Name: interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

وكان هذا العمل مدعوما بمنح من مجلس البحوث التابع لمعهد الدراسات العليا في العلوم الاساسيه ، زانجان ، إيران.

وأجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا للجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها في العلوم الطبية بجامعه طهران. بذلت جهود قصوى للتقليل من المعاناة والآثار الضارة للفئران عن طريق شحذ شفرات المقصلة وتطبيق الحركات الحازمة والسريعة لنصل.
1. تجانس الدماغ والعزلة الميتوكوندريا
<...

<ol>
	<li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amyloidosis.">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li><li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Link&#246;ping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).</li><li>Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation,+ion+channel+formation,+and+membrane+damage.">Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage.</a> Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).</li><li>Demuro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dysregulation+and+membrane+disruption+as+a+ubiquitous+neurotoxic+mechanism+of+soluble+amyloid+oligomers.">Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).</li><li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+lipid+bilayers+is+a+common+conformation-dependent+activity+of+soluble+amyloid+oligomers+in+protein+misfolding+diseases.">Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).</li><li>Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+oxidative+phosphorylation+genes+in+patients+with+Alzheimer's+disease:+implications+for+early+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+damage.">Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage.</a> Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).</li><li>Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+alterations+in+Parkinson's+disease:+new+clues.">Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues.</a> Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+peptide+channels.">Amyloid peptide channels.</a> The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).</li><li>Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease:+amyloid+pores+from+pathogenic+mutations.">Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations.</a> Nature. 418, 291 (2002).</li><li>Sims, N. R., Anderson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+rat+brain+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation.</a> Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).</li><li>Ghobeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+A&#946;+(25-35)+Fibrillation+Products+with+Mitochondria:+Effect+of+Small-Molecule+Natural+Products.">Interaction of A&#946; (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products.</a> Peptide Science. 102, 473-486 (2014).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).</li><li>Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+some+enzymatic+properties+of+the+inner+and+outer+membrane+of+rat+liver+mitochondria.">Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).</li><li>Hoyer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+a-Synuclein+Aggregate+Morphology+on+Solution+Conditions.">Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).</li><li>Weinreb, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP,+a+protein+implicated+in+Alzheimer's+disease+and+learning,+is+natively+unfolded.">NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded.</a> Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).</li><li>Porter, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+chromatography+of+insulin+and+other+proteins.">Partition chromatography of insulin and other proteins.</a> The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).</li><li>Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+competition+between+renaturation+and+aggregation+during+the+refolding+of+denatured+reduced+egg+white+lysozyme.">A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme.</a> Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).</li><li>Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+isolated+rat+hepatocytes+and+liver+mitochondria:+studies+using+myxothiazol.">Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).</li><li>Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+integrity+and+amyloid+cytotoxicity:+a+model+study+involving+mitochondria+and+lysozyme+fibrillation+products.">Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products.</a> Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).</li><li>Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+silibinin+on+insulin+amyloid+fibrillation,+cytotoxicity+and+mitochondrial+membrane+damage.">Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).</li><li>Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aggregation+and+fibrillation+of+alpha-synuclein.">The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein.</a> Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).</li><li>Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+the+membrane+interaction+of+FYVE+domains.">Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains.</a> Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).</li><li>Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+&#945;-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core.">Lipid bilayer disruption by oligomeric &#945;-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li><li>Kourie, J. I., Henry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+formation+and+membrane-linked+pathologies+of+misfolded+hydrophobic+proteins:+the+role+of+dangerous+unchaperoned+molecules.">Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 29, 741-753 (2002).</li><li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases.">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li><li>Bolognesi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANS+binding+reveals+common+features+of+cytotoxic+amyloid+species.">ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species.</a> ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).</li><li>Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles:+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content.">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li><li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers:+possible+mechanism+of+action.">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li><li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein.">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li><li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains.">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li><li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+&#945;-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson's+disease-role+of+cardiolipin.">Interaction of &#945;-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1.">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li></ol>

وتدعم ثروة من النتائج التجريبية فرضيه ان السمية الخلوية للييفي المجاميع يرتبط بشكل كبير مع قدرتها علي التفاعل مع ويتخلل الاغشيه البيولوجية4,5. ومع ذلك ، تستند معظم البيانات علي الطبقات الدهنية الاصطناعية التي لا تعكس بالضرورة الخصائص الجوهرية لاغشيه بيولو...

