Name: interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Research Council des Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, Iran, unterstützt.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Medizinischen Wissenschaften der Universität Teheran durchgeführt. Es wurden maximale Anstrengungen unternommen, um Leiden und schädliche Auswirkungen auf die Ratten zu minimieren, indem die Guillotineklingen geschärft und entschlossene und schnelle Bewegungen der Klinge angewendet wurden.
1. Hirnhomogenisierung und mitochondriale Isolation
HINWEIS: Alle Re...

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	<li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amyloidosis.">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li><li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Link&#246;ping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).</li><li>Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation,+ion+channel+formation,+and+membrane+damage.">Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage.</a> Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).</li><li>Demuro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dysregulation+and+membrane+disruption+as+a+ubiquitous+neurotoxic+mechanism+of+soluble+amyloid+oligomers.">Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).</li><li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+lipid+bilayers+is+a+common+conformation-dependent+activity+of+soluble+amyloid+oligomers+in+protein+misfolding+diseases.">Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).</li><li>Manczak, M., Park, B. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+peptide+channels.">Amyloid peptide channels.</a> The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).</li><li>Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+rat+brain+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation.</a> Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).</li><li>Ghobeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+A&#946;+(25-35)+Fibrillation+Products+with+Mitochondria:+Effect+of+Small-Molecule+Natural+Products.">Interaction of A&#946; (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products.</a> Peptide Science. 102, 473-486 (2014).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aggregation+and+fibrillation+of+alpha-synuclein.">The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein.</a> Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).</li><li>Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+the+membrane+interaction+of+FYVE+domains.">Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains.</a> Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).</li><li>Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+&#945;-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core.">Lipid bilayer disruption by oligomeric &#945;-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li><li>Kourie, J. I., Henry, C. 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F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles:+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content.">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li><li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers:+possible+mechanism+of+action.">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li><li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein.">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li><li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains.">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li><li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+&#945;-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson's+disease-role+of+cardiolipin.">Interaction of &#945;-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1.">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li></ol>

Eine Fülle von experimentellen Ergebnissen stützt die Hypothese, dass die Zytotoxizität von fibrillaren Aggregaten signifikant mit ihrer Fähigkeit verbunden ist, mit biologischen Membranen zu interagieren und sie zu durchdringen4,5. Die meisten Daten basieren jedoch auf künstlichen Lipid-Doppelschichten, die nicht unbedingt die intrinsischen Eigenschaften biologischer Membranen widerspiegeln, die heterogene Strukturen mit einer Vielzahl von Phospholipiden un...

