Name: interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים ממועצת המחקר של המכון ללימודים מתקדמים במדעי היסוד (IASBS), זנג'אן, איראן.

כל ניסויי החיות בוצעו בהתאם לועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במדעי הרפואה של אוניברסיטת טהראן. מאמצים מרביים נעשו כדי למזער את הסבל ואת ההשפעות המזיקות על ידי חידוד להבי הגיליוטינה והפעלת תנועות החלטי ומהיר של הלהב.
1. המגון המוח ובידוד מיטוכונדריאלי
<p class="jove_con...

<ol>
	<li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amyloidosis.">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li><li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Link&#246;ping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).</li><li>Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation,+ion+channel+formation,+and+membrane+damage.">Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage.</a> Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).</li><li>Demuro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dysregulation+and+membrane+disruption+as+a+ubiquitous+neurotoxic+mechanism+of+soluble+amyloid+oligomers.">Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).</li><li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+lipid+bilayers+is+a+common+conformation-dependent+activity+of+soluble+amyloid+oligomers+in+protein+misfolding+diseases.">Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).</li><li>Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+oxidative+phosphorylation+genes+in+patients+with+Alzheimer's+disease:+implications+for+early+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+damage.">Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage.</a> Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).</li><li>Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+alterations+in+Parkinson's+disease:+new+clues.">Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues.</a> Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+peptide+channels.">Amyloid peptide channels.</a> The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).</li><li>Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease:+amyloid+pores+from+pathogenic+mutations.">Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations.</a> Nature. 418, 291 (2002).</li><li>Sims, N. R., Anderson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+rat+brain+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation.</a> Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).</li><li>Ghobeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+A&#946;+(25-35)+Fibrillation+Products+with+Mitochondria:+Effect+of+Small-Molecule+Natural+Products.">Interaction of A&#946; (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products.</a> Peptide Science. 102, 473-486 (2014).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).</li><li>Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+some+enzymatic+properties+of+the+inner+and+outer+membrane+of+rat+liver+mitochondria.">Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).</li><li>Hoyer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+a-Synuclein+Aggregate+Morphology+on+Solution+Conditions.">Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).</li><li>Weinreb, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP,+a+protein+implicated+in+Alzheimer's+disease+and+learning,+is+natively+unfolded.">NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded.</a> Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).</li><li>Porter, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+chromatography+of+insulin+and+other+proteins.">Partition chromatography of insulin and other proteins.</a> The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).</li><li>Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+competition+between+renaturation+and+aggregation+during+the+refolding+of+denatured+reduced+egg+white+lysozyme.">A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme.</a> Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).</li><li>Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+isolated+rat+hepatocytes+and+liver+mitochondria:+studies+using+myxothiazol.">Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).</li><li>Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+integrity+and+amyloid+cytotoxicity:+a+model+study+involving+mitochondria+and+lysozyme+fibrillation+products.">Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products.</a> Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).</li><li>Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+silibinin+on+insulin+amyloid+fibrillation,+cytotoxicity+and+mitochondrial+membrane+damage.">Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).</li><li>Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aggregation+and+fibrillation+of+alpha-synuclein.">The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein.</a> Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).</li><li>Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+the+membrane+interaction+of+FYVE+domains.">Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains.</a> Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).</li><li>Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+&#945;-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core.">Lipid bilayer disruption by oligomeric &#945;-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li><li>Kourie, J. I., Henry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+formation+and+membrane-linked+pathologies+of+misfolded+hydrophobic+proteins:+the+role+of+dangerous+unchaperoned+molecules.">Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 29, 741-753 (2002).</li><li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases.">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li><li>Bolognesi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANS+binding+reveals+common+features+of+cytotoxic+amyloid+species.">ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species.</a> ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).</li><li>Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles:+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content.">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li><li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers:+possible+mechanism+of+action.">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li><li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein.">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li><li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains.">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li><li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+&#945;-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson's+disease-role+of+cardiolipin.">Interaction of &#945;-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1.">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li></ol>

שפע של תוצאות ניסיוני תומך ההשערה כי רעילות ציטוהfibrillar של אגרגטים משויך באופן משמעותי עם יכולתם לתקשר עם הממברנות ביולוגיות4,5. עם זאת, רוב הנתונים מבוססים על bilayers השומנים מלאכותי שאינם משקפים בהכרח את המאפיינים הפנימיים של ממברנות ביולוגיים, אשר הם מבנים ה?...

הפרעות הקשורות עמילואיד, המכונה amyloidoses, מהווים קבוצה גדולה של מחלות המוגדרים על ידי מראה של פיקדונות חלבון מסיסים ברקמות שונות ואיברים1,2. ביניהם, הפרעות ניווניות הן הצורות התכופות ביותר שבהן מופיעות אגרגטים חלבונים במערכת העצבים המרכזית או ההיקפית2. למרות מספר מנגנונים הוצעו להיות מעורב רעילות של אגרגטים עמילואיד3, גוף גדל והולך של ראיות מצביע על שיבוש קרום התא והחדירות כמנגנון העיקרי של מחלות עמילואיד4, 5. המשך בנוסף קרום פלזמה, אורגלים פנימיים (כלומר, המיטו,) יכול להיות גם מושפע.
מעניין, הראיות המתעוררים עולה כי תפקוד מיטוכונדריאלי משחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של הפרעות ניווניות, כולל אלצהיימר ו פרקינסון מחלות6,7. בהתאם לבעיה זו, דיווחים רבים הצביעו על כריכה וצבירה של עמילואיד β-פפטיד, α-synuclein, huntingtin, ו-ALS מקושר מוטציה SOD1 חלבונים כדי המיטומטר8,9,10, 11. המנגנון של חדירות הממברנה על ידי מצרפים של עמילואיד נחשב להתרחש או באמצעות היווצרות של ערוצים נפרדים (נקבוביות) ו/או באמצעות מנגנון ניקוי שאינו מסוים כמו סבון5,12, . שלוש עשרה ראוי לציין כי מרבית המסקנות הללו התבססו על דוחות הכרוכים במערכות מודל פוספוליפיד, ומחקרים המכוונים ישירות לאירועים המתרחשים בקרומים ביולוגיים הם נדירים. ברור, אלה שומנים מלאכותיים מלאכותי לא בהכרח משקפים את התכונות הפנימיות של ממברנות ביולוגיים, כולל אלה של המיטו, אשר הם מבנים הטרוגנית מורכב מגוון רחב של פוספוליפידים וחלבונים.
במחקר הנוכחי, המיטו, מבודדים מן המוח חולדה משמשים כמודל ביולוגי בלתי מתורבת כדי לבחון את ההשפעות ההרסניות של העמילואיד סיבים הנובעים α-synuclein (כמו חלבון amyloidogenic), שור אינסולין (כמו פפטיד מודל מראה הומולוגיה מבנית משמעותית עם אינסולין אנושי מעורב עמילואידוזיס הזרקת מקומי), וביצת חן לבן ליזוזים (hewl; כחלבון מודל נפוץ לחקר מצבור עמילואיד). האינטראקציות והנזק האפשרי של ממברנות מיטוכונדריאלי הנגרמת על ידי העמילואיד נחקרים לאחר מכן על ידי התבוננות שחרורו של המאלף מיטוכונדריאז (MDH) (ממוקם במטריקס מיטוכונדריאלי) וחמצן תגובתי המיטוגרמה שיפור מיני (ROS).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1012171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Clear-bottomed 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA essentially fatty acid-free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (cut off 2 KDa)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Potter Elvehjem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Cary Eclipse VARIAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Made in Iran</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme (HEWL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CS0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sodium tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>analytik jena</td>
			<td>SPEKOL 2000 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1076871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1082191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils

גוף הולך וגדל של ראיות מעיד על חדירות הממברנה, כולל קרומים פנימיים כגון המיטוגרם, היא תכונה נפוצה המנגנון העיקרי של רעילות המושרה עמילואיד במחלות ניווניות. עם זאת, רוב הדיווחים המתארים את המנגנונים של שיבוש הממברנה מבוססים על מערכות מודל פוספוליפיד, ומחקרים המכוונים ישירות לאירועים המתרחשים ברמת הקרומים הביולוגיים הם נדירים. המתואר כאן הוא מודל ללמוד את המנגנונים של רעילות עמילואיד ברמת הקרום. עבור בידוד מיטוכונדריאלי, צפיפות בינונית הדרגתי משמש להשגת ההכנות עם זיהום מיאלין מינימלי. לאחר אישור מיטוכונדריאלי שלמות הממברנה, האינטראקציה של העמילואיד סיבים עולה מ α-synuclein, אינסולין השור, ו ביצת חן לבן ליזוזים (hewl) עם המוח עכברוש המיטוa, כמו מודל ביולוגי מבחנה, הוא נחקר. התוצאות להפגין כי הטיפול של המיטו, המוח עם הרכבות fibrillar יכול לגרום לדרגות שונות של חדירות הקרום ו-ROS שיפור תוכן. הדבר מצביע על אינטראקציות תלויות-מבנה בין עמילואיד בקרום מיטוכונדריאלי. הוא הציע מאפיינים ביופיזיים של העמילואיד והכריכה הספציפית שלהם לקרומים מיטוכונדריאלי עשויים לספק הסברים לחלק מתצפיות אלה.

