Name: interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Forskningsrådet for Institutt for avanserte studier i Basic Sciences (IASBS), Zanjan, Iran.

Alle dyr eksperimenter ble utført i samsvar med institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Medical Sciences i Teheran universitetet. Maksimal innsats ble gjort for å minimere lidelse og skadelige effekter på rottene ved å skjerpe giljotinen kniver og bruke bestemt og raske bevegelser av bladet.
1. Brain homogenisering og mitokondrie isolasjon
Merk: alle reagenser for mitokondrie isolasjon ble klargjort i henhold til Sims og Anderson1...

<ol>
	<li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amyloidosis.">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li><li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Link&#246;ping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).</li><li>Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation,+ion+channel+formation,+and+membrane+damage.">Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage.</a> Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).</li><li>Demuro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dysregulation+and+membrane+disruption+as+a+ubiquitous+neurotoxic+mechanism+of+soluble+amyloid+oligomers.">Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).</li><li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+lipid+bilayers+is+a+common+conformation-dependent+activity+of+soluble+amyloid+oligomers+in+protein+misfolding+diseases.">Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).</li><li>Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+oxidative+phosphorylation+genes+in+patients+with+Alzheimer's+disease:+implications+for+early+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+damage.">Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage.</a> Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).</li><li>Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+alterations+in+Parkinson's+disease:+new+clues.">Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues.</a> Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+peptide+channels.">Amyloid peptide channels.</a> The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).</li><li>Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease:+amyloid+pores+from+pathogenic+mutations.">Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations.</a> Nature. 418, 291 (2002).</li><li>Sims, N. R., Anderson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+rat+brain+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation.</a> Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).</li><li>Ghobeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+A&#946;+(25-35)+Fibrillation+Products+with+Mitochondria:+Effect+of+Small-Molecule+Natural+Products.">Interaction of A&#946; (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products.</a> Peptide Science. 102, 473-486 (2014).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).</li><li>Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+some+enzymatic+properties+of+the+inner+and+outer+membrane+of+rat+liver+mitochondria.">Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).</li><li>Hoyer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+a-Synuclein+Aggregate+Morphology+on+Solution+Conditions.">Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).</li><li>Weinreb, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP,+a+protein+implicated+in+Alzheimer's+disease+and+learning,+is+natively+unfolded.">NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded.</a> Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).</li><li>Porter, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+chromatography+of+insulin+and+other+proteins.">Partition chromatography of insulin and other proteins.</a> The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).</li><li>Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+competition+between+renaturation+and+aggregation+during+the+refolding+of+denatured+reduced+egg+white+lysozyme.">A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme.</a> Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).</li><li>Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+isolated+rat+hepatocytes+and+liver+mitochondria:+studies+using+myxothiazol.">Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).</li><li>Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+integrity+and+amyloid+cytotoxicity:+a+model+study+involving+mitochondria+and+lysozyme+fibrillation+products.">Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products.</a> Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).</li><li>Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+silibinin+on+insulin+amyloid+fibrillation,+cytotoxicity+and+mitochondrial+membrane+damage.">Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).</li><li>Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aggregation+and+fibrillation+of+alpha-synuclein.">The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein.</a> Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).</li><li>Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+the+membrane+interaction+of+FYVE+domains.">Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains.</a> Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).</li><li>Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+&#945;-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core.">Lipid bilayer disruption by oligomeric &#945;-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li><li>Kourie, J. I., Henry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+formation+and+membrane-linked+pathologies+of+misfolded+hydrophobic+proteins:+the+role+of+dangerous+unchaperoned+molecules.">Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 29, 741-753 (2002).</li><li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases.">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li><li>Bolognesi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANS+binding+reveals+common+features+of+cytotoxic+amyloid+species.">ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species.</a> ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).</li><li>Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles:+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content.">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li><li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers:+possible+mechanism+of+action.">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li><li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein.">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li><li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains.">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li><li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+&#945;-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson's+disease-role+of+cardiolipin.">Interaction of &#945;-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1.">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li></ol>

Et vell av eksperimentelle resultater støtter hypotesen om at cytotoksisitet av fibrillær aggregater er betydelig assosiert med deres evne til å samhandle med og permeabilize biologiske membraner4,5. Men de fleste av dataene er basert på kunstige lipid bilayers som ikke nødvendigvis reflekterer de iboende egenskapene til biologiske membraner, som er heterogene strukturer med et bredt utvalg av fosfolipider og proteiner. Her, ved hjelp av hjernen mitokondrier...

Amyloid-relaterte lidelser, kjent som amyloidoses, utgjør en stor gruppe sykdommer definert ved utseendet av uløselig protein avleiringer i ulike vev og organer1,2. Blant dem, nevrodegenerative lidelser er de hyppigst formene der protein aggregater vises i den sentrale eller perifere nervesystemet2. Selv om en rekke mekanismer har blitt foreslått å være involvert i toksisitet av amyloid aggregater3, en økende mengde bevis peker til celle membran avbrudd og permeabilization som den primære mekanismen for amyloid patologi4, fempå. I tillegg til plasma membran, kan indre organeller (dvs. mitokondrier) også bli påvirket.
Interessant, tyder nye bevis på at mitokondrie dysfunksjon spiller en avgjørende rolle i patogenesen av nevrodegenerative lidelser, inkludert Alzheimers og Parkinsons sykdommer6,7. I samsvar med dette problemet har mange rapporter indikert binding og akkumulering av amyloid β-peptid, α-synuclein, Huntingtin og ALS-tilknyttede mutant SOD1 proteiner til mitokondrier8,9,10, 11. mekanismen av membran permeabilization av amyloid aggregater antas å forekomme enten gjennom dannelse av diskrete kanaler (porer) og/eller gjennom en uspesifisert vaskemiddel-lignende mekanisme5,12, 13 i år. Det er bemerkelsesverdig at de fleste av disse konklusjonene har vært basert på rapporter som involverer fosfolipid modellsystemer, og studier direkte rettet mot hendