Name: interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Forskningsrådet under instituttet for avancerede studier i grundlæggende videnskaber (IASBS), Zanjan, Iran.

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med den institutionelle dyrepleje og brug Komité (IACUC) af medicinske videnskaber på Teheran Universitet. Der blev gjort en maksimal indsats for at minimere lidelser og skadelige virkninger for rotterne ved at skærpe guillotine bladene og anvende knivene resolut og hurtigt.
1. hjernens homogenisering og mitokondriel isolation
Bemærk: alle reagenser til mitokondriel isolation blev udarbejdet i henhold til Sims og An...

<ol>
	<li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amyloidosis.">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li><li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Link&#246;ping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).</li><li>Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation,+ion+channel+formation,+and+membrane+damage.">Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage.</a> Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).</li><li>Demuro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dysregulation+and+membrane+disruption+as+a+ubiquitous+neurotoxic+mechanism+of+soluble+amyloid+oligomers.">Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).</li><li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+lipid+bilayers+is+a+common+conformation-dependent+activity+of+soluble+amyloid+oligomers+in+protein+misfolding+diseases.">Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).</li><li>Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+oxidative+phosphorylation+genes+in+patients+with+Alzheimer's+disease:+implications+for+early+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+damage.">Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage.</a> Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).</li><li>Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+alterations+in+Parkinson's+disease:+new+clues.">Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues.</a> Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+peptide+channels.">Amyloid peptide channels.</a> The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).</li><li>Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease:+amyloid+pores+from+pathogenic+mutations.">Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations.</a> Nature. 418, 291 (2002).</li><li>Sims, N. R., Anderson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+rat+brain+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation.</a> Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).</li><li>Ghobeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+A&#946;+(25-35)+Fibrillation+Products+with+Mitochondria:+Effect+of+Small-Molecule+Natural+Products.">Interaction of A&#946; (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products.</a> Peptide Science. 102, 473-486 (2014).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).</li><li>Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+some+enzymatic+properties+of+the+inner+and+outer+membrane+of+rat+liver+mitochondria.">Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).</li><li>Hoyer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+a-Synuclein+Aggregate+Morphology+on+Solution+Conditions.">Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).</li><li>Weinreb, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP,+a+protein+implicated+in+Alzheimer's+disease+and+learning,+is+natively+unfolded.">NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded.</a> Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).</li><li>Porter, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+chromatography+of+insulin+and+other+proteins.">Partition chromatography of insulin and other proteins.</a> The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).</li><li>Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+competition+between+renaturation+and+aggregation+during+the+refolding+of+denatured+reduced+egg+white+lysozyme.">A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme.</a> Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).</li><li>Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+isolated+rat+hepatocytes+and+liver+mitochondria:+studies+using+myxothiazol.">Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).</li><li>Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+integrity+and+amyloid+cytotoxicity:+a+model+study+involving+mitochondria+and+lysozyme+fibrillation+products.">Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products.</a> Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).</li><li>Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+silibinin+on+insulin+amyloid+fibrillation,+cytotoxicity+and+mitochondrial+membrane+damage.">Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).</li><li>Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aggregation+and+fibrillation+of+alpha-synuclein.">The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein.</a> Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).</li><li>Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+the+membrane+interaction+of+FYVE+domains.">Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains.</a> Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).</li><li>Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+&#945;-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core.">Lipid bilayer disruption by oligomeric &#945;-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li><li>Kourie, J. I., Henry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+formation+and+membrane-linked+pathologies+of+misfolded+hydrophobic+proteins:+the+role+of+dangerous+unchaperoned+molecules.">Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 29, 741-753 (2002).</li><li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases.">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li><li>Bolognesi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANS+binding+reveals+common+features+of+cytotoxic+amyloid+species.">ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species.</a> ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).</li><li>Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles:+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content.">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li><li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers:+possible+mechanism+of+action.">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li><li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein.">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li><li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains.">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li><li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+&#945;-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson's+disease-role+of+cardiolipin.">Interaction of &#945;-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1.">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li></ol>

Et væld af eksperimentelle resultater understøtter hypotesen om, at cytotoksicitet af fibrillar aggregater er væsentligt forbundet med deres evne til at interagere med og permeabilize biologiske membraner4,5. Men de fleste af dataene er baseret på kunstige lipid-dobbeltlag, der ikke nødvendigvis afspejler de iboende egenskaber af biologiske membraner, som er heterogene strukturer med en bred vifte af phospholipider og proteiner. Her, ved hjælp af hjernen mi...

