Name: interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies van de Onderzoeksraad van het Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, Iran.

Alle dier experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de medische wetenschappen van de Universiteit van Teheran. Er werden maximale inspanningen geleverd om het lijden en de nadelige effecten voor de ratten te minimaliseren door de guillotine bladen te verscherpen en resolute en snelle bewegingen van het blad toe te passen.
1. hersen homogenisatie en mitochondriale isolatie
Opmerking: alle reagent...

<ol>
	<li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amyloidosis.">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li><li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Link&#246;ping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).</li><li>Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation,+ion+channel+formation,+and+membrane+damage.">Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage.</a> Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).</li><li>Demuro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dysregulation+and+membrane+disruption+as+a+ubiquitous+neurotoxic+mechanism+of+soluble+amyloid+oligomers.">Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).</li><li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+lipid+bilayers+is+a+common+conformation-dependent+activity+of+soluble+amyloid+oligomers+in+protein+misfolding+diseases.">Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).</li><li>Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+oxidative+phosphorylation+genes+in+patients+with+Alzheimer's+disease:+implications+for+early+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+damage.">Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage.</a> Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).</li><li>Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+alterations+in+Parkinson's+disease:+new+clues.">Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues.</a> Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+peptide+channels.">Amyloid peptide channels.</a> The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).</li><li>Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease:+amyloid+pores+from+pathogenic+mutations.">Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations.</a> Nature. 418, 291 (2002).</li><li>Sims, N. R., Anderson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+rat+brain+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation.</a> Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).</li><li>Ghobeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+A&#946;+(25-35)+Fibrillation+Products+with+Mitochondria:+Effect+of+Small-Molecule+Natural+Products.">Interaction of A&#946; (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products.</a> Peptide Science. 102, 473-486 (2014).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).</li><li>Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+some+enzymatic+properties+of+the+inner+and+outer+membrane+of+rat+liver+mitochondria.">Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).</li><li>Hoyer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+a-Synuclein+Aggregate+Morphology+on+Solution+Conditions.">Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).</li><li>Weinreb, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP,+a+protein+implicated+in+Alzheimer's+disease+and+learning,+is+natively+unfolded.">NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded.</a> Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).</li><li>Porter, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+chromatography+of+insulin+and+other+proteins.">Partition chromatography of insulin and other proteins.</a> The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).</li><li>Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+competition+between+renaturation+and+aggregation+during+the+refolding+of+denatured+reduced+egg+white+lysozyme.">A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme.</a> Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).</li><li>Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+isolated+rat+hepatocytes+and+liver+mitochondria:+studies+using+myxothiazol.">Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).</li><li>Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+integrity+and+amyloid+cytotoxicity:+a+model+study+involving+mitochondria+and+lysozyme+fibrillation+products.">Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products.</a> Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).</li><li>Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+silibinin+on+insulin+amyloid+fibrillation,+cytotoxicity+and+mitochondrial+membrane+damage.">Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).</li><li>Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aggregation+and+fibrillation+of+alpha-synuclein.">The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein.</a> Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).</li><li>Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+the+membrane+interaction+of+FYVE+domains.">Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains.</a> Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).</li><li>Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+&#945;-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core.">Lipid bilayer disruption by oligomeric &#945;-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li><li>Kourie, J. I., Henry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+formation+and+membrane-linked+pathologies+of+misfolded+hydrophobic+proteins:+the+role+of+dangerous+unchaperoned+molecules.">Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 29, 741-753 (2002).</li><li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases.">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li><li>Bolognesi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANS+binding+reveals+common+features+of+cytotoxic+amyloid+species.">ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species.</a> ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).</li><li>Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles:+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content.">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li><li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers:+possible+mechanism+of+action.">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li><li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein.">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li><li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains.">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li><li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+&#945;-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson's+disease-role+of+cardiolipin.">Interaction of &#945;-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1.">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li></ol>

Een schat aan experimentele resultaten ondersteunt de hypothese dat de cytotoxiciteit van fibrillar aggregaten significant wordt geassocieerd met hun vermogen om te interageren met en permeabilize biologische membranen4,5. Echter, de meeste van de gegevens zijn gebaseerd op kunstmatige lipide-bilayers die niet noodzakelijkerwijs de intrinsieke eigenschappen van biologische membranen weerspiegelen, die heterogene structuren met een breed scala van fosfolipiden en ...

