altında kararsız hale19,23.
Bu deuterated standartların maliyetleri ve istikrarı ile ilgili zorlukları aşmak için, gliserol-d dayalı analitik bir standart hazırlamak için uygun ve basit bir yöntem sunulmaktadır5. Penta-deuterated standart hazırlamak için sırası standart 1-AG-dsonuçlarıüç aşamalı bir prosedür gerektirir 5 , hangi istikrarlı ve asil göç geçmez (2-monoasilglisitler sentezamaçlayan ana konu).
Burada temel amaç, analitik olarak nötralizasyon standardının sentezi, nematod örneklerinin hazırlanması ve çıkarılması ve LC-MS/MS ile analiz dahil olmak üzere, C. eleganlarda2-AG'yi incelemek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem göstermektir (Şekil 1 ). Bu sentetik prosedür sofistike organik sentez bilgisi veya özel ekipman olmadan ulaşılabilir, endocannabinoid etkisi altında C. elegans davranış okuyor farklı alanlardan bilim adamları için uygun hale. Yöntem aynı zamanda diğer çalışma modelleri için genişletilebilir, farklı hedefler için yararlı hale. Burada bildirildiği gibi hazırlanan standart, 2 AG'nin etkili bir şekilde tekrarlanabilir bir şekilde saptanması ve ölçülmesi için hızlı ve güvenilir bir kromatografik yöntem geliştirmek için başarıyla uygulanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107700</td>
			<td>reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antioxidant BHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W21805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol-d8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass detector Triple Quadrupole</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TSQ Quantum Access Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Avance II 300 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase HPLC column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25003-052130</td>
			<td>C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyldimethylsilyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190500</td>
			<td>reagent grade, 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrabutylammonium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216143</td>
			<td>1.0M in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultimate 3000 RSLC Dionex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm strain N2 Bristol</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-arachidonoylglycerol in caenorhabditis elegans

Bu çalışma sıvı kromatografi-elektrosprey iyonizasyon-tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) ile 2-arachidonoyl gliserol (2-AG) nitel ve nicel analiz etmek için analitik bir standart hazırlamak için bir yöntem sunar. Endofanbinoidler çeşitli organizmalarda birden fazla biyolojik süreci düzenleyen lipid mediatörleri korunur. C. elegansyılında, 2-AG farklı rollere sahip olduğu bulunmuştur, dauer oluşumu ve kolesterol metabolizması modülasyonu da dahil olmak üzere. Bu rapor, 2-AG nicelleştirme için gerekli olan kısırlaştırılmış standartların maliyetleri ve istikrarı ile ilgili zorlukların üstesinden gelmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Standardın sentezi için prosedür basittir ve organik sentez uzmanlığı veya özel ekipmangerek kalmadan, herhangi bir laboratuvarda yapılabilir. Buna ek olarak, Folch yöntemic. elegans kültüründen deuterated standart ayıklamak için bir değişiklik açıklanmıştır. Son olarak, kararlı izotopik etiketli analog 1-AG-d5 kullanarak 2-AG'yi saptamak için nicel ve analitik bir yöntem tanımlanmıştır ve bu da hızlı kromatografik bir çalışmada güvenilir sonuçlar sağlar. Bu prosedür, c. eleganlarda 2-AG'nin birden fazla rollerinin incelenmesinde ve farklı organizmalardaki metabolitlerin diğer çalışmaları için de geçerli olmak için yararlıdır.

İzotopik olarak etiketlenmiş bir analog, 3 aşamalı sentetik bir yöntem kullanılarak ticari olarak mevcut d8-gliserol ve araşidonik asitten başarıyla sentezlenmiştir(Şekil 2, Şekil 3). Bu adımlar basittir ve gelişmiş ekipmanlar, özel olarak kontrol edilen koşullar veya pahalı reaktifler gerektirmez. Bu nedenle, bu yöntem sağlam dır ve farklı yağ asitleri içeren monoasilgliseritleri sentezlemek i?...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Bu çalışma, C. elegansendokannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) tespit etmek ve ölçmek için sağlam ve basit bir yöntem açıklar. 2-AG'nin izotopik seyreltme ve sıvı kromatografi-elektrosprey iyonizasyon-tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) ile ölçülmesi için hazırlanmış ve kullanılan analitik bir deuterated standarttır.