Amyloid-relaterede lidelser, kendt som amyloidoser, udgør en stor gruppe af sygdomme defineret ved fremkomsten af uopløselige protein aflejringer i forskellige væv og organer1,2. Blandt dem er neurodegenerative lidelser de hyppigst anvendte former, hvor protein aggregater optræder i det centrale eller perifere nervesystem2. Selv om en række mekanismer er blevet foreslået at være involveret i toksiciteten af amyloid aggregater3, en voksende mængde af beviser peger på celle membran afbrydelse og permeabilisering som den primære mekanisme af amyloid patologi4, 5. Ud over plasma membran, interne organeller (dvs., mitochondrier) kan også blive påvirket.
Interessant, nye beviser tyder på, at mitokondriel dysfunktion spiller en afgørende rolle i patogenesen af neurodegenerative lidelser, herunder Alzheimers og Parkinsons sygdomme6,7. I overensstemmelse med dette spørgsmål har talrige rapporter indikeret binding og akkumulering af amyloid β-peptid, α-synuclein, huntingtin og Als-sammenkædede mutant SOD1 proteiner til mitokondrier8,9,10, 11. mekanismen for membran permeabilisering ved amyloid aggregater menes at forekomme enten gennem dannelse af diskrete kanaler (porer) og/eller gennem en ikke-specifik vaskemiddel lignende mekanisme5,12, 13. Det er bemærkelsesværdigt, at de fleste af disse konklusioner har været baseret på rapporter, der involverer phospholipid modelsystemer, og undersøgelser direkte rettet mod de hændelser, der forekommer i biologiske membraner er sjældne. Det er klart, disse kunstige lipid dobbeltlag ikke nødvendigvis afspejler de iboende egenskaber af biologiske membraner, herunder de af mitokondrier, som er heterogene strukturer og består af en bred vifte af phospholipider og proteiner.
I nærværende undersøgelse anvendes mitokondrier isoleret fra rotte hjerner som en in vitro biologisk model til at undersøge de ødelæggende virkninger af amyloid fibriller, der opstår som følge af α-synuclein (som et monomer protein), bovin insulin (som et model peptid, som viser signifikant strukturel homologi med humant insulin involveret i injektion-lokaliseret amyloidose), og høne æggehvide lysozym (HEWL; som en fælles model protein til undersøgelse af amyloid sammenlægning). Interaktioner og mulige skader af mitokondrie membraner induceret af amyloid fibriller er derefter undersøgt ved at observere frigivelsen af mitokondrie Malate dehydrogenase (MDH) (placeret i mitokondrie matrix) og mitokondrier reaktiv ilt art (ROS) ekstraudstyr.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1012171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Clear-bottomed 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA essentially fatty acid-free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (cut off 2 KDa)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Potter Elvehjem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Cary Eclipse VARIAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Made in Iran</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme (HEWL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CS0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sodium tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>analytik jena</td>
			<td>SPEKOL 2000 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1076871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1082191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils

En voksende mængde af beviser indikerer, at membran permeabilisering, herunder interne membraner såsom mitokondrier, er et fælles træk og primære mekanisme af amyloid aggregat-induceret toksicitet i neurodegenerative sygdomme. Men de fleste rapporter, der beskriver mekanismerne for membran afbrydelse er baseret på phospholipid modelsystemer, og undersøgelser direkte rettet mod hændelser, der forekommer på niveauet af biologiske membraner er sjældne. Beskrevet her er en model til undersøgelse af mekanismerne for amyloid toksicitet på membran niveau. For mitokondriel isolering anvendes tæthed gradient medium til at opnå præparater med minimal myelin forurening. Efter bekræftelse af mitokondriel membran integritet er samspillet mellem amyloid fibriller, der hidrører fra α-synuclein, bovin insulin, og høne æggehvide lysozym (hewl) med rotte hjernen mitokondrier, som en in vitro biologisk model, undersøgt. Resultaterne viser, at behandling af hjernen mitokondrier med fibrillar forsamlinger kan forårsage forskellige grader af membran permeabilization og ROS indhold ekstraudstyr. Dette indikerer struktur afhængige interaktioner mellem amyloid fibriller og mitokondriel membran. Det foreslås, at biofysiske egenskaber af amyloid fibriller og deres specifikke binding til mitokondrielle membraner kan give forklaringer på nogle af disse observationer.

Protokollen beskriver en model til at studere interaktioner af amyloid og med rotte hjernen mitokondrier som en in vitro biologisk model. For mitokondriel præparat, 15% (v/v) tæthed gradient medium blev brugt til at fjerne myelin som større forurening af hjernevæv14. Som vist i figur 1aproducerede centrifugering ved 30.700 x g to særskilte materiale bånd, myelin (som den vigtigste bestanddel af band 1) og band 2, so...

Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Forudsat her er en protokol til at undersøge samspillet mellem Native form, prefibrillar, og modne amyloid fibriller af forskellige peptider og proteiner med mitokondrier isoleret fra forskellige væv og forskellige områder af hjernen.