Amyloïde-gerelateerde aandoeningen, bekend als amylodoses, vormen een grote groep van ziekten die worden gedefinieerd door het verschijnen van onoplosbare eiwit afzettingen in verschillende weefsels en organen1,2. Onder hen, neurodegeneratieve aandoeningen zijn de meest voorkomende vormen waarin eiwit aggregaten verschijnen in het centrale of perifere zenuwstelsel2. Hoewel een aantal mechanismen is voorgesteld om betrokken te zijn bij de toxiciteit van amyloïde aggregaten3, wijst een groeiend geheel van bewijsmateriaal op verstoring van de celmembraan en permeisatie als het primaire mechanisme van amyloïde pathologie4, 5. Naast plasma membraan, interne organellen (dat wil zeggen, mitochondriën) kan ook worden beïnvloed.
Interessant, opkomende bewijs suggereert dat mitochondriale dysfunctie speelt een cruciale rol in de pathogenese van neurodegeneratieve aandoeningen, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson6,7. In overeenstemming met deze kwestie, talrijke rapporten hebben aangegeven binding en accumulatie van amyloïde β-peptide, α-synuclein, huntingtine, en als-gebonden Mutant SOD1 eiwitten aan mitochondriën8,9,10, 11. het mechanisme van membraan permeisatie door amyloïde aggregaten wordt verondersteld te gebeuren door vorming van discrete kanalen (poriën) en/of door middel van een niet-specifiek detergens-achtige mechanisme5,12, 13. Het is opmerkelijk dat de meeste van deze conclusies zijn gebaseerd op rapporten met betrekking tot fosfolipide modelsystemen, en studies direct gericht op de gebeurtenissen die zich voordoen in biologische membranen zijn zeldzaam. Duidelijk, deze kunstmatige lipide bilayers niet noodzakelijkerwijs weerspiegelen de intrinsieke eigenschappen van biologische membranen, met inbegrip van die van de mitochondriën, die heterogene structuren en samengesteld uit een breed scala van fosfolipiden en eiwitten.
In de huidige studie, mitochondriën geïsoleerd van rat hersenen worden gebruikt als een in vitro biologisch model om te onderzoeken van de destructieve effecten van amyloïde fibrillen die voortvloeien uit α-synucleine (als een amyloidogenic eiwit), bovine insuline (als een model peptide tonen significante structurele homologie met humane insuline die betrokken zijn bij injectie-gelokaliseerde Amyloïdose), en kip eiwit lysozym (hewl; als een gemeenschappelijk model eiwit voor studie van amyloïde aggregatie). De interacties en mogelijke schade van mitochondriale membranen geïnduceerd door amyloïde fibrillen worden vervolgens onderzocht door het observeren van het vrijkomen van mitochondriale malaat dehydrogenase (MDH) (gelegen in de mitochondriale matrix) en mitochondriën reactieve zuurstof Soort (ROS) Enhancement.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1012171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Clear-bottomed 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA essentially fatty acid-free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (cut off 2 KDa)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Potter Elvehjem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Cary Eclipse VARIAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Made in Iran</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme (HEWL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CS0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sodium tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>analytik jena</td>
			<td>SPEKOL 2000 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1076871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1082191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils

Een groeiende hoeveelheid bewijs geeft aan dat membraan permeabilization, met inbegrip van interne membranen zoals mitochondriën, is een gemeenschappelijk kenmerk en primaire mechanisme van amyloïde aggregaat-geïnduceerde toxiciteit in neurodegeneratieve ziekten. Echter, de meeste rapporten beschrijven de mechanismen van membraan verstoring zijn gebaseerd op fosfolipide modelsystemen, en studies direct targeting gebeurtenissen die zich voordoen op het niveau van biologische membranen zijn zeldzaam. Hier beschreven is een model voor het bestuderen van de mechanismen van amyloïde toxiciteit op membraan niveau. Voor mitochondriale isolatie wordt dichtheidsgradiënt gebruikt om preparaten met minimale myeline besmetting te verkrijgen. Na de mitochondriale membraan integriteit bevestiging, de interactie van amyloïde fibrillen die voortvloeien uit α-synucleine, runderinsuline, en kip eiwit lysozym (hewl) met rat hersenen mitochondriën, als een in vitro biologisch model, wordt onderzocht. De resultaten tonen aan dat de behandeling van de mitochondriën van de hersenen met fibrillar assemblies verschillende graden van membraan permeabilization en ROS inhoud Enhancement kan veroorzaken. Dit duidt op structuur afhankelijke interacties tussen amyloïde fibrillen en mitochondriaal membraan. Er wordt gesuggereerd dat biofysische eigenschappen van amyloïde fibrillen en hun specifieke binding aan mitochondriale membranen uitleg kunnen geven voor sommige van deze waarnemingen.

Het protocol beschrijft een model voor het bestuderen van de interacties van amyloïde fibril met rat hersenen mitochondriën als een in vitro biologisch model. Voor de mitochondriale bereiding werd 15% (v/v) dichtheidsgradiënt medium gebruikt om myeline te verwijderen als grote besmetting van hersenweefsel14. Zoals weergegeven in Figuur 1a, produceerde centrifugeren op 30.700 x g twee verschillende materiaal klassen, myeline (...

Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Hier is een protocol voor het onderzoek van de interacties tussen inheemse vorm, prefibrillar, en volwassen amyloïde fibrillen van verschillende peptiden en eiwitten met mitochondriën geïsoleerd uit verschillende weefsels en verschillende gebieden van de hersenen.