Caenorhabditis elegans 2-Arachidonoylglycerol Quantification için Bir Deuterated Standart Sentezi

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Endofanbinoidler çeşitli organizmalarda birden fazla biyolojik süreci düzenleyen lipid mediatörleri korunur. Keşfedilen ilk endokannabinoidler anandamid ve 2-arachidonoylglycerol, 2-AG vardır. Nematod C.elegans biyolojik süreçlerin büyük bir çeşitlilik çalışma için güçlü bir hayvan modelidir.Son zamanlarda, 2-AG C.elegans kolesterol ticaretinin düzenlenmesinde temel bir rol oynadığını keşfetti. Bu nedenle C.elegans'ta endojen 2-AG'yi incelemek için bir yöntem tasarlamak ve optimize etmek zorunlu hale geldi. Biyolojik numunelerde 2-AG'yi ölçmek için daha önce bildirilen analitik yöntemler genellikle ticari olarak edinilen kısırlaştırılmış standartların kullanımını içerir ve bunları satın almak için gereklidir.Yine de, onlar pahalı, ve birden fazla çift bağ varlığı nedeniyle, zaman içinde okside almak için duyarlıdır. Standartların en yaygın versiyonu, izotop seyreltme, sıvı kromatografi sivivetografya sıve posterior kütle spektroskopisi ile ölçülme için uygun olan oktavatlı araşidonik asite dayanmaktadır. 2-AG'yi ölçmek için kısırlaştırılan standartların maliyet ve istikrarı ile ilgili zorlukların üstesinden gelmek için, döteryum-5-gliserol'a dayalı analitik bir standart hazırlamak için uygun ve basit bir yöntem kullandık.Pendeuterated standart hazırlamak için sıra üç adımyordam gerektirir. İhtiyaç duyulana kadar korunan formda tutulabilmesi. Bu çalışmanın temel amacı, analitik olarak nötralizasyon standardının sentezinden nematod örneklerinin hazırlanması ve çıkarılmasına ve son olarak sıvı kromatografisi ve kütle spektroskopisi ile analize kadar C.elegans'ta 2-AG'yi incelemek için tam bir yöntem göstermektir.Sayısal tahliller için deuterated 1-AG bir deuterated iç standart olarak elde etmek için üç adım protokolü izleyin. Sadece birincil alkolleri korumak için, ilk bir Pasteur pipet kullanarak 10 mililitrelik reaksiyon tüpü nekadar deuterated gliserol 38 miligram ekleyin ve manyetik karıştırıcı ekleyin. Sonra, beş mililitre Hamilton şırınga kullanarak susuz DCM beş mililitre ekleyin ve durağan bir atmosfer vermek için kuru azot ile tüp doldurun.Distile etil asetat ile dolu sığ bir Dewar şişesi kullanarak bir banyo hazırlayın. Banyo içinde hermetik kapalı reaksiyon tüpünü doldurun ve çözücü dondurulana kadar etil asetat yavaş yavaş sıvı nitrojen ekleyerek soğutun. Dikkat, sıvı şiddetle oda sıcaklığında kaynar ve gözler ve cilt ile temas halinde ciddi yanıklara neden olabilir.Sonra, hamilton şırıngası kullanarak 54 miligram susuz çarpıştırıcı ekleyin. Dikkat, çarpıştırıcı uçucu ve çok güçlü ve hoş olmayan bir kokusu vardır. 70 miligram terbutile-dimethyl-cetylchloridde ve manyetik karıştırıcı üzerinde eksi 78 derece üç saat boyunca her şeyi karıştırın.Reaksiyonu bastırmak için iki mililitre salamura ekleyin. Organik özleri her seferinde tutan ayrılmış bir huni kullanarak iki mililitre distile diklorometan ile çözeltiyi üç kez ayıklayın. Sonra, üç organik özler birleştirmek ve sodyum sülfit üzerinde kuru.Sabit faz olarak silika jel ve%100 heksandan başlayarak %100 heksan etil asetat gradyan ve %100 etil asetat ile bitirerek kolon kromatografisi ile ham karışımı arındırın. Bu esterleşme adımı için, daha önce 10 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne Pasteur pippette kullanarak belirtilen ürünün 10 miligramını ekleyin ve manyetik karıştırıcı ekleyin. Beş mililitre Hamilton şırınga kullanarak susuz DCM iki mililitre ekleyin ve durağan bir atmosfer vermek için kuru azot ile tüp doldurun.Bir buz banyosu kullanarak sıfır dereceye çözeltiyi soğutun. Ad 36 miligram araşidonik asit çok hacimli ayarlanabilir mikropipet kullanarak ve karıştırın. Sonra, 40-metil-aminopyridine 15 miligram ekleyin ve karıştırın.Çok hacimli ayarlanabilir mikropipet kullanarak 15 miligram diacylpropylcarbodiimid ekleyin ve karıştırın. Reaksiyonu söndürmek için iki mililitre su ekleyin ve ardından çözeltiyi iki mililitre distile DCM ile üç kez ayırıcı bir huni kullanarak ayıklayın. Üç organik özleri birleştirin ve sodyum sülfit üzerinde kuru, sabit bir faz olarak silika jel kullanarak sütun kromatografi ile ham karışımı arındırın sonra% 100 heksan başlayan heksan etil asetat gradyan artan ve bitirme 50% 50 heksan etil asetat.Son olarak, deprotection adım için, bir Pasteur pipet kullanarak 10 mililitre reaksiyon tüpü için daha önce sentezlenmiş ürünün 15 miligram ekleyin ve manyetik karıştırıcı ekleyin. Beş mililitre Hamilton şırınga kullanarak susuz tetrahidrofuran iki mililitre ekleyin ve durağan bir atmosfer vermek için kuru azot ile tüp doldurun. Sonra bir buz banyosu kullanarak sıfır dereceye çözeltisoğun.Bir Hamilton şırınga kullanarak THF tetrabutylammonium florür bir azı çözeltisi damla-bilge 150 mikrolitre ekleyin. Bir saat sonra, reaksiyon söndürmek için su iki mililitre ekleyin. İki mililitre distile DCM üç kez bir ayırma hunisi kullanarak çözelti ayıklayın.Üç organik özleri birleştirin ve sodyum sülfit üzerinde kuru. Beyazlatma işlemi için solucanları 6 santimetrelik ngm plakalarına çevirin. Solucanın 2-3 günden üç güne büyümesine izin verin, böylece tabakta çok sayıda yumurta ve gravid yetişkin vardır.Bir kez yumurta ve yetişkin bol var, plaka üzerine M9 beş mililitre dökün. Cam pipet kullanarak solucanları 15 mililitrelik bir şahin tüpüne aktarın. Tüpü 2,000 G'de iki dakika santrifüj edin ve solucanları peletleyin.Solucan peletini bozmadan M9'un çoğunu emme. Üç mililitre beyazlatma çözeltisi ekleyin ve yaklaşık beş dakika veya bozulmamış yetişkin solucan sayısında bir azalma görene kadar ters çevirerek çözeltiyi hafifçe karıştırın. Cesetlerin çoğu eridikten sonra, 2,000 G'de bir dakika lığına santrifüj.Solucan peletini bozmadan beyazlatma solüsyonunun çoğunu emme. Tüpe 15 mililitre M9 ekleyin ve iyice karıştırın. Bir dakika lığına 2,000 G'de tekrar santrifüj.Solucan peletini bozmadan M9'un çoğunu emme. Solucan örneği hazırlama için, beyazlatma işlemi ile elde edilen N2 embriyolar 20 derece M9 tampon gecede vardı sağlar. Daha sonra, 2, 000 G.Solucanları M9 tamponu ile bir kez daha yıkayın ve canlı L1 sayısını ölçerek tüpü iki dakika santrifüj ederek senkronize L1'leri hasat edin. Daha önce kurutulmuş OP 50 Escherichia coli bir mililitre ile NGM plakaları içine tohum yaklaşık 10.000 solucanlar.Solucanlar L4 aşamasına ulaşana kadar plakaları en az 48 saat 20 derecede kuluçkaya yatırın. 