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

I denne video beskriver vi en modelundersøgelse for mekanismen for amyloidtoksicitet på membranniveau ved hjælp af rottehjerneumokondrier som en in vitro biologisk model. På trods af akkumulerende rapport, der beskriver mekanismen for membranperturbationer ved amyloid aggregat i fosfolipid model systemer undersøgt direkte rettet mod de begivenheder, der begynder ved udvikling af biologiske membran. I denne video beskriver vi amyloid fibrils af alpha-synuclein analysere rotte hjernen mitokondrier membran som en in vitro biologisk model.Vi mener, at mitokondrier som organelle med vel karakteriserede membraner kan give en yderst nyttig biologisk model system til molekylære undersøgelser relateret til mekanismen for amyloid cytotoksicitet på membranniveau i forbindelse med neurodegenerative sygdomme. Halshugger rotten med et lille dyr guillotine og fjern hjernen fra skalaen inden for et minut efter halshugning af rotten for at begrænse den mulige forringelse af mitokondrielle egenskaber. Det er vigtigt at arbejde hurtigt og holde alt på is under hele proceduren.Vævet vaskes to gange med 30 milliliter isolationsbuffer. Overfør til et bægerglas, der indeholder kold isolation buffer og fint hakke hjernen med en saks. Vævssuspension overføres til en 20 milliliter kold douncehomogenisator.Homogeniser vævsstykkerne ved hjælp af ni op- og nedtrædene strøg med en motoriseret støder. Lad blandingen være på is i ca. 30 sekunder efter hvert sæt af tre homogeniseringsslag for at sikre, at homogenatet forbliver koldt. Homogenatet overføres til et forkølet centrifugerør og centrifugeres ved 1,300 G ved fire Celsius i tre minutter.Supernatanten dekanteres forsigtigt, og den overføres til et forkølet centrifugerør. Centrifuge ved 21,000 G ved fire Centigrade i 10 minutter. Kassér supernatanten og opspæl pellet i en massefylde gradient medium ved forsigtigt omrøring blandingen med pipetten.Centrifuge i en fast vinkelrotor ved 30, 700 G ved fire Celsius i fem minutter. Ved hjælp af en Pasteur pipette, fjerne den skarpe ende af materiale akkumuleret i toppen, som for det meste indeholder myelin. Der tilsættes otte milliliterisolationsbuffer til den mitokondrielle fraktion, mens blandingen forsigtigt røres med pipetten.Centrifuge ved 16, 700 G ved fire Centigrade i 10 minutter. Fjern forsigtigt supernatanten, så den nederste løse pellet forbliver uforstyrret. Tilsæt en milliliter 10 milligram per milliliter fedtsyre-fri BSA til centrifugerør, mens forsigtigt omrøring blandingen med spidsen af pipetten.Diskenheden op til fem milliliter ved at tilføje isolationsbuffer. Centrifuge ved 6, 900 G ved fire Celsius i 10 minutter. Dette bør producere en fast pellet.Dekantere supernatant og forsigtigt resuspendre mitokondrielle pellet i isolation buffer. Fortyndet mitokondriel homogenat til en milligram per milliliter med kold isolation buffer og sted i to 1,5 milliliter rør, typisk 195 mikroliter mitokondrier per rør. Der tilsættes fem mikroliter 20% volumen pr. volumen Triton X-100 til et rør som positiv kontrol for maksimal enzymaktivitet og fem mikroliterdeioniseret vand til et andet rør til kontrol, efterfulgt af blanding med en omrører.Inkuber rørene i 10 minutter i varmt vandbad indstillet til 30 Centigrade. Pellet mitokondrier ved centrifugering af rør i en fast vinkel rotor ved 16, 000 G fire Celsius i 15 minutter. Omhyggeligt indsamle resulterende supernatants til vurdering af aktiviteten af mitokondrielt malat dehydrogenase ved hjælp af en standard spektrofotometrisk analyse beskrevet på den næste del.Beregn integriteten af mitokondriel membran som følger. For bestemmelse af malathydrogenaseaktivitet pipette 890 og 880 mikroliter 50 millimolar Tris-HCL-buffer til henholdsvis blindprøve og prøvetestknærer efterfulgt af 100 mikroliter 50 millimolar oxaloacetat og 10 mikroliter 10 millimolar beta-NADH. Sæt cuvettes i et spektrofotometer og reference mod blank.Der tilsættes 10 mikroliter mitokondriel homogenat et milligram pr. milliliter for at prøve cuvette. Bland straks ved inversion. Rekord fald i absorbans på grund af NADH oxidation ved 340 nanometer i et minut.For alfa-synuclein amyloid fibrillation, tilsættes 294 mikroliter proteinopløsning, 200 mikromolar til hver 1,5 milliliter rør. Derefter tilsættes seks microliter ThT løsning en millimolar. Opløsningerne blandes, og rørene inkuberes i en termomixer ved 37 Celsius under konstant omrøring ved 800 omdr./min.For kvæg insulin amyloid fibrillation, tilsættes 637 mikroliter proteinopløsning, 250 mikromolar til 1,5 milliliter rør. Derefter tilsættes 13 mikroliter ThT opløsning en millimolar efterfulgt af omrøring. Tilføj aliquots 200 mikroliter af proteinopløsninger til hver brønd af en klar bund 96-brønd plade.Forsegle pladen med krystalklart tætningstape. Læg pladen i