Amyloid-bedingte Störungen, bekannt als Amyloidosen, stellen eine große Gruppe von Krankheiten dar, die durch das Auftreten unlöslicher Proteinablagerungen in verschiedenen Geweben und Organen definiert sind1,2. Unter ihnen sind neurodegenerative Erkrankungen die häufigsten Formen, in denen Proteinaggregate im zentralen oder peripheren Nervensystem auftreten2. Obwohl eine Reihe von Mechanismen vorgeschlagen wurden, um in die Toxizität von Amyloid-Aggregaten beteiligt werden3, eine wachsende Menge von Beweisen deutet auf Zellmembran-Störung und Permeabilisierung als primärer Mechanismus der Amyloidpathologie4, 5. Neben der Plasmamembran können auch innere Organellen (d.h. Mitochondrien) betroffen sein.
Interessanterweise deuten neue Erkenntnisse darauf hin, dass mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen spielt, einschließlich Alzheimer und ParkinsonErkrankungen 6,7. In Übereinstimmung mit dieser Ausgabe haben zahlreiche Berichte auf eine Bindung und Akkumulation von Amyloid-Peptid, -synuclein, Huntingtin und ALS-verknüpften mutierten SOD1-Proteinen an Mitochondrien8,9,10 11. Der Mechanismus der Membranpermeabilisierung durch Amyloidaggregate wird entweder durch Bildung diskreter Kanäle (Poren) und/oder durch einen unspezifischen Waschmittel-ähnlichen Mechanismus5,12, 13. Bemerkenswert ist, dass die meisten dieser Schlussfolgerungen auf Berichten mit Phospholipid-Modellsystemen basieren, und Studien, die direkt auf die Ereignisse in biologischen Membranen abzielen, sind selten. Es ist klar, dass diese künstlichen Lipid-Doppelschichten nicht unbedingt die intrinsischen Eigenschaften biologischer Membranen widerspiegeln, einschließlich der mitochondrien, die heterogene Strukturen sind und aus einer Vielzahl von Phospholipiden und Proteinen bestehen.
In der vorliegenden Studie werden Von Rattenhirnen isolierte Mitochondrien als in vitro biologisches Modell verwendet, um die zerstörerischen Wirkungen von Amyloidfibrillen zu untersuchen, die aus dem signifikante strukturelle Homologie mit humanem Insulin, das an einer injektionslokalisierten Amyloidose beteiligt ist), und Hühnereiweißlysozym (HEWL; als gemeinsames Modellprotein zur Untersuchung der Amyloid-Aggregation). Die Wechselwirkungen und möglichen Schäden von mitochondrialen Membranen, die durch Amyloidfibrillen induziert werden, werden dann untersucht, indem die Freisetzung von mitochondrialer Malatdehydrogenase (MDH) (in der mitochondrialen Matrix) und mitochondrienem reaktiven Sauerstoff beobachtet wird. Arten (ROS) Verbesserung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1012171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Clear-bottomed 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA essentially fatty acid-free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (cut off 2 KDa)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Potter Elvehjem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Cary Eclipse VARIAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Made in Iran</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme (HEWL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CS0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sodium tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>analytik jena</td>
			<td>SPEKOL 2000 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1076871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1082191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils

Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass Membranpermeabilisierung, einschließlich der inneren Membranen wie Mitochondrien, ist ein gemeinsames Merkmal und primärer Mechanismus der Amyloid-Aggregat-induzierte Toxizität bei neurodegenerativen Erkrankungen. Die meisten Berichte, die die Mechanismen der Membranstörung beschreiben, basieren jedoch auf Phospholipid-Modellsystemen, und Studien, die direkt auf Ereignisse abzielen, die auf der Ebene biologischer Membranen auftreten, sind selten. Beschrieben hier ist ein Modell für die Untersuchung der Mechanismen der Amyloid-Toxizität auf Membranebene. Für die mitochondriale Isolierung wird ein Dichtegradientenmedium verwendet, um Präparate mit minimaler Myelinkontamination zu erhalten. Nach der Bestätigung der mitochondrialen Membranintegrität wird die Wechselwirkung von Amyloidfibrillen, die aus dem In-vitro-Biologischen Modell von Synuclein, Rinderinsulin und Hühnereiweißlysozym (HEWL) mit Rattenhirn-Mitochondrien als in vitro biologisches Modell entstehen, untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung von Hirnmitochondrien mit fibrillaren Baugruppen unterschiedliche Grade der Membranpermeabilisation und ROS-Gehaltsverbesserung verursachen kann. Dies deutet auf strukturabhängige Wechselwirkungen zwischen Amyloidfibrillen und mitochondrialer Membran hin. Es wird vermutet, dass biophysikalische Eigenschaften von Amyloidfibrillen und deren spezifische Bindung an mitochondriale Membranen Erklärungen für einige dieser Beobachtungen liefern können.

Das Protokoll beschreibt ein Modell zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Amyloidfibrillen mit Mitochondrien des Rattenhirns als in vitro biologisches Modell. Für die mitochondriale Präparation wurde 15% (v/v) Dichtegradientenmedium verwendet, um Myelin als größere Kontamination des Hirngewebes zu entfernen14. Wie in Abbildung 1Adargestellt, erzeugte die Zentrifugation bei 30.700 x g zwei unterschiedliche Materialbänder, Myelin <span style="font-size...

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Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Hier ist ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen nativer Form, Präfibrillar und reifen Amyloidfibrillen verschiedener Peptide und Proteine mit Mitochondrien aus verschiedenen Geweben und verschiedenen Bereichen des Gehirns isoliert.

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In diesem Video beschreiben wir eine Modellstudie für den Mechanismus der Amyloid-Toxizität auf Membranebene unter Verwendung von Rattenhirnmitochondrien als in vitro biologisches Modell. Trotz des akkumulierenden Berichts, der den Mechanismus der Membranstörungen durch Amyloid-Aggregat in Phospholipid-Modellsystemen beschreibt, die direkt auf die Ereignisse abzielen, die bei der Entwicklung der biologischen Membran beginnen. Im vorliegenden Video beschreiben wir Amyloidfibrillen von Alpha-Synuclein, die die Mitochondrienmembran des Rattengehirns als in vitro biologisches Modell analysieren.Wir glauben, dass Mitochondrien als Organelle mit gut charakterisierten Membranen ein äußerst nützliches biologisches Modellsystem für molekulare Studien im Zusammenhang mit dem Mechanismus der Amyloidzytotoxizität auf Membranebene im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen bieten können. Enthaupten Sie die Ratte mit einer kleinen tierischen Guillotine und entfernen Sie das Gehirn von der Skala innerhalb einer Minute nach der Enthauptung der Ratte, um eine mögliche Verschlechterung der mitochondrialen Eigenschaften zu begrenzen. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und alles während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten.Waschen Sie das Gewebe zweimal mit 30 Milliliter Isolationspuffer. Auf einen Becher mit Kalteisolationspuffer übertragen und das Gehirn mit einer Schere fein zerkleinern. Übertragen Sie die Gewebesuspension auf einen 20 Milliliter Kaltentun-Homogenisator.Homogenisieren Sie die Gewebestücke mit neun Auf- und Abschlägen mit einem motorisierten Stößel. Lassen Sie die Mischung ca. 30 Sekunden nach jedem Satz von drei Homogenisierungsschlägen auf Eis, um sicherzustellen, dass das Homogenat kalt bleibt. Das Homogenat bei vier Grad Celsius drei Minuten in ein vorgekühltes Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 1, 300 G geben.Den Überstand vorsichtig dekantieren und in ein vorgekühltes Zentrifugenrohr geben. Zentrifuge bei 21.000 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Dichtegradientenmedium wieder auf, indem Sie die Mischung vorsichtig mit der Pipette rühren.Zentrifuge in einem festen Winkelrotor bei 30, 700 G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie mit einer Pasteur-Pipette das scharfe Ende des oben angesammelten Materials, das meist Myelin enthält. Fügen Sie der mitochondrialen Fraktion einen Isolationspuffer von acht Millilitern hinzu, während Sie die Mischung vorsichtig mit der Pipette rühren.Zentrifuge bei 16, 700 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, so dass das untere lose Pellet ungestört bleibt. Fügen Sie einen Milliliter 10 Milligramm pro Milliliter fettsäurefreies BSA in das Zentrifugenrohr, während Sie die Mischung vorsichtig mit der Spitze der Pipette rühren.Machen Sie das Volumen auf fünf Milliliter, indem Sie Isolationspuffer hinzufügen. Zentrifuge bei 6, 900 G bei