الاضطرابات المرتبطة اميلويد ، المعروفة باسم اميلويدسيس ، تشكل مجموعه كبيره من الامراض المحددة من قبل ظهور رواسب البروتين غير القابلة للذوبان في الانسجه المختلفة والاجهزه1،2. ومن بينها ، الاضطرابات العصبية هي الاشكال الأكثر شيوعا التي تظهر المجاميع البروتين في الجهاز العصبي المركزي أو المحيطي2. علي الرغم من انه قد تم اقتراح عدد من أليات للمشاركة في سميه المجاميع اميلويد3، وهناك مجموعه متزايدة من الادله تشير إلى اضطراب غشاء الخلية والتغلغل باعتبارها اليه الرئيسية للامراض اميلويد4، 5- بالاضافه إلى غشاء البلازما ، قد يتاثر أيضا الأرغن الداخلي (اي الميتوكوندريا).
ومن المثير للاهتمام ، تشير الادله الناشئة إلى ان ضعف الميتوكوندريا يلعب دورا حاسما في التسبب في اضطرابات الأعصاب ، بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون6،7. وفقا لهذه المسالة, وقد أشارت تقارير عديده ملزمه وتراكم اميلويد β-الببتيد, α-synuclein, huntingtin, و ALS المرتبطة متحولة SOD1 البروتينات إلى الميتوكوندريا8,9,10, 11. ويعتقد ان اليه الغشاء يتخلله المجاميع اميلويد تحدث اما من خلال تشكيل قنوات منفصلة (المسام) و/أو من خلال اليه غير محدده مثل المنظفات5,12, 13-الآن ومن الجدير بالذكر ان معظم هذه الاستنتاجات استندت إلى تقارير تتعلق بنظم نموذجيه فوسفورية ، وان الدراسات التي تستهدف مباشره الاحداث التي تحدث في الاغشيه البيولوجية نادره. ومن الواضح ان هذه الطبقات الدهنية الاصطناعية لا تعكس بالضرورة الخصائص الجوهرية لاغشيه بيولوجية ، بما في ذلك تلك الموجودة في الميتوكوندريا ، والتي هي هياكل غير متجانسة وتتالف من مجموعه واسعه من الدهون الفوسفاتية والبروتينات.
في هذه الدراسة ، يتم استخدام الميتوكوندريا معزولة من أدمغه الفئران كنموذج البيولوجية في المختبر لدراسة الآثار المدمرة من ألياف الليفية اميلويد الناشئة عن α-synuclein (كبروتين اميلويدروني) ، الانسولين البقري (كما يظهر نموذج الببتيد التماثل الهيكلية الكبيرة مع الانسولين البشري المشاركة في الحقن الموضعي الداء النشواني) ، والدجاجة البيض الأبيض الليزوزيم (هيول ؛ كبروتين نموذج مشترك لدراسة تراكم اميلويد). ثم يتم التحقيق في التفاعلات والاضرار المحتملة من اغشيه الميتوكوندريا المستحثة بواسطة ألياف الليفية اميلويد من خلال مراقبه الإفراج عن النازعة مالات الميتوكوندريا (MDH) (الموجود في مصفوفة الميتوكوندريا) والأكسجين الميتوكوندريا التفاعلية تعزيز الأنواع (ROS).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1012171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Clear-bottomed 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA essentially fatty acid-free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (cut off 2 KDa)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Potter Elvehjem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Cary Eclipse VARIAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Made in Iran</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme (HEWL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CS0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sodium tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>analytik jena</td>
			<td>SPEKOL 2000 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1076871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1082191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils

وتشير مجموعه متزايدة من الادله إلى ان الغشاء يتخلله ، بما في ذلك الاغشيه الداخلية مثل الميتوكوندريا ، هو سمه مشتركه واليه الاوليه للسمية الناجمة عن الكلي اميلويد في الامراض التنكسية العصبية. ومع ذلك ، فان معظم التقارير التي تصف أليات اضطراب الغشاء تستند إلى أنظمه نموذجيه فوسفورية ، والدراسات التي تستهدف مباشره الاحداث التي تحدث علي مستوي الاغشيه البيولوجية نادره. وصف هنا هو نموذج لدراسة أليات سميه اميلويد علي مستوي الغشاء. للعزل الميتوكوندريا ، يتم استخدام الكثافة المتوسطة التدرج للحصول علي الاستعدادات مع الحد الأدنى من التلوث الميلين. بعد التاكد من سلامه غشاء الميتوكوندريا ، يتم التحقيق في تفاعل ألياف الليفية اميلويد الناشئة عن α-synuclein ، الانسولين البقري ، والدجاجة البيض الأبيض الليزوزيم (هيول) مع الميتوكوندريا الدماغ الفئران ، كنموذج في المختبر البيولوجية. وتبين النتائج ان علاج الميتوكوندريا الدماغ مع الجمعيات اللييفيه يمكن ان يسبب درجات مختلفه من تغلغل الغشاء وتعزيز المحتوي ROS. وهذا يشير إلى التفاعلات التي تعتمد علي البنية بين ألياف الليفية اميلويد وغشاء الميتوكوندريا. ومن المقترح ان الخصائص الفيزيائية الحيوية من ألياف الليفية اميلويد وملزمه محدده لاغشيه الميتوكوندريا قد توفر تفسيرات لبعض هذه الملاحظات.