Cytation 5 fluorescenspladelæser. ThT fluorescens måles med 30 minutters mellemrum i 12 timer.Brug excitation ved 440 nanometer og emission ved 485 nanometer. Vælg brøndene. Pladen rystes i fem sekunder før hver måling.Indstil temperaturen til 57 Celsius uden omrøring. Der forberedes to serier af 1,5 milliliterrør indeholdende mitokondrielle homogenater, en serie til MDH-frigivelsesanalyse og andre til mitokondriel ROS-måling. Tilsæt aliquots af friske eller amyloid fibrils af alfa-synuclein, kvæg insulin eller høne æggehvide lysozyme til mitokondriel homogenat efterfulgt af forsigtigt pipettering.Inkuber rør, der indeholder mitokondrielle suspensioner i 30 minutter i varmt vandbad sat til 30 Centigrade. Ved malatdehydrogenasefrigivelsesanalyse skal centrifugerede mitokondrielle homogenater ved 16.000 G i 15 minutter. Omhyggeligt indsamle resulterende supernatants til at analysere aktiviteten af mitokondriel MDH som beskrevet på protokol afsnit del fire.Beregn udgivelsen af MDH på følgende måde. Til mitokondriel ROS-måling pipette 191 mikroliter af inkuberet mitokondriel homogenat til hver brønd af en 96-brøndplade. Tilføj fire mikroliter af 50 mikromolar DCFDA.Derefter tilsættes fem mikroliter på 200 millimolar succinate. Inkuber pladen i 30 minutter i varmt vandbad indstillet til 30 Centigrade under forsigtigt omrøring. Pladen indlæsser i en cytation 5 fluorescenspladelæser, og mål fluorescensintensiteten i henhold til protokolafsnittet.Mitokondriel membranintegritet blev vurderet ved måling af MDH-aktivitet i de isolerede mitokondrier før og efter membranforstyrrelser og enzymfrigivelse af Triton X-100. Som du kan se, fandt vi typisk, at mitokondrielle præparater er omkring 93% intakt. ThT fluorescens assay blev udført for at overvåge væksten af amyloid fibrils.Kurven for amyloid fibrillation af tre proteiner viste en typisk sigmoidal mønster, nå til et plateau på omkring 96, 12, og 96 timer for alpha-synuclein, kvæg insulin, og høne æggehvide lysozyme henholdsvis, hvilket tyder på dannelsen af amyloid fibrils, der var mere bekræftet af AFM måling. Mulig permeabilisering og beskadigelse af mitokondriel membran ved amyloid fibrils blev undersøgt ved frigivelse af mitokondrielle MDH og mitokondrielle ROS måling. Som du ser i venstre graf, betydelig frigivelse af MDH blev observeret ved tilsætning af alfa-synuclein amyloid fibrils til mitokondrier.Mens en lille frigivelse blev opdaget af insulin fibrils, høne æggehvide lysozyme fibrils blev anset for at være ineffektiv. Højre graf viser effekten af amyloid fibrils på mitokondrielt ROS indhold. Mens ingen signifikant forbedring i mitokondrielle ROS blev observeret ved tilsætning af høne æggehvide lysozym eller insulin amyloid fibrils, behandling med alpha-synuclein fibrils førte til en betydelig stigning i ROS indhold af hjernen mitokondrier.Denne video beskriver en model undersøgelse for mekanismen af fibula aggregat cytotoksicitet på membranniveau, der viser, hvordan amyloid fibrils som følge af forskellige proteiner kan forårsage forskellige grader af membranskader og permeabilisering. Mens nogle emner af amyloid fibrils og deres specifikke bindende membran synes at give med kapacitet til at interagere med og forårsage destabilisering og efterfølgende perturbations af membraner. Efter denne video, vil du være i stand til at undersøge samspillet mellem indfødte form, pre-fibrillar, og modne amyloid fibrils af forskellige peptider og med mitokondrier isoleret fra forskellige væv eller forskellige områder af hjernen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode til at visualisere og analysere membran interagerende proteiner af Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

En skræddersyet HPLC Oprensning protokol, der giver høj renhed Amyloid Beta 42 og Amyloid Beta 40 Peptider, der kan oligomer Formation

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid væv farves med selvlysende konjugeret Oligothiophenes af Hyperspectral Konfokal mikroskopi og fluorescens levetid Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering påvisning af LRRK2 aktivitet ved hjælp af SDS-PAGE med en fosfat-bindende Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning af vaskemiddel-følsomme interaktioner mellem Membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Brugen af to-dimensionelle semi-denaturering vaskemiddel Agarosen gelelektroforese at bekræfte størrelse heterogenitet af Amyloid eller Amyloid-lignende fibre

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Generation af indfødte, ukodede Huntingtin Exon1 monomere og fibriller ved hjælp af en SUMO Fusion strategi

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning af små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjælp af membran fraktionering og GTPase-forbundet Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...