50 mililitrelik bir şahin tüpünde soğuk M9 tamponu kullanarak solucanları hasat edin. Bir kez daha yıkayın ve 1.5 mililitrelik bir tüp içine aktarın.Bir dakika için 2, 000 G santrifüj ile solucanlar pelet. Supernatant çoğu ortadan kaldırın. Sonra, sıvı nitrojen tüp batırın ve eksi 80 derece karıştırın.N2'ye ait yaklaşık 100 mikrolitre donmuş solucan peletini eritin ve sonra 1,3 mililitre metanol ekleyin. Bundan sonra, dört dakika boyunca örnek sonicate. Sonication sonra, dahili deuterated standart 1, 000 ppb, kloroform 2.6 mililitre ve potasyum klorür 0.5 molar 1.3 mililitre, fosforik asit 0.08 azı bir nihai oranı ekleyin.Bir dakika için örnekleri girdap ve sonra buz üzerinde 15 dakika boyunca bir ultrasonik su banyosunda sonicate. Bir dakika boyunca tekrar iki kez örnekleri girdap ve faz ayrımı nı sağlamak için 2,000 G'de 10 dakika santrifüj edin. Temiz bir cam tüp içine alt faz toplamak, azot altında kuru, ve asetonitril 100 mikrolitre yeniden askıya.Endojen 2-AG'nin başarılı bir nicelemesi için, üç adımlı bir yöntem kullanarak doymuş analog sentezlemek gerekiyordu. Daha sonra solucan örneklerine eklendi, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayıklandı ve analiz edildi, kütle spektrometresi ile birleştiğinde. Bir iç standart olarak kullanılan, sentetik deuterated 1-AG endojen metaboliti ölçmek için bir araç oldu.Yöntem 2-AG geçişleri kullanılarak optimize edildi ve gliserol moleküllerinin kaybolduğu 1-AG deuterated için. 2-C.elegans örneklerinden ag endojen iyotopik seyreltme ile kimyasal olarak sentezlenen deuterize 1-AG ile kütle spektrometresi ile birleşen yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak başarılı bir şekilde saptandı ve ölçüldü. Örnek bir, deuterated standart 1-AG ile hazırlanmış, örnek iki standart olmadan ise.Örnek bir ve üç deki deutrated standardın orijinal konsantrasyonu 1,000 ppb'nin her biri olduğu için, pik alan oranından örnek bir ve örnek üç için 360 ppb numuneiçin 2-AG'nin endojen konsantrasyonunun hesaplanması mümkündür ve ortalama 350 ppb verir. Oranlar, izole edilmiş iki örnek için sırasıyla 2-AG'nin tepe alanları ile 1-AG'nin deuterated alanları arasında bir kalite olarak hesaplandı. Her ikisi de deuterated standart çıkarma için önceki eklendi.Kolesterol ticaretinin geliştirilmesinde 2-AG'nin son zamanlarda keşfedilen önemi ve lipidlerin bu süreci nasıl etkilediğine dair bilgi eksikliği göz önüne alındığında, bu endofanabinoid için güvenilir bir tespit yöntemi gerekliydi. Burada rapor edilen basit ve sağlam sentetik bir yöntemin, kısırlaştırılmış analog 2-AG elde etmek için başarılı bir şekilde geliştirilmesi bu protokolün önemli bir adımdı. Monoacylglycerols ölçmek için bildirilen yöntemlerin çoğu genellikle düzenli depolama koşulları altında pahalı ve kararsız ticari olarak mevcut analitik standartların kullanımını içerir, onları düşük bütçeli laboratuvarlar için ulaşılmaz hale.Ancak, bu yöntem daha erişilebilir başlangıç malzemeleri kullanarak standart bir sentez önererek bu çözer. Sentetik yöntem, daha düşük bir bütçeyle bile en az ekipman ve reaktanlara erişim ile herhangi bir laboratuvarda yapılması için ideal hale, gerekli sofistike koşullar olmadan düz ileri. Özetle, bu yeni prosedür, c.elegans kolesterol ticaretinde bu endofabinoidlerin rolünün açıklamasından sonra ortaya çıkan bazı soruların cevaplanmasına yardımcı olacak 2-AG'yi tespit etmenin ve ölçmenin doğrudan ileri ve tekrarlanabilir bir yolunu açıklamaktadır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Demir içeriği tesislerinde ölçme kolorimetrik yöntemi

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Hücre ve Dokularda Koenzim A'nın Sayısallaştırılması

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...