يصف البروتوكول نموذجا لدراسة التفاعلات من الليفي اميلويد مع الميتوكوندريا الدماغ الفئران كنموذج البيولوجية في المختبر. لاعداد الميتوكوندريا ، تم استخدام 15 ٪ (v/v) كثافة التدرج المتوسطة لأزاله الميلين كتلوث الرئيسية للانسجه الدماغ14. كما هو مبين في الشكل 1a ، أنتجت</st...

Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

المقدمة هنا هو بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين الشكل الأصلي ، بريفيبريلار ، والخلايا الليفية اميلويد ناضجه من الببتيدات مختلفه والبروتينات مع الميتوكوندريا معزولة من الانسجه المختلفة ومناطق مختلفه من الدماغ.

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

في هذا الفيديو، نحن وصف دراسة نموذجية لآلية سمية اميلويد على مستوى الغشاء باستخدام الميتوكوندريا الدماغ الفئران كنموذج بيولوجي في المختبر. على الرغم من تراكم التقرير وصف آلية الأغشية الانزعاجات بواسطة الأميلويد تجميع في نظم نموذج فوسفوليبيد درس مباشرة استهداف الأحداث التي تبدأ في تطوير الغشاء البيولوجي. في هذا الفيديو، ونحن وصف fibrils اميلويد من ألفا سينوكلين تحليل غشاء الميتوكوندريا الدماغ الفئران كنموذج بيولوجي في المختبر.ونحن نعتقد أن الميتوكوندريا باعتبارها organelle مع أغشية جيدة اميز قد توفر مفيدة للغاية البيولوجية نموذج نظام للدراسات الجزيئية المتعلقة آلية السمية الخلوية اميلويد على مستوى الغشاء المتعلقة بأمراض الأعصاب. قطع رأس الجرذ مع مقصلة صغيرة وإزالة الدماغ من الجدول في غضون دقيقة واحدة من قطع رأس الفئران للحد من التدهور المحتمل لخصائص الميتوكوندريا. من المهم العمل بسرعة والحفاظ على كل شيء على الجليد طوال العملية.غسل الأنسجة مرتين مع 30 ملليلتر من العازلة العزل. نقل إلى منقار يحتوي على عازلة العزل الباردة و mince ناعما الدماغ مع مقص. نقل تعليق الأنسجة إلى 20 ملليلتر التجانس الباردة dounce.التجانس قطع الأنسجة باستخدام تسعة السكتات الدماغية صعودا وهبوطا مع آفة آلية. اترك الخليط على الجليد لمدة 30 ثانية تقريبًا بعد كل مجموعة من ثلاث ضربات تجانس لضمان بقاء التجانس باردًا. نقل المتجانس إلى أنبوب أجهزة طرد مركزي مُبردة مسبقاً وطاردة مركزية على 1,300 غ في أربع درجات لمدة ثلاث دقائق.بعناية طارد المابير ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي المبردة مسبقا. جهاز طرد مركزي في 21،000 G في أربعة درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تجاهل السوبر و resuspend بيليه في متوسطة التدرج الكثافة عن طريق تحريك بلطف الخليط مع ماصة.جهاز طرد مركزي في زاوية ثابتة الدوار في 30، 700 G في أربعة درجة مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام ماصة باستور، وإزالة نهاية حادة من المواد المتراكمة في الجزء العلوي، والتي تحتوي في الغالب على الميلين. إضافة ثمانية ملليلتر العازلة العزل إلى كسر الميتوكوندريا في حين التحريك بلطف الخليط مع ماصة.جهاز طرد مركزي في 16،700 G في أربعة درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة بعناية supernatant، وترك بيليه فضفاضة أسفل دون عائق. إضافة ملليلتر واحد 10 ملليغرام لكل ملليلتر الدهنية خالية من الأحماض BSA إلى أنبوب الطرد المركزي في حين اثارة بلطف الخليط مع غيض من ماصة.