Name: interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00
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이 작품은 기본 과학 연구소 (IASBS), 잔잔, 이란의 연구위원회의 보조금에 의해 지원되었다.

모든 동물 실험은 테헤란 대학의 의학 의학기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 따라 수행되었다. 기요틴 블레이드를 선명하게 하고 칼날의 단호하고 신속한 움직임을 적용하여 쥐의 고통과 해로운 영향을 최소화하기 위해 최대노력을 기울였습니다.
1. 뇌 균질화 및 미토콘드리아 분리
참고 : 미토 콘 드리 아 절연을위한 모든 시약은 심즈 앤더슨<sup class...

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	<li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amyloidosis.">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li><li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Link&#246;ping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).</li><li>Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP,+a+protein+implicated+in+Alzheimer's+disease+and+learning,+is+natively+unfolded.">NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded.</a> Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).</li><li>Porter, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+chromatography+of+insulin+and+other+proteins.">Partition chromatography of insulin and other proteins.</a> The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).</li><li>Goldberg, M. 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D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+&#945;-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core.">Lipid bilayer disruption by oligomeric &#945;-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li><li>Kourie, J. I., Henry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+formation+and+membrane-linked+pathologies+of+misfolded+hydrophobic+proteins:+the+role+of+dangerous+unchaperoned+molecules.">Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 29, 741-753 (2002).</li><li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases.">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li><li>Bolognesi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANS+binding+reveals+common+features+of+cytotoxic+amyloid+species.">ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species.</a> ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).</li><li>Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles:+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content.">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li><li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers:+possible+mechanism+of+action.">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li><li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein.">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li><li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains.">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li><li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+&#945;-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson's+disease-role+of+cardiolipin.">Interaction of &#945;-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1.">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li></ol>

풍부한 실험 결과는 세브릴라 응집체의 세포 독성이 생물학적 막과 상호 작용하고 투과하는 능력과 유의하게 연관되어 있다는 가설을 뒷받침합니다4,5. 그러나, 대부분의 데이터는 반드시 다양한 인지질 및 단백질을 가진 이기종 구조인 생물학적 막의 본질적인 특성을 반영하지 않는 인공 지질 이중층을 기반으로 합니다. 여기서, 뇌 미토콘드리아를 시...

아밀로이드 관련 장애, 아밀로이드 로 알려진, 다른 조직과 장기에 불용성 단백질 예금의 출현에 의해 정의 된 질병의 큰 그룹을 구성1,2. 그 중, 신경 퇴행성 질환은 단백질 응집체가 중추 또는 말초 신경계에 나타나는 가장 빈번한 형태이다2. 아밀로이드 골재의 독성에 관여하는 다수의 기제가 제안되었지만3,세포막 파괴 및 투과를 아밀로이드 병리학의 1차 기전으로 가리키는 증거가 증가하고 있다4, 5. 혈장 막 이외에, 내부 세포기관 (즉, 미토콘드리아)도 영향을받을 수 있습니다.
흥미롭게도, 새로운 증거는 미토콘드리아 기능 장애가 알츠하이머병및 파킨슨병을 포함한 퇴행성 신경 질환의 발병기전에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다6,7. 이 문제에 따라, 수많은 보고서는 미토콘드리아8,9,10에아밀로이드 β-펩티드, α-synuclein, 헌팅틴 및 ALS 연결 돌연변이 SOD1 단백질의 결합 및 축적을나타냈다. 11. 아밀로이드 응집체에 의한 막 투과 메커니즘은 이산 채널 (모공)의 형성 및 / 또는 비특이적 세제와 같은메커니즘을통해 발생하는 것으로 생각된다5,12, 13. 이러한 결론의 대부분은 인지질 모델 시스템을 포함 하는 보고서에 근거 되었습니다 주목할 만, 그리고 직접 생물학적 막에서 발생 하는 이벤트를 대상으로 하는 연구는 드문. 분명히, 이러한 인공 지질 이중층은 반드시 이질적인 구조이고 다양한 인지질 및 단백질로 구성된 미토콘드리아를 포함한 생물학적 막의 본질적인 특성을 반영하지는 않는다.
본 연구에서, 쥐 뇌로부터 분리된 미토콘드리아는 α-synuclein(아밀로이드 단백질), 소 인슐린(모델 펩타이드로 서 식)에서 발생하는 아밀로이드 섬유소의 파괴적인 효과를 조사하기 위해 시험관내 생물학적 모델로 사용된다. 주사 국소화 된 아밀로이드증에 관여하는 인간 인슐린과 중요한 구조적 상동성, 및 암탉 계란 흰자 리소자임 (HEWL; 아밀로이드 응집 연구를위한 일반적인 모델 단백질). 아밀로이드 섬유소에 의해 유도된 미토콘드리아 막의 상호 작용 및 가능한 손상은 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소(MDH)(미토콘드리아 매트릭스에 위치)와 미토콘드리아 반응성 산소의 방출을 관찰함으로써 조사됩니다. 종 (ROS) 향상.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1012171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Clear-bottomed 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA essentially fatty acid-free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (cut off 2 KDa)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Potter Elvehjem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Cary Eclipse VARIAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Made in Iran</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme (HEWL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CS0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sodium tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>analytik jena</td>
			<td>SPEKOL 2000 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1076871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1082191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils

증거의 성장 몸은 미토콘드리아와 같은 내부 막을 포함하여 막 관전이 신경 퇴행성 질환에서 아밀로이드 골재 유발 독성의 일반적인 특징및 1 차적인 메커니즘임을 나타냅니다. 그러나, 막 중단의 기계장치를 기술하는 대부분의 보고는 인지질 모형 시스템에 근거를 두고, 생물학 막의 수준에서 생기는 사건을 직접 표적으로 하는 연구 결과는 드뭅니다. 여기서 설명된 것은 막 수준에서 아밀로이드 독성의 메커니즘을 연구하기 위한 모델이다. 미토콘드리아 절연의 경우 밀도 구배 매미가 최소한의 미엘린 오염으로 제제를 얻는 데 사용됩니다. 미토콘드리아 막 무결성 확인 후, α-synuclein, 소 인슐린 및 암탉 계란 흰자 리소자임(HEWL)과 쥐 뇌 미토콘드리아에서 발생하는 아밀로이드 섬유소의 상호작용이 시험관내 생물학적 모델로서 조사된다. 결과는 섬유결집성으로 뇌 미토콘드리아를 치료하면 막 투과및 ROS 함량 향상의 다른 정도를 유발할 수 있음을 보여줍니다. 이것은 아밀로이드 섬유와 미토콘드리아 막 사이 구조 의존적인 상호 작용을 나타냅니다. 아밀로이드 섬유소의 생물학적 특성과 미토콘드리아 막에 대한 특정 결합이 이러한 관찰중 일부에 대한 설명을 제공할 수 있다고 제안됩니다.

프로토콜은 시험관 내 생물학적 모델로서 쥐 뇌 미토콘드리아와 아밀로이드 섬유의 상호 작용을 연구하기위한 모델을 설명합니다. 미토콘드리아 제제의 경우, 15% (v/v) 밀도 그라데이션 배지를 사용하여 뇌 조직의 주요 오염물질로서 미엘린을제거하였다 14. 그림 1A에도시된 바와 같이, 30,700 x g의 원심분리는 농축된 미토콘드리아 분획을 포함하는 두 ...

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Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

여기에 제공된 것은 다른 조직과 뇌의 다양한 영역에서 분리된 미토콘드리아를 가진 다른 펩티드 및 단백질의 네이티브 형태, 프리피릴라 및 성숙한 아밀로이드 섬유사이의 상호작용을 조사하기 위한 프로토콜이다.