vier Centigrade für 10 Minuten. Dadurch sollte ein festes Pellet entstehen.Dekantieren Sie den Überstand und setzen Sie das mitochondriale Pellet im Isolationspuffer sanft wieder aus. Mitochondriales Homogenat auf ein Milligramm pro Milliliter mit Kälteisolationspuffer verdünnen und in zwei 1,5-Milliliter-Röhren, typischerweise 195 Mikroliter Mitochondrien pro Tube, geben. Fügen Sie fünf Mikroliter 20% Volumen pro Volumen Triton X-100 zu einem Rohr als positive Kontrolle für maximale Enzymaktivität und fünf Mikroliter entionisiertes Wasser zu einem anderen Rohr zur Kontrolle, gefolgt von dem Mischen mit einem Rührwerk.Inkubieren Sie die Rohre für 10 Minuten in warmes Wasserbad auf 30 Centigrade eingestellt. Pellet mitochondrien durch Zentrifugieren von Rohren in einem festen Winkelrotor bei 16 000 G vier Grad Celsius für 15 Minuten. Sammeln Sie sorgfältig resultierende Überstandmittel zur Beurteilung der Aktivität der mitochondrialen Malatdehydrogenase mit einem standardspektrophotometrischen Assay, der im nächsten Teil beschrieben wird.Berechnen Sie die Integrität der mitochondrialen Membran wie folgt. Zur Bestimmung der Malate-Dehydrogenase-Aktivität simpere Pipette 890 und 880 Mikroliter 50 Millimolar Tris-HCL Puffer zu leeren und Probe test Küvetten jeweils gefolgt von 100 Mikroliter 50 Millimolar Oxaloacetat und 10 Mikroliter 10 Millimolar Beta-NADH. Setzen Sie die Küvetten in ein Spektralphotometer und Referenz gegen Leerzeichen.10 Mikroliter mitochondriales Homogenat ein Milligramm pro Milliliter zur Probeküvetette geben. Sofort durch Inversion mischen. Rekordabnahme der Absorption durch NADH-Oxidation bei 340 Nanometer für eine Minute.Für Alpha-Synuclein-Amyloid-Fibrillation, fügen Sie 294 Mikroliter Proteinlösung, 200 Mikromolar zu jeder 1,5 Milliliter Tube. Dann fügen Sie sechs Mikroliter ThT-Lösung ein Millimolar. Mischen Sie die Lösungen und inkubieren Sie die Rohre in einem Thermomixer bei 37 Centigrade unter ständigem Rühren bei 800 U/min.Für Rinder insulin amyloid Fibrillation, fügen Sie 637 Mikroliter Proteinlösung, 250 Mikromolar zu 1,5 Milliliter Tube. Dann fügen Sie 13 Mikroliter ThT-Lösung ein Millimolar gefolgt von Rühren. Fügen Sie aliquots 200 Mikroliter Proteinlösungen zu jedem Brunnen einer klaren unteren 96-Well-Platte hinzu.Versiegeln Sie die Platte mit kristallklarem Dichtband. Laden Sie die Platte in Cytation 5 Fluoreszenzplattenleser. Messen Sie die ThT-Fluoreszenz im 30-Minuten-Takt für 12 Stunden.Verwenden Sie Anregung bei 440 Nanometer und Emission bei 485 Nanometer. Wählen Sie die Brunnen aus. Schütteln Sie die Platte fünf Sekunden vor jeder Messung.Stellen Sie die Temperatur ohne Rührung auf 57 Grad Celsius ein. Bereiten Sie zwei Reihen von 1,5 Milliliter-Röhren vor, die mitochondriale Homogenate enthalten, eine Serie für MDH-Freisetzungstest und eine andere für die mitochondriale ROS-Messung. Fügen Sie Aliquots von frischen oder amyloiden Fibrillen von Alpha-Synuclein, Rinderinsulin oder Hühnereiweißlysozym zu mitochondrialem Homogenat hinzu, gefolgt von sanfter Pipettierung.Inkubieren Sie Röhren mit mitochondrialen Suspensionen für 30 Minuten in warmem Wasserbad auf 30 Grad Celsius eingestellt. Für den Exat-Dehydrogenase-Freisetzungstest werden zentrifugierte mitochondriale Homogenate bei 16.000 G für 15 Minuten inkubiert. Sammeln Sie sorgfältig