Name: interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio di ricerca dell'Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), s.r.l.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) di Scienze Mediche dell'Università di Teheran. Sono stati compiuti sforzi massimi per ridurre al minimo la sofferenza e gli effetti dannosi per i ratti affilando le lame della ghigliottina e applicando movimenti risoluti e rapidi della lama.
1. omogeneizzazione cerebrale e isolamento mitocondriale
NOTA: Tutti i reagenti per l'...

<ol>
	<li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amyloidosis.">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li><li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Link&#246;ping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).</li><li>Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation,+ion+channel+formation,+and+membrane+damage.">Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage.</a> Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).</li><li>Demuro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dysregulation+and+membrane+disruption+as+a+ubiquitous+neurotoxic+mechanism+of+soluble+amyloid+oligomers.">Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).</li><li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+lipid+bilayers+is+a+common+conformation-dependent+activity+of+soluble+amyloid+oligomers+in+protein+misfolding+diseases.">Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).</li><li>Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+oxidative+phosphorylation+genes+in+patients+with+Alzheimer's+disease:+implications+for+early+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+damage.">Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage.</a> Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).</li><li>Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+alterations+in+Parkinson's+disease:+new+clues.">Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues.</a> Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+peptide+channels.">Amyloid peptide channels.</a> The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).</li><li>Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease:+amyloid+pores+from+pathogenic+mutations.">Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations.</a> Nature. 418, 291 (2002).</li><li>Sims, N. R., Anderson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+rat+brain+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation.</a> Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).</li><li>Ghobeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+A&#946;+(25-35)+Fibrillation+Products+with+Mitochondria:+Effect+of+Small-Molecule+Natural+Products.">Interaction of A&#946; (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products.</a> Peptide Science. 102, 473-486 (2014).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).</li><li>Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+some+enzymatic+properties+of+the+inner+and+outer+membrane+of+rat+liver+mitochondria.">Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).</li><li>Hoyer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+a-Synuclein+Aggregate+Morphology+on+Solution+Conditions.">Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).</li><li>Weinreb, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP,+a+protein+implicated+in+Alzheimer's+disease+and+learning,+is+natively+unfolded.">NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded.</a> Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).</li><li>Porter, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+chromatography+of+insulin+and+other+proteins.">Partition chromatography of insulin and other proteins.</a> The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).</li><li>Goldberg, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+isolated+rat+hepatocytes+and+liver+mitochondria:+studies+using+myxothiazol.">Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).</li><li>Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+integrity+and+amyloid+cytotoxicity:+a+model+study+involving+mitochondria+and+lysozyme+fibrillation+products.">Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products.</a> Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).</li><li>Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+silibinin+on+insulin+amyloid+fibrillation,+cytotoxicity+and+mitochondrial+membrane+damage.">Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).</li><li>Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aggregation+and+fibrillation+of+alpha-synuclein.">The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein.</a> Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).</li><li>Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+the+membrane+interaction+of+FYVE+domains.">Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains.</a> Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).</li><li>Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+&#945;-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core.">Lipid bilayer disruption by oligomeric &#945;-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li><li>Kourie, J. I., Henry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+formation+and+membrane-linked+pathologies+of+misfolded+hydrophobic+proteins:+the+role+of+dangerous+unchaperoned+molecules.">Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 29, 741-753 (2002).</li><li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases.">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li><li>Bolognesi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANS+binding+reveals+common+features+of+cytotoxic+amyloid+species.">ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species.</a> ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).</li><li>Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles:+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content.">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li><li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers:+possible+mechanism+of+action.">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li><li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein.">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li><li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains.">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li><li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+&#945;-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson's+disease-role+of+cardiolipin.">Interaction of &#945;-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1.">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li></ol>

Una ricchezza di risultati sperimentali supporta l'ipotesi che la citotossicità degli aggregati fibrillare sia significativamente associata alla loro capacità di interagire con le membrane biologiche4,5. Tuttavia, la maggior parte dei dati si basa su bistrati lipidici artificiali che non riflettono necessariamente le proprietà intrinseche delle membrane biologiche, che sono strutture eterogenee con un'ampia varietà di fosfolipidi e proteine. Qui, usando i mit...