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

이 비디오에서는 쥐 뇌 미토콘드리아를 체외 생물학적 모델로 사용하여 멤브레인 수준에서 아밀로이드 독성 메커니즘에 대한 모델 연구를 설명합니다. 인지질 모델 시스템의 아밀로이드 골재에 의한 멤브레인 변투기 메커니즘을 설명하는 보고서를 축적했음에도 불구하고 생물학적 막 개발에서 시작되는 사건을 직접 대상으로 연구했습니다. 본 영상에서는 쥐 뇌 미토콘드리아 막을 체외 생물학적 모델로 분석하는 알파 시뉴클레인의 아밀로이드 피브릴을 설명한다.우리는 잘 특징적인 막을 가진 세포기관으로 미토콘드리아가 신경 퇴행성 질환과 관련되었던 막 수준에서 아밀로이드 세포 독성의 기계장치에 관련되었던 분자 연구 결과를 위한 매우 유용한 생물학 모형 시스템을 제공할 수 있다고 믿습니다. 작은 동물 기요틴으로 쥐를 참수하고 미토콘드리아 특성의 가능한 악화를 제한하기 위해 쥐의 참수 1 분 이내에 규모에서 뇌를 제거합니다. 신속하게 작업하고 절차 전반에 걸쳐 얼음에 모든 것을 유지하는 것이 중요합니다.격리 완충제의 30 밀리리터로 조직을 두 번 씻으시다. 차가운 격리 버퍼를 포함하는 비커로 옮기고 가위로 뇌를 잘게 다진다. 조직 현탁액을 20 밀리리터 감기 로 전송하는 균질화.전동 유봉으로 9개의 상하 스트로크를 사용하여 조직 조각을 균질화합니다. 균질화가 차가운 상태로 유지되도록 3개의 균질화 스트로크의 각 세트 후에 약 30 초 동안 얼음에 혼합물을 둡니다. 동종포를 미리 냉각된 원심분리기 튜브와 원심분리기로 1, 300G에서 3분간 4시그레이드로 옮긴다.상체를 조심스럽게 데칭하고 미리 차가운 원심분리기 튜브로 옮춥니다. 10 분 동안 4 센티미터에서 21, 000 G의 원심 분리기. 피펫으로 혼합물을 부드럽게 저어서 상체를 버리고 밀도 그라데이션 매체에서 펠릿을 다시 놓습니다.30, 700 G의 고정 각도 로터의 원심분리기는 5분 동안 4센티미터의 700G입니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 상단에 축적된 재료의 날카로운 끝을 제거하여 대부분 미엘린을 함유합니다. 미토콘드리아 분획에 8밀리리터 절연 버퍼를 넣고 파이펫으로 혼합물을 부드럽게 저어줍니다.16, 700 G의 원심분리기는 4가지 섭씨에서 10분 동안. 상체를 조심스럽게 제거하고 바닥느슨한 펠릿을 방해받지 않고 남깁니다. 밀리리터 지방산이 없는 BSA당 1밀리리터 10밀리그램을 원심분리기 튜브에 넣고 파이펫 끝으로 혼합물을 부드럽게 저어줍니다.격리 버퍼를 추가하여 볼륨을 5밀리리터로 구성합니다. 10 분 동안 4 센티미터에서 6, 900 G의 원심 분리기. 이것은 단단한 펠릿을 생성해야합니다.상류제를 데칭하고 미토콘드리아 펠릿을 격리 버퍼로 부드럽게 재보펜합니다. 미토콘드리아 균주를 냉정한 절연 완충제로 밀리리터 당 1밀리그램으로 희석하고 튜브 당 미토콘드리아 의 195 마이크로리터인 1.5 밀리리터 튜브에 배치합니다. 볼륨 트리톤 X-100당 5개의 마이크로리터 20%를 최대 효소 활성을 위한 긍정적인 제어로 한 튜브에 20%의 마이크로리터를 추가하고 5개의 마이크로리터 디온화된 물을 다른 튜브에 추가하여 교반기와 혼합합니다.30 센트그레이드로 설정된 따뜻한 수조에서 튜브를 10분 동안 배양합니다. 펠릿 미토콘드리아는 16, 000 G 4 섭씨에서 고정 된 각도 로터에서 튜브의 원심 분리에 의해 15 분 동안. 다음 부분에 설명된 표준 분광광분석 분석법을 사용하여 미토콘드리아 황량제 탈수소효소의 활성을 평가하기 위한 결과 슈퍼나츠를 신중하게 수집한다.다음과 같이 미토콘드리아 막의 무결성을 계산합니다. malate 탈수소 효소 활동 결정의 경우, 파이펫 890 및 880 마이크로리터 50 밀리머 트리-HCL 버퍼를 블랭크 및 샘플 테스트 큐벳으로 각각 100 마이크로리터 50 밀리머 옥살로아세테이트와 10 밀리머 베타-NADH의 10 마이크로리터가 뒤따랐다. 큐벳을 분광광계에 넣고 빈 에 대한 참조를 넣습니다.10 마이크로리터 미토콘드리아 균질을 밀리리터당 1밀리그램을 첨가하여 큐벳을 샘플링합니다. 즉시 반전으로 섞습니다. NADH 산화로 인한 흡광도의 기록적인 감소는 1분 동안 340나노미터로 감소하였다.알파 시뉴클레인 아밀로이드 세동을 위해, 단백질 용액 294 마이크로리터, 각 1.5 밀리리터 튜브에 200 마이크로몰어를 추가하십시오. 그런 다음 6 개의 마이크로 리터 ThT 용액 1 밀리머를 추가합니다. 