قم بتكفير وحدة التخزين إلى خمسة ملليلتر عن طريق إضافة مخزن العزل المؤقت. جهاز طرد مركزي في 6,900 G في أربعة درجة مئوية لمدة 10 دقائق. هذا ينبغي أن تنتج بيليه شركة.Decant الماسخ وssuspend بلطف بيليه الميتوكوندريا في عازلة العزلة. تمييع المتجانسة الميتوكوندريا إلى مليغرام واحد لكل ملليلتر مع عازلة العزل الباردة ومكان في اثنين من أنابيب 1.5 ملليلتر, عادة 195 ميكرولتر من الميتوكوندريا لكل أنبوب. إضافة خمسة ميكروليتر 20٪ حجم لكل حجم تريتون X-100 إلى أنبوب واحد كتحكم إيجابي للحد الأقصى من نشاط الانزيم وخمسة ميكرولتر ديونسيد المياه إلى أنبوب آخر للسيطرة، تليها خلط مع مُحرك.احتضان الأنابيب لمدة 10 دقائق في حمام الماء الدافئ تعيين إلى 30 Centigrade. بيليه الميتوكوندريا بواسطة الطرد المركزي من الأنابيب في دوار زاوية ثابتة في 16، 000 G أربعة سنتيغراد لمدة 15 دقيقة. جمع بعناية عظمى الناتجة لتقييم نشاط الميتوكوندريا مالات dehydrogenase باستخدام المعايرة الطيفية القياسية المذكورة في الجزء التالي.حساب سلامة الغشاء الميتوكوندريا على النحو التالي. لتحديد نشاط malate dehydrogenase, ماص 890 و 880 ميكرولتر 50 ملليمولار تريس-HCL العازلة إلى فارغة وعينة اختبار cuvettes على التوالي تليها 100 ميكرولتر 50 ملليمولار oxaloacetate و 10 ميكرولتر من 10 ملليمولر بيتا-NADH. وضع cuvettes في مقياس الطيفية والمرجع ضد فارغة.إضافة 10 ميكرولتر الميتوكوندر المتجانسة التجانس واحد ملليغرام لكل ملليلتر لعينة من cuvette. على الفور مزيج من قبل عكس. انخفاض قياسي في الامتصاص بسبب أكسدة NADH عند 340 نانومتر لمدة دقيقة واحدة.لالفا-سينوكلين الرجفان اميلويد، إضافة 294 ميكرولتر من محلول البروتين، 200 ميكرومولار إلى كل 1.5 ملليلتر أنبوب. ثم إضافة ستة ميكروليتر ThT الحل واحد ملليمتر. اخلط الحلول وحضن الأنابيب في ثيرمميكسير في 37 درجة مئوية تحت التحريك المستمر عند 800 دورة في الدقيقة.بالنسبة للرجفان الـفيني للأنسولين، أضف 637 ميكرولتر من محلول البروتين، و250 ميكرومولار إلى 1.5 ملليلتر. ثم إضافة 13 ميكروليتر ThT الحل واحد ملليمولار تليها التحريك. إضافة aliquots 200 ميكرولتر من حلول البروتين إلى كل بئر من لوحة 96-well السفلي واضحة.ختم لوحة مع شريط ختم واضحة وضوح الشمس. تحميل لوحة في Cytation 5 قارئ لوحة الفلوريس. قياس الفلورس ThT على فترات 30 دقيقة لمدة 12 ساعة.استخدام الإثارة في 440 نانومتر والانبعاثات في 485 نانومتر. حدد الآبار. هز اللوحة لمدة خمس ثوان قبل كل قياس.تعيين درجة الحرارة في 57 درجة مئوية دون التحريض. إعداد اثنين من سلسلة من 1.5 ملليلتر أنابيب تحتوي على تجانس الميتوكوندريا, سلسلة واحدة لمقايسة الافراج عن MDH وغيرها لقياس الميتوكوندريا روس. إضافة aliquots من fibrils الطازجة أو اميلويد من ألفا-synuclein, الأنسولين البقري أو البيض البيض الدهاني lysozyme إلى المتوفيات المتينزية تليها الأنابيب بلطف.ينبيّن أنابيب تحتوي على تعليق الميتوكوندريا لمدة 30 دقيقة في حمام الماء الدافئ الذي تم تعيينه إلى 30 درجة مئوية. بالنسبة لمقايسة إطلاق الانبعاثات من malate dehydrogenase، فإن أجهزة الطرد المركزي المحتضنة تتجانس الميتوكوندريا عند 16000 G لمدة 15 دقيقة. جمع بعناية عظمى الناتجة عن فحص نشاط MH الميتوكوندريا كما هو موضح في قسم البروتوكول الجزء الرابع.