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In deze video beschrijven we een modelstudie voor het mechanisme van amyloïde toxiciteit op membraanniveau met behulp van rattenhersenmitochondriën als een in vitro biologisch model. Ondanks het accumuleren van rapport beschrijft mechanisme van membraan verstoringen door amyloïde aggregaat in fosfolipid model systemen onderzocht rechtstreeks gericht op de gebeurtenissen die beginnen bij de ontwikkeling van biologisch membraan. In de huidige video beschrijven we amyloïde fibrils van alfa-synuclein die het ratzwantantiochonmembraan analyseren als een in vitro biologisch model.Wij geloven dat mitochondriën als organezel met goed gekarakteriseerde membranen een uiterst nuttig biologisch modelsysteem kunnen bieden voor moleculaire studies met betrekking tot het mechanisme van amyloïde cytotoxiciteit op membraanniveau met betrekking tot neurodegeneratieve ziekten. Onthoofd de rat met een klein dier guillotine en verwijder de hersenen van de schaal binnen een minuut na de onthoofding van de rat om mogelijke verslechtering van mitochondriale eigenschappen te beperken. Het is belangrijk om snel te werken en alles in de loop van de procedure op ijs te houden.Was het weefsel twee keer met 30 milliliter isolatiebuffer. Breng over op een beker met koude isolatiebuffer en maak fijn gehakt van de hersenen met een schaar. Breng de weefselsuspensie over naar een 20 milliliter koude dounce homogenisator.Homogenize het weefsel stukken met behulp van negen op en neer slagen met een gemotoriseerde stamper. Laat het mengsel ongeveer 30 seconden op ijs na elke set van drie homogenisatieslagen om ervoor te zorgen dat het homogenaat koud blijft. Breng het homogenaat over op een voorgekoelde centrifugebuis en centrifuge bij 1, 300 G bij vier Centigrade gedurende drie minuten.Decanteer de supernatant voorzichtig en breng het over naar een voorgekoelde centrifugebuis. Centrifuge op 21.000 G bij vier Centigrade gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verhoog de pellet in een dichtheidsgradiënt medium door het mengsel voorzichtig met de pipet te roeren.Centrifuge in een vaste hoek rotor op 30, 700 G bij vier Centigrade gedurende vijf minuten. Verwijder met behulp van een Pasteur pipet het scherpe uiteinde van het aan de bovenkant opgehoopte materiaal, dat meestal myeline bevat. Voeg acht milliliter isolatiebuffer toe aan de mitochondriale fractie terwijl u het mengsel voorzichtig roert met de pipet.Centrifuge op 16, 700 G bij vier Centigrade gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de supernatant, waardoor de onderste losse pellet ongestoord. Voeg een milliliter 10 milligram per milliliter vetzuurvrije BSA toe aan de centrifugebuis terwijl u het mengsel voorzichtig roert met de punt van de pipet.Maak het volume tot vijf milliliter door isolatiebuffer toe te voegen. Centrifuge op 6, 900 G op vier Centigrade gedurende 10 minuten. Dit moet een stevige pellet produceren.Decanteer de supernatant en resuspend de mitochondriale pellet in isolatiebuffer. Verdun mitochondriaal homogenaat tot één milligram per milliliter met koude isolatiebuffer en plaats in twee buizen van 1,5 milliliter, meestal 195 microliter mitochondriën per buis. Voeg vijf microliter 20% volume per volume Triton X-100 toe aan de ene buis als positieve controle voor maximale enzymactiviteit en vijf microliter gedeïsoniseerd water aan een andere buis voor controle, gevolgd door het mengen met een roerder.Broed de buizen gedurende 10 minuten in warm water bad ingesteld op 30 Centigrade. Pellet mitochondriën door centrifugatie van buizen in een vaste hoek rotor op 16, 000 G vier Centigrade gedurende 15 minuten. Verzamel zorgvuldig resulterende supernatants voor het beoordelen van de activiteit van mitochondriale malate dehydrogenase met behulp van een standaard spectrofotometrische test beschreven op het volgende deel.Bereken de integriteit van het mitochondriale membraan als volgt. Voor de bepaling van malate dehydrogenaseactiviteit, pipet 890 en 880 microliter 50 millimolar Tris-HCL buffer tot blanco en monster test cuvettes respectievelijk gevolgd door 100 microliter 50 millimolar oxaloacetaat en 10 microliter van 10 millimolar beta-NADH. Zet de cuvettes in een spectrofotometer en referentie tegen blanco.Voeg 10 microliter mitochondriaal homogenaat een milligram per milliliter toe om cuvette te proeven. Meng onmiddellijk door inversie. Record afname van de absorptie als gevolg van NADH oxidatie op 340 nanometer gedurende een minuut.Voor alpha-synuclein amyloïde fibrillatie, voeg 294 microliter eiwitoplossing, 200 micromolar aan elke 1,5 milliliter buis. Voeg vervolgens zes microliter ThT oplossing een millimolar. Meng de oplossingen en ontcubeer de buizen in een thermomixer bij 37 Graden celsius onder constant roeren bij 800 RPM.Voeg voor boviene insuline amyloïde fibrillatie 637 microliter eiwitoplossing, 250 micromolar aan 1,5 milliliter buis. Voeg vervolgens 13 microliter ThT oplossing een millimolar, gevolgd door roeren. Voeg aliquots 200 microliter eiwitoplossingen toe aan elke put van een duidelijke bodem 96-put plaat.Verzegel de plaat met kristalheldere afdichtingstape. Laad de plaat in Cytation 5 fluorescentieplaatlezer. Meet ThT fluorescentie met intervallen van 30 minuten gedurende 12 uur.Gebruik excitatie op 440 nanometer en emissie op 485 nanometer. Selecteer de putten. Schud de plaat vijf seconden voor elke meting.Stel de temperatuur in op 57 Graden Celsius zonder agitatie. Bereid twee series van 1,5 milliliter buizen met mitochondriale homogenaten, een serie voor MDH release assay en andere voor mitochondriale ROS-meting. Voeg aliquots verse of amyloïde fibrils alfa-synuclein, runder insuline of kippeneiwit lysozyme toe aan mitochondriaal homogenaat, gevolgd door zachtjes pipetten.Incubeerbuizen met mitochondriale suspensies gedurende 30 minuten in warm water bad ingesteld op 30 Centigrade. Voor malate dehydrogenase release test, centrifuge geïncubeerde mitochondriale homogenates op 16,000 G gedurende 15 minuten. Verzamel zorgvuldig resulterende supernatants voor het testen van de activiteit van mitochondriale MDH zoals beschreven op protocolsectie deel vier.Bereken de release van MDH als volgt. Voor mitochondriale ROS-meting, pipet 191 microliter van geïncubeerde mitochondriale homogenaat aan elke put van een 96-put plaat. Voeg vier microliter van 50 micromolar DCFDA toe.Voeg vervolgens vijf microliter van 200 millimolar succinate. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten in warm water bad ingesteld op 30 Centigrade terwijl zachtjes roeren. Laad de plaat in een Cytation 5 fluorescentieplaatlezer en meet de fluorescentieintensiteit volgens de protocolsectie.Mitochondriale membraanintegriteit werd beoordeeld door de MDH-activiteit in de geïsoleerde mitochondriën voor en na membraanverstoring en enzymafgifte door Triton X-100 te meten. Zoals u ziet, vonden we meestal dat mitochondriale preparaten zijn ongeveer 93% intact. ThT fluorescentietest werd uitgevoerd om de groei van amyloïde fibrils te monitoren.De curve voor amyloïde fibrillatie van drie eiwitten toonde een typisch sigmoïdaal patroon, dat op ongeveer 96, 12 en 96 uur naar een plateau reikte voor respectievelijk alfa-synuclein, runder insuline en kippeneiwit lysozyme, wat suggereert dat amyloïde fibrils meer werden bevestigd door de AFM-meting. Mogelijke permeabilisatie en schade van mitochondriaal membraan door amyloïde fibrils werd onderzocht door het vrijkomen van mitochondriale MDH en mitochondriale ROS-meting. Zoals u ziet in de linker grafiek, aanzienlijke release van MDH werd waargenomen bij toevoeging van de alpha-synuclein amyloïde fibrils aan mitochondriën.Terwijl een lichte afgifte werd gedetecteerd door insulinefibrils, bleken kippeneiwit lysozyme fibrils niet effectief te zijn. Rechter grafiek toont het effect van amyloïde fibrils op mitochondriale ROS-inhoud. Hoewel er geen significante verbetering in mitochondriale ROS werd waargenomen bij toevoeging van kippeneiwit lysozyme of insuline amyloïde fibrils, leidde de behandeling met alfa-synucleinfibrils tot een aanzienlijke toename van het ROS-gehalte van hersenmitochondriën.De huidige video beschrijft een modelstudie voor het mechanisme van kuitbeenaggregaatcytotoxiciteit op membraanniveau, waaruit blijkt hoe amyloïde fibrils die voortvloeien uit verschillende eiwitten verschillende graden van membraanschade en permeabilisatie kunnen veroorzaken. Terwijl sommige onderwerpen van amyloïde fibrils en hun specifieke bindende membraan lijken te voorzien van de capaciteit om te interageren met en destabilisatie en daaropvolgende verstoringen van membranen veroorzaken. Na deze video u de interactie van inheemse vorm, prefibrilleren en volwassen amyloïde fibrils van verschillende peptiden en met mitochondriën geïsoleerd uit verschillende weefsels of verschillende gebieden van de hersenen, onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Een op maat HPLC Zuivering Protocol dat zijn vruchten High-zuiverheid Amyloïd Beta 42 en Amyloid Beta 40 Peptiden, in staat oligomeervorming

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel Agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of Amyloid-achtige vezels

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Generatie van eigen, niet-gecodeerde Huntingtin Exon1 monomeer en fibrillen met behulp van een SUMO Fusion strategie

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Detectie van kleine GTPase Prenylation en GTP bindend gebruiken membraan fractionering en GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...