I disturbi correlati all'amiloide, noti come amiloidosi, costituiscono un grande gruppo di malattie definite dalla comparsa di depositi di proteine insolubili in diversi tessuti e organi1,2. Tra questi, i disturbi neurodegenerativi sono le forme più frequentemente in cui gli aggregati proteici compaiono nel sistema nervoso centrale o periferico2. Sebbene siano stati proposti diversi meccanismi coinvolti nella tossicità degli aggregati amiloidi3, un corpo crescente di prove indica l'interruzione della membrana cellulare e la permeabilizzazione come meccanismo primario della patologia amiloide4, 5. Oltre alla membrana plasmatica, possono essere colpiti anche organelli interni (cioè mitocondri).
È interessante notare che le evidenze emergenti suggeriscono che la disfunzione mitocondriale svolge un ruolo critico nella patogenesi dei disturbi neurodegenerativi, tra cui il morbo di Alzheimer e Parkinson6,7. In conformità con questo problema, numerose relazioni hanno indicato il legame e l'accumulo di proteine amiloidi di amiloide, di SOD1 mutanti amiloidi, di sinucleina, huntingtina e di SOD1 mutanti legati alla SLA alle proteine dei mitocondri8,9,10, 11.Si ritiene che il meccanismo della permeabilizzazione della membrana mediante aggregati amiloidi avvenga attraverso la formazione di canali discreti (pori) e/o attraverso un meccanismo non specifico simile al detergente5,12, 13. È interessante notare che la maggior parte di queste conclusioni si sono basate su relazioni che coinvolgono sistemi di modelli fosforidi, e gli studi che mirano direttamente agli eventi che si verificano nelle membrane biologiche sono rari. Chiaramente, questi bistrati lipidi artificiali non riflettono necessariamente le proprietà intrinseche delle membrane biologiche, comprese quelle dei mitocondri, che sono strutture eterogenee e composte da un'ampia varietà di fosfolipidi e proteine.
Nel presente studio, i mitocondri isolati dal cervello del ratto sono utilizzati come modello biologico in vitro per esaminare gli effetti distruttivi delle fibrille amiloidi derivanti da omologia strutturale significativa con insulina umana coinvolta nell'amiloidosi imdovelva-localizzata) e lisozima bianco d'uovo di gallina (HEWL; come proteina modello comune per lo studio dell'aggregazione di amiloide). Le interazioni e i possibili danni delle membrane mitocondriali indotte dalle fibrille amiloidi vengono quindi studiati osservando il rilascio di dihydrogenasi di malata malato mitocondriale (MDH) (situato nella matrice mitocondriale) e ossigeno reattivo mitocondriale (ROS).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1012171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Clear-bottomed 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA essentially fatty acid-free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (cut off 2 KDa)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Potter Elvehjem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Cary Eclipse VARIAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Made in Iran</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme (HEWL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CS0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sodium tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>analytik jena</td>
			<td>SPEKOL 2000 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1076871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1082191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils

Un numero crescente di prove indica che la permeabilizzazione della membrana, comprese le membrane interne come i mitocondri, è una caratteristica comune e un meccanismo primario della tossicità indotta dall'aggregazione amiloide nelle malattie neurodegenerative. Tuttavia, la maggior parte dei rapporti che descrivono i meccanismi di interruzione della membrana si basano su sistemi di modelli fosforidi, e gli studi che si rivolgono direttamente agli eventi che si verificano a livello di membrane biologiche sono rari. Descritto qui è un modello per studiare i meccanismi di tossicità amiloide a livello di membrana. Per l'isolamento mitocondriale, il mezzo di pendenza di densità viene utilizzato per ottenere preparati con contaminazione da mielina minima. Dopo la conferma dell'integrità della membrana mitocondriale, viene studiata l'interazione delle fibrille amiloidi derivanti da z-sinucleina, insulina bovina e lisozomina dell'uovo di gallina (HEWL) con mitocondri cerebrali, come modello biologico in vitro. I risultati dimostrano che il trattamento dei mitocondri cerebrali con gruppi di fibrillari può causare diversi gradi di permeabilizzazione della membrana e miglioramento del contenuto ROS. Ciò indica interazioni dipendenti dalla struttura tra fibrille amiloidi e membrana mitocondriale. Si suggerisce che le proprietà biofisiche delle fibrille amiloidi e il loro legame specifico alle membrane mitocondriali possono fornire spiegazioni per alcune di queste osservazioni.

Il protocollo descrive un modello per studiare le interazioni della fibrilla amiloide con i mitocondri cerebrali di ratto come modello biologico in vitro. Per la preparazione mitocondriale, 15% (v/v) grado di gradiente di densità è stato utilizzato per rimuovere la mielina come contaminazione principale del tessuto cerebrale14. Come mostrato nella Figura 1A, la centrifugazione a 30.700 x g ha prodotto due bande distinte di materiale, la mielina <span style=...

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Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Fornito qui è un protocollo per studiare le interazioni tra forma nativa, prefibrillare, e fibrille amiloidi mature di diversi peptidi e proteine con mitocondri isolati da diversi tessuti e varie aree del cervello.

Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In questo video, descriviamo uno studio modello per il meccanismo della tossicità amiloide a livello di membrana usando i mitocondri cerebrali del ratto come modello biologico in vitro. Nonostante accumuli un rapporto che descrive il meccanismo delle perturbazioni della membrana per aggregato amiloide in sistemi modello fosfolipidi studiati direttamente mirati agli eventi che iniziano a sviluppare membrana biologica. Nel presente video, descriviamo fibrille amiloide di alfa-sinuleina analizzando la membrana mitocondriale cerebrale del ratto come un modello biologico in vitro.Crediamo che i mitocondri come organelli con membrane ben caratterizzate possano fornire un sistema di modelli biologici estremamente utile per studi molecolari relativi al meccanismo della citotossicità amiloide a livello di membrana relativa alle malattie neurodegenerative. Decapitare il topo con una piccola ghigliottina animale e rimuovere il cervello dalla scala entro un minuto dalla decapitazione del ratto per limitare il possibile deterioramento delle proprietà mitocondriali. È importante lavorare rapidamente e mantenere tutto sul ghiaccio durante tutta la procedura.Lavare il tessuto due volte con 30 millilitri di tampone di isolamento. Trasferire in un becher contenente tampone di isolamento freddo e tritare finemente il cervello con le forbici. Trasferire la sospensione del tessuto in un omogeneizzatore a dounce freddo da 20 millilitri.Omogeneizzare i pezzi di tessuto usando nove tratti su e giù con un pestello motorizzato. Lasciare la miscela sul ghiaccio per circa 30 secondi dopo ogni set di tre colpi di omogeneizzazione per assicurarsi che l'omogeneato rimanga freddo. Trasferire l'omogeneato in un tubo di centrifuga pre-refrigerato e centrifugare a 1.300 G a quattro centigradi per tre minuti.Decantare con cura il supernatante e trasferirlo in un tubo di centrifuga pre-refrigerato. Centrifuga a 21.000 G a quattro Centigradi per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un mezzo gradiente di densità mescolando delicatamente la miscela con la pipetta.Centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 30.700 G a quattro centigradi per cinque minuti. Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere l'estremità affilata del materiale accumulato nella parte superiore, che per lo più contiene mielina. Aggiungere otto tamponi di isolamento millilitro alla frazione mitocondriale mescolando delicatamente la miscela con la pipetta.Centrifuga a 16.700 G a quattro Centigradi per 10 minuti. Rimuovere con cura il supernatante, lasciando il pellet sciolto inferiore indisturbato. Aggiungere un millilitro 10 milligrammo per BSA privo di acidi grassi millilitro al tubo di centrifuga mentre si mescola delicatamente la miscela con la punta della pipetta.Impostare il volume a cinque millilitri aggiungendo il buffer di isolamento. Centrifuga a 6.900 G a quattro Centigradi per 10 minuti. Questo dovrebbe produrre un pellet solido.Decantare il supernatante e rimescolare delicatamente il pellet mitocondriale in tampone di isolamento. Diluire l'omogeneato mitocondriale a un milligrammo per millilitro con tampone di isolamento a freddo e posizionare in due tubi da 1,5 millilitri, tipicamente 195 microlitri di mitocondri per tubo. Aggiungere cinque microliter 20% volume per volume Triton X-100 a un tubo come controllo positivo per la massima attività enzimatica e cinque microliter acqua deionizzata ad un altro tubo per il controllo, seguito dalla miscelazione con un agitatore.Incubare i tubi per 10 minuti in bagno d'acqua calda impostato su 30 centigradi. Mitocondri a pellet per centrifugazione di tubi in un rotore ad angolo fisso a 16.000 G quattro centigradi per 15 minuti. Raccogliere con cura i supernatanti risultanti per valutare l'attività della malato mitocondriale deidrogenasi utilizzando un saggio spettrofotometrico standard descritto nella parte successiva.Calcolare l'integrità della membrana mitocondriale come segue. Per la determinazione dell'attività della deidrogenasi malato, pipetta 890 e 880 microliter 50 millimolare tampone Tris-HCL rispettivamente a cuvette vuote e campione seguite da 100 microlitri 50 millimolare ossaloacetato e 10 microlitri di beta-NADH millimolare. Mettere le cuvette in uno spettrofotometro e fare riferimento a vuoto.Aggiungere 10 microlitri mitocondriali omogeneati di un milligrammo per millilitro per assaggiare la cuvetta. Mescolare immediatamente per inversione. Diminuzione record dell'assorbanza dovuta all'ossidazione del NADH a 340 nanometri per un minuto.Per la fibrillazione amiloide alfa-sinucleina, aggiungere 294 microlitri di soluzione proteica, 200 micromolari a ciascun tubo da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere sei microlitri ThT soluzione un millimolare. Mescolare le soluzioni e incubare i tubi in un termomixer a 37 centigradi sotto agitazione costante a 800 giri/min.Per la fibrillazione amiloide dell'insulina bovina, aggiungere 637 microlitri di soluzione proteica, da 250 micromolari a 1,5 millilitri tubo. Quindi aggiungere 13 microlitri Soluzione ThT un millimolare seguito da agitazione. Aggiungere aliquote 200 microliter di soluzioni proteiche