resultierende Überstand für die Aussage der Aktivität der mitochondrialen MDH, wie auf Protokollabschnitt 4 beschrieben.Berechnen Sie die Freigabe von MDH wie folgt. Für die mitochondriale ROS-Messung, Pipette 191 Mikroliter inkubiertes mitochondriales Homogenat zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte. Fügen Sie vier Mikroliter von 50 Mikromolar DCFDA.Dann fünf Mikroliter 200 Millimolar Succinat hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte für 30 Minuten in warmem Wasserbad auf 30 Centigrade eingestellt unter sanftem Rühren. Laden Sie die Platte in einen Cytation 5 Fluoreszenzplattenleser und messen Sie die Fluoreszenzintensität gemäß dem Protokollabschnitt.Die mitochondriale Membranintegrität wurde durch Messung der MDH-Aktivität in den isolierten Mitochondrien vor und nach Membranunterbrechung und Enzymfreisetzung durch Triton X-100 bewertet. Wie Sie sehen, haben wir in der Regel festgestellt, dass mitochondriale Präparate etwa 93% intakt sind. ThT Fluoreszenz-Assay wurde durchgeführt, um das Wachstum von Amyloidfibrillen zu überwachen.Die Kurve für Amyloid-Fibrillation von drei Proteinen zeigte ein typisches sigmoidales Muster, das bei Alpha-Synuclein, Rinderinsulin und Hühnereiweißlysozym bis zu einem Plateau reichte, was auf die Bildung von Amyloidfibrillen hindeutet, die durch AFM-Messung mehr bestätigt wurden. Mögliche Permeabilisierung und Schädigung der mitochondrialen Membran durch Amyloidfibrillen wurde durch die Freisetzung von mitochondrialer MDH und mitochondrialer ROS-Messung untersucht. Wie Sie in der linken Grafik sehen, wurde eine wesentliche Freisetzung von MDH bei Zugabe der Alpha-Synuclein-Amyloidfibrillen zu Mitochondrien beobachtet.Während eine leichte Freisetzung durch Insulinfibrillen festgestellt wurde, wurden Hühnerei-Weiß-Lysozyme-Fibrillen als unwirksam befunden. Rechte Grafik zeigt die Wirkung von Amyloidfibrillen auf den mitochondrialen ROS-Gehalt. Während keine signifikante Verbesserung der mitochondrialen ROS wurde bei Zugabe von Hühnerei Weiß Lysozym oder Insulin Amyloid Fibrillen beobachtet, Behandlung mit Alpha-Synuclein Fibrillen führte zu einem erheblichen Anstieg des ROS-Gehalts des Gehirns Mitochondrien.Das vorliegende Video beschreibt eine Modellstudie für den Mechanismus der Fibel-Aggregatzytotoxizität auf Membranebene und zeigt, wie Amyloidfibrillen, die aus verschiedenen Proteinen entstehen, unterschiedliche Grade von Membranschäden und Permeabilisierung verursachen können. Während einige Themen der Amyloidfibrillen und ihre spezifische Bindungsmembran scheinen mit der Fähigkeit zu interagieren und verursachen Destabilisierung und nachfolgende Störungen der Membranen. Nach diesem Video werden Sie in der Lage sein, die Wechselwirkung von nativer Form, Präfibrillar und reifen Amyloidfibrillen verschiedener Peptide und mit Mitochondrien aus verschiedenen Geweben oder verschiedenen Bereichen des Gehirns isoliert zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Ein Tailored HPLC Reinigungsprotokoll, dass die Renditen hochreine Amyloid Beta 42 und Amyloid Beta 40 Peptides, Fähig zur Oligomerbildung

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Erzeugung von nativen, unmarkierten Huntingtin Exon1 Monomer und Fibrillen mit einem SUMO-Fusion-Strategie

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...