800 RPM에서 일정한 교반에서 37 Centigrade에서 솔루션을 혼합하고 thermomixer에 튜브를 인큐베이션합니다.소 인슐린 아밀로이드 세동의 경우 단백질 용액 637 마이크로리터, 250 마이크로몰라를 1.5 밀리리터 튜브에 추가하십시오. 그런 다음 13 마이크로 리터 ThT 용액 을 넣고 1 밀리머를 넣고 교반합니다. 투명한 하단 96웰 플레이트의 각 웰에 알리코트 200 마이크로리터의 단백질 용액을 추가합니다.수정처럼 맑은 밀봉 테이프로 접시를 밀봉합니다. 플레이트를 Cytation 5 형광 판 판독기에 적재합니다. 12시간 동안 30분 간격으로 ThT 형광을 측정합니다.440 나노미터에서 여기를 사용하고 485 나노 미터에서 배출하십시오. 우물을 선택합니다. 각 측정 전에 5초 동안 접시를 흔들어 줍니다.동요없이 57 섭씨에서 온도를 설정합니다. 미토콘드리아 균질화를 함유한 1.5밀리리터 튜브 2시리즈, MDH 방출 분석용 시리즈 및 미토콘드리아 ROS 측정을 위한 시리즈 1시리즈를 준비한다. 알파 시뉴클레인, 소 인슐린 또는 암탉 달걀 흰 자개미의 신선하거나 아밀로이드 피브릴을 미토콘드리아 균질에 넣고 부드럽게 파이펫팅합니다.30 센트리그레이드로 설정된 따뜻한 수조에서 미토콘드리아 현탁액을 30분 동안 포함하는 인큐베이터 튜브. 말린 탈수소 효소 방출 분석의 경우 원심분리기는 16, 000 G에서 15분 동안 유동균성을 배양합니다. 프로토콜 섹션 4부에 설명된 바와 같이 미토콘드리아 MDH의 활성을 속이는 결과 초월제를 신중하게 수집한다.MDH 릴리스를 다음과 같이 계산합니다. 미토콘드리아 ROS 측정을 위해, 96웰 플레이트의 각 웰에 배양된 미토콘드리아 균주형의 파이펫 191 마이크로리터. 50 마이크로 몰라 DCFDA의 4 마이크로 리터를 추가합니다.그런 다음 200 밀리머의 5 마이크로 리터를 간결하게 추가합니다. 접시를 30분간 배양하여 30센티미터로 설정하고 부드럽게 저어줍니다. 플레이트를 Cytation 5 형광 플레이트 판독기에 적재하고 프로토콜 섹션에 따라 형광 강도를 측정합니다.미토콘드리아 막 무결성은 트리톤 X-100에 의한 막 중단 및 효소 방출 전후에 격리된 미토콘드리아에서MDH 활성을 측정하여 평가하였다. 보시다시피, 우리는 일반적으로 미토콘드리아 제제가 약 93%가 그대로 있다는 것을 발견했습니다. ThT 형광 분석은 아밀로이드 피브릴의 성장을 모니터링하기 위해 수행되었다.3개의 단백질의 아밀로이드 세동을 위한 곡선은 알파-시뉴클레인, 소 인슐린 및 암탉 달걀 흰자수에 대해 각각 약 96, 12 및 96시간의 고원에 도달하는 전형적인 시그로이드 패턴을 보였으며, AFM 측정에 의해 더 확인된 아밀로이드 피브릴의 형성을 시사하였다. 아밀로이드 피브릴에 의한 미토콘드리아 막의 가능한 투과화 및 손상은 미토콘드리아 MDH 및 미토콘드리아 ROS 측정의 방출에 의해 조사되었다. 왼쪽 그래프에서 볼 수 있듯이, 미토콘드리아에 알파-시뉴클레인 아밀로이드 피브릴을 첨가하면 MDH의 실질적인 방출이 관찰되었다.인슐린 피브릴에 의해 약간의 방출이 검출되었지만, 암탉 달걀 흰자 리소지메 피브릴은 효과가 없는 것으로 나타났습니다. 오른쪽 그래프는 미토콘드리아 ROS 함량에 아밀로이드 피브릴의 효과를 보여줍니다. 미토콘드리아 ROS에서 유의한 개선은 암탉 계란 흰자 리소지메 또는 인슐린 아밀로이드 피브릴을 첨가한 후 관찰되었지만, 알파 시뉴클레인 피브릴로 치료하여 뇌 미토콘드리아의 ROS 함량이 현저증가했습니다.본 비디오는 막 수준에서 비골 골체 세포 독성의 메커니즘에 대한 모델 연구를 설명, 다양한 단백질에서 발생하는 아밀로이드 섬유가 막 손상 및 투과화의 다른 정도를 일으킬 수있는 방법을 보여줍니다. 아밀로이드 피브릴과 그들의 특정 결합 막의 몇몇 주제는 상호 작용하고 막의 불안정하고 후속 동요를 일으키는 원인이 되는 능력을 제공하는 것처럼 보입니다 동안. 이 비디오 후, 당신은 네이티브 형태의 상호 작용을 조사 할 수있을 것입니다, 사전 피브릴라, 다른 펩티드의 성숙한 아밀로이드 섬유와 다른 조직이나 뇌의 다양한 영역에서 분리 미토콘드리아와.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

네이티브, 태그 Huntingtin Exon1 모노 머와 스모 융합 전략을 사용 하 여 소의 생성

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...