ad ogni pozzo di una piastra chiara inferiore di 96 pozzetti.Sigillare la piastra con nastro adesivo cristallino. Caricare la piastra nel lettore di lastre di fluorescenza Cytation 5. Misurare la fluorescenza ThT a intervalli di 30 minuti per 12 ore.Utilizzare l'eccitazione a 440 nanometri e l'emissione a 485 nanometri. Selezionare i pozzi. Agitare la piastra per cinque secondi prima di ogni misurazione.Impostare la temperatura a 57 Centigradi senza agitazione. Preparare due serie di tubi da 1,5 millilitri contenenti omogeneati mitocondriali, una serie per il saggio di rilascio MDH e l'altra per la misurazione del ROS mitocondriale. Aggiungere aliquote di fibrille fresche o amiloidi di alfa-sinuleina, insulina bovina o lisozima di uova di gallina all'omogeneato mitocondriale seguito da pipettazione delicata.Incubare tubi contenenti sospensioni mitocondriali per 30 minuti in bagno d'acqua calda impostato su 30 Centigradi. Per il saggio di rilascio della malato deidrogenasi, la centrifuga ha incubato omogeneati mitocondriali a 16.000 G per 15 minuti. Raccogliere con cura i supernaganti risultanti per saggiare l'attività dell'MDH mitocondriale come descritto nella sezione del protocollo parte quarta.Calcolare il rilascio di MDH come segue. Per la misurazione mitocondriale del ROS, pipetta 191 microliter di omogeneato mitocondriale incubato ad ogni pozzo di una piastra da 96 pozzetto. Aggiungere quattro microliter di 50 micromolare DCFDA.Quindi aggiungere cinque microlitri di succinato da 200 millimolare. Incubare il piatto per 30 minuti in bagno d'acqua calda impostato su 30 centigradi mescolando delicatamente. Caricare la piastra in un lettore di piastre a fluorescenza Cytation 5 e misurare l'intensità della fluorescenza in base alla sezione del protocollo.L'integrità della membrana mitocondriale è stata valutata misurando l'attività dell'MDH nei mitocondri isolati prima e dopo l'interruzione della membrana e il rilascio enzimatico da parte di Triton X-100. Come vedete, in genere abbiamo scoperto che i preparati mitocondriali sono intatti per circa il 93%. Il test di fluorescenza ThT è stato effettuato per monitorare la crescita delle fibrille amiloide.La curva per la fibrillazione amiloide di tre proteine ha mostrato un tipico modello sigmoidale, raggiungendo un plateau a circa 96, 12 e 96 ore rispettivamente per alfa-sinucleina, insulina bovina e lisozima dell'albume di gallina, suggerendo la formazione di fibrille amiloide che è stata più confermata dalla misurazione AFM. La possibile permeabilizzazione e il danno della membrana mitocondriale da parte delle fibrille amiloide sono stati studiati con il rilascio di MDH mitocondriale e misurazione del ROS mitocondriale. Come vedete nel grafico sinistro, è stato osservato un rilascio sostanziale di MDH dopo l'aggiunta delle fibrille amiloide alfa-sinuleina ai mitocondri.Mentre un leggero rilascio è stato rilevato dalle fibrille di insulina, le fibrille di lisozima dell'uovo di gallina sono state trovate inefficaci. Il grafico a destra mostra l'effetto delle fibrille amiloidi sul contenuto di ROS mitocondriale. Mentre non è stato osservato alcun miglioramento significativo nel ROS mitocondriale dopo l'aggiunta di lisozima di uova di gallina o fibrille amiloide di insulina, il trattamento con fibrille alfa-sinuleina ha portato a un notevole aumento del contenuto di ROS nei mitocondri cerebrali.Il presente video descrive uno studio modello per il meccanismo della citotossicità aggregata della fibula a livello di membrana, dimostrando come le fibrille amiloide derivanti da varie proteine possano causare diversi gradi di danno alla membrana e permeabilizzazione. Mentre alcuni argomenti delle fibrille amiloide e della loro specifica membrana legante sembrano fornire la capacità di interagire e causare destabilizzazione e successive perturbazioni delle membrane. Dopo questo video, sarai in grado di indagare l'interazione di forma nativa, fibrillari pre-fibrillari e amiloidi maturi di diversi peptidi e con mitocondri isolati da diversi tessuti o varie aree del cervello.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Un Tailored HPLC purificazione protocollo che i rendimenti di elevata purezza beta-amiloide 42 e beta amiloide 40 peptidi, in grado di Oligomer Formazione

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

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Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

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Rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana

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Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Uso di elettroforesi del Gel di agarosio detergente semi-denaturante dimensionale due per confermare dimensioni eterogeneità delle fibre amiloidi o amiloide-come

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Generazione di monomero Exon1 huntingtina nativo, senza tag e fibrille usando una strategia di fusione di SUMO

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Rilevazione di piccolo GTPase prenilazione e GTP Binding mediante frazionamento di membrana e GTPase-collegata dell'immunosorbente

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...