حساب إصدار MDH كما يلي. لقياس الميتوكوندريا ROS، ماص 191 ميكرولتر من المتجانسة الميتوكوندريا المحتضنة إلى كل بئر من لوحة 96 جيدا. إضافة أربعة ميكرولتر من 50 micromolar DCFDA.ثم إضافة خمسة ميكرولتر من 200 ميليمولار كسيناث. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في حمام الماء الدافئ تعيين إلى 30 درجة مئوية في حين اثارة بلطف. تحميل لوحة في Cytation 5 قارئ لوحة الفلورانس وقياس كثافة الفلورانس وفقا لقسم البروتوكول.تم تقييم سلامة غشاء الميتوكوندريا من خلال قياس نشاط MDH في الميتوكوندريا المعزولة قبل وبعد اضطراب الغشاء وإطلاق الإنزيم بواسطة Triton X-100. كما ترون، وجدنا عادة أن الاستعدادات الميتوكوندريا حوالي 93٪ سليمة. تم إجراء مقايسة ThT fluorescence لمراقبة نمو الفيبريات الأميلويد.أظهر منحنى الرجفان الأميلويد من ثلاثة بروتينات نمطًا سيغريمي نموذجيًا ، ليصل إلى هضبة في حوالي 96 و 12 و 96 ساعة لـ ألفا سينوكلين ، وأنسولين الأبقار ، وبيضة البيض lysozyme على التوالي ، مما يشير إلى تشكيل fibrils الأميلويد الذي تم تأكيده أكثر من خلال قياس AFM. تم التحقيق في إمكانية تحقيض الغشاء الميتوكوندريا وتلفه بواسطة الفيبرلس الأميلويد من خلال إطلاق MH الميتوكوندريا وقياس الميتوكوندريا ROS. كما ترون في الرسم البياني الأيسر، لوحظ إصدار كبير من MDH عند إضافة ألفا سينوكلين فيبريه إلى الميتوكوندريا.في حين تم الكشف عن إطلاق سراح طفيف من قبل فيبريلس الأنسولين، تم العثور على البيض البيض lysozyme fibrils غير فعالة. الرسم البياني الأيمن يظهر تأثير fibrils اميلويد على محتوى ROS الميتوكوندريا. في حين لم يلاحظ أي تحسن كبير في الميتوكوندريا ROS عند إضافة البيض البيض lysozyme أو الانسولين اميلويد فيبريلس, العلاج مع ألفا-سينوكلين فيبريلس أدى إلى زيادة كبيرة في محتوى روس من الميتوكوندريا الدماغ.يصف هذا الفيديو دراسة نموذجية لآلية السمية الخلوية الكلية للظيّل على مستوى الغشاء، مما يوضح كيف أن الـ fibrils الأميلويد الناشئة عن البروتينات المختلفة قد تسبب درجات مختلفة من تلف الغشاء و permeabilization. في حين أن بعض المواضيع من fibrils اميلويد والغشاء المحدد ملزمة يبدو أن توفر القدرة على التفاعل مع وتسبب زعزعة الاستقرار والتمزقات اللاحقة من الأغشية. بعد هذا الفيديو، سوف تكون قادرة على التحقيق في التفاعل من شكل الأصلي، قبل الفيبريلار، و fibrils الأميلويد ناضجة من الببتيدات المختلفة ومع الميتوكوندريا معزولة عن الأنسجة المختلفة أو مناطق مختلفة من الدماغ.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

بروتوكول تنقية مصممة HPLC أن ينتج عالية النقاء اميلويد بيتا اميلويد بيتا 42 و 40 الببتيدات، قادرة على قليل وحدات تشكيل

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

استخدام الأبعاد شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد اثنين لتأكيد عدم تجانس حجم الألياف اميلويد أو اميلويد مثل

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

جيل مونومر Exon1 هونتينجتين الأصلية، وليس تمييز وييفات استخدام استراتيجية انصهار السومو

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

الكشف عن برينيليشن جتباسي صغيرة وأنشئ ملزمة باستخدام تجزئة غشاء ومقايسة الممتز GTPase مرتبطة

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...