הפרוטוקול מתאר מודל ללמוד את האינטראקציות של עמילואיד עם מיטוכונטובית של המוח העכברוש כמו מודל ביולוגי מבחנה. עבור הכנה מיטוכונדריאלי, 15% (v/v) צפיפות מעבר הצבע בינונית שימש להסרת המיאלין כזיהום העיקרי של רקמת המוח14. כפי שמוצג באיור 1A, הצנטריפוגה ב-30,700 x g הפ...

Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

בתנאי זה הוא פרוטוקול לחקירת האינטראקציות בין הצורה הטבעית, prefibrillar, ו-עמילואיד בוגרים של פפטידים וחלבונים שונים עם המיטו, מבודדים מרקמות שונות ואזורים שונים של המוח.

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

בסרטון זה, אנו מתארים מחקר מודל למנגנון של רעילות עמילואיד ברמת הממברנה באמצעות מיטוכונדריה במוח עכברוש כמודל ביולוגי במבחנה. למרות דו"ח מצטבר המתאר מנגנון של הפרעות קרום על ידי צבירה עמילואיד במערכות מודל פוספוליפיד למד ישירות מיקוד האירועים החל בפיתוח קרום ביולוגי. בסרטון הנוכחי, אנו מתארים fibrils עמילואיד של אלפא-סינוקלין ניתוח קרום המיטוכונדריה במוח החולדה כמודל ביולוגי במבחנה.אנו מאמינים כי המיטוכונדריה כאברון עם קרום מאופיין היטב עשוי לספק מערכת מודל ביולוגי שימושי מאוד עבור מחקרים מולקולריים הקשורים למנגנון של ציטוקסיות עמילואיד ברמת הממברנה הקשורים למחלות ניווניות. ערפו את ראשו של החולדה בגיליוטינה של בעלי חיים קטנים והוציאו את המוח מהסולם תוך דקה אחת מעורף החולדה כדי להגביל הידרדרות אפשרית של תכונות המיטוכונדריות. חשוב לעבוד במהירות ולשמור הכל על הקרח לאורך כל ההליך.לשטוף את הרקמה פעמיים עם 30 מיליליטר של חיץ בידוד. מעבירים למקורה המכילה חיץ בידוד קר וטחון דק את המוח במספריים. העבר את ההשעיה רקמה כדי homogenizer 20 מיליליטר קר dounce.הומוגניזציה של חתיכות הרקמה באמצעות תשע משיכות למעלה ולמטה עם עלה ממונע. השאירו את התערובת על הקרח למשך כ-30 שניות לאחר כל קבוצה של שלוש משיכות הומוגניזציה כדי להבטיח שההומוגניאט יישאר קר. מעבירים את ההומוגנטי לצינור צנטריפוגה מקורר מראש וצנטריפוגה ב 1, 300 G בארבעה Centigrade במשך שלוש דקות.בזהירות decant את supernatant ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה מקורר מראש. צנטריפוגה ב 21, 000 G בארבעה סנטיגרד במשך 10 דקות. השליכו את העל-טבעי והתינו מחדש את גלולת הכדור במדיום שיפוע צפיפות על ידי ערבוב עדין של התערובת עם הפיפט.צנטריפוגה ברוטור זווית קבועה ב 30, 700 G בארבעה סנטיגרד במשך חמש דקות. באמצעות פיפטה פסטר, להסיר את הקצה החד של חומר שנצבר בחלק העליון, אשר מכילים בעיקר מילין. מוסיפים חיץ בידוד של שמונה מיליליטר לשבר המיטוכונדריאלי תוך ערבוב עדין של התערובת עם הפיפסה.צנטריפוגה ב 16, 700 G בארבעה סנטיגרד במשך 10 דקות. בזהירות להסיר את supernatant, משאיר את גלולה רופפת התחתונה באין מפריע. הוסיפו מיליליטר אחד של 10 מיליגרם ל-BSA נטול חומצות שומן מיליליטר לצינור צנטריפוגה תוך ערבוב עדין של התערובת עם קצה הפיפט.הפוך את עוצמת הקול לחמישה מיליליטר על-ידי הוספת מאגר בידוד. צנטריפוגה ב 6, 900 G בארבעה סנטיגרד במשך 10 דקות. זה אמור לייצר גלולה מוצקה.תפענחו את העל-טבעי ותתנו מחדש בעדינות את גלולת המיטוכונדריה במאגר הבידוד. לדלל הומוגנית מיטוכונדריאלית למיליגרם אחד למיליליטר עם חיץ בידוד קר ולמקום בשני צינורות 1.5 מיליליטר, בדרך כלל 195 microliter של מיטוכונדריה לכל צינור. הוסף חמישה מיקרוליטר 20% נפח לכל נפח טריטון X-100 לצינור אחד כבקרה חיובית עבור פעילות אנזים מקסימלית וחמישה מים deionized microliter לצינור אחר לשליטה, ואחריו ערבוב עם stirrer.הדגירה את הצינורות במשך 10 דקות באמבט מים חמים להגדיר 30 Centigrade. גלולה מיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה של צינורות רוטור זווית קבועה ב 16, 000 G ארבעה Centigrade במשך 15 דקות. בזהירות לאסוף supernatants וכתוצאה מכך להערכת הפעילות של מיטוכונדריאלי מלאט דהידרוגנאז באמצעות הערכה ספקטרופוטומטרית סטנדרטית המתוארת על החלק הבא.חשב את שלמות הממברנה המיטוכונדרית כדלקמן. עבור קביעת פעילות malate dehydrogenase, פיפטה 890 ו 880 microliter 50 מילימולאר טריס-HCL חיץ כדי cuvettes בדיקה ריק מדגם בהתאמה ואחריו 100 microliter 50 oxaloacetate מילימולארי ו 10 microliter של 10 מילימולאר בטא-NADH. שים את cuvettes בספקטרופוטומטר והתייחסות נגד ריק.הוסף 10 מיקרוליטר הומוגניאט מיטוכונדריאלי מיליגרם אחד למיליליטר כדי לדגום cuvette. מיד מערבבים על ידי היפוך. שיא ירידה בספיגה עקב חמצון NADH ב 340 ננומטר לדקה אחת.עבור פרפור עמילואיד אלפא-סינוקליין, להוסיף 294 microliter של פתרון חלבון, 200 micromolar לכל צינור 1.5 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף שישה מיקרוליטר פתרון ThT מילימולר אחד. מערבבים את הפתרונות ודחוסים את הצינורות בתרמומיקסר ב 37 Centigrade תחת ערבוב מתמיד ב 800 סל"ד.עבור fibrillation עמילואיד אינסולין, להוסיף 637 microliter של פתרון חלבון, 250 micromolar כדי 1.5 צינור מיליליטר. לאחר מכן להוסיף 13 פתרון ThT microliter אחד מילימולר ואחריו ערבוב. הוסיפו 200 מיקרוליטר של פתרונות חלבון לכל באר של צלחת ברורה של 96 בארות.לאטום את הצלחת עם סרט איטום ברור כשמש. טען את הצלחת לתוך ציטציה 5 קורא לוחיות פלואורסצנטיות. למדוד פלואורסצנטיות ThT במרווחים של 30 דקות במשך 12 שעות.השתמש בגירוש ב 440 ננומטר ו פליטה ב 485 ננומטר. בחר את בארות. לנער את הצלחת במשך חמש שניות לפני כל מדידה.הגדר את הטמפרטורה ב 57 סנטיגרד ללא תסיסה. הכינו שתי סדרות של צינורות 1.5 מיליליטר המכילים הומוגנטים מיטוכונדריאליים, סדרה אחת להסטת שחרור MDH וסדרה אחרת למדידת ROS מיטוכונדריאלי. הוסף aliquots של fibrils טריים או עמילואיד של אלפא-סינוקליין, אינסולין חזיר או ליזוזה לבן ביצה תרנגולת הומוגנית מיטוכונדריאלי ואחריו צינורות בעדינות.צינורות דגירה המכילים מתלים מיטוכונדריאליים במשך 30 דקות באמבט מים חמים להגדיר 30 Centigrade. עבור מלט דהידרוגנאז לשחרר assay, צנטריפוגה דגירה הומוגניים מיטוכונדריאלי ב 16, 000 G במשך 15 דקות. בזהירות לאסוף supernatants וכתוצאה מכך להתוות את הפעילות של MDH המיטוכונדריאלי כמתואר בסעיף פרוטוקול חלק ארבע.חשב את שחרורו של MDH באופן הבא. למדידת ROS מיטוכונדריאלי, פיפטה 191 מיקרוליטר של הומוגנית מיטוכונדריאלית מודגרת לכל באר של צלחת 96 באר. הוסף ארבעה מיקרוליטר של 50 DCFDA מיקרומולרית.לאחר מכן להוסיף חמישה microliter של 200 מילימולרים succinate. הדגירה את הצלחת במשך 30 דקות באמבט מים חמים להגדיר 30 Centigrade תוך ערבוב עדין. לטעון את הצלחת לתוך ציטציה 5 קורא לוחיות פלואורסצנטיות ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות על פי סעיף הפרוטוקול.שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית הוערכה על ידי מדידת פעילות MDH במיטוכונדריה המבודדת לפני ואחרי שיבוש קרום ושחרור אנזימים על ידי טריטון X-100. כפי שאתם רואים, מצאנו בדרך כלל כי ההכנות המיטוכונדריות הן כ 93% שלם. ThT פלואורסצנטיות הראיה בוצעה כדי לפקח על הצמיחה של שרירנים עמילואיד.העקומה של פרפור עמילואיד של שלושה חלבונים הראתה דפוס סיגמואידלי טיפוסי, שהגיע לרמה בסביבות 96, 12 ו -96 שעות עבור אלפא-סינוקליין, אינסולין חזיר, lysozyme לבן ביצה תרנגולת בהתאמה, מה שמרמז על היווצרות של fibrils עמילואיד שאושרה יותר על ידי מדידת AFM. חלחלה אפשרית ונזק של קרום מיטוכונדריאלי על ידי fibrils עמילואיד נחקר על ידי שחרורו של MDH המיטוכונדריאלי ומדידת ROS המיטוכונדריאלי. כפי שאתה רואה בגרף השמאלי, שחרור משמעותי של MDH נצפתה על תוספת של fibrils עמילואיד אלפא-סינוקליין המיטוכונדריה.בעוד שחרור קל זוהה על ידי אינסולין fibrils, תרנגולת ביצה לבן lysozyme fibrils נמצאו להיות יעיל. גרף ימני מראה את ההשפעה של fibrils עמילואיד על תוכן ROS המיטוכונדריאלי. אמנם אין שיפור משמעותי ROS המיטוכונדריאלי נצפתה על תוספת של lysozyme לבן ביצה תרנגולת או אינסולין עמילואיד fibrils, טיפול עם fibrils אלפא-סינוקליין הוביל לעלייה ניכרת בתתוכן ROS של המיטוכונדריה במוח.הסרטון הנוכחי מתאר מחקר מודל למנגנון של ציטוקסיות ציטוקסיות מצרפית שוקית ברמת הממברנה, המדגים כיצד פירורי עמילואיד הנובעים מחלבונים שונים עלולים לגרום לדרגות שונות של נזק לממברנה וחדירה. בעוד כמה נושאים של fibrils עמילואיד ואת קרום מחייב ספציפי שלהם נראה לספק את היכולת לקיים אינטראקציה עם ולגרום חוסר יציבות וההטרדה הבאים של ממברנות. לאחר וידאו זה, תוכל לחקור את האינטראקציה של צורה מקומית, פרפור מראש, fibrils עמילואיד בוגרת של פפטידים שונים עם המיטוכונדריה מבודד מרקמות שונות או אזורים שונים של המוח.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

הדמיה עמילואיד ברקמות מוכתם Oligothiophenes מצומדת זורח על ידי היפרספקטרליות קונאפוקלית מיקרוסקופ והדמיה שלמים קרינה פלואורסצנטית

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

דור של Huntingtin Exon1 טבעית, לא מתויגות מונומר, הסיבים משתמש באסטרטגיה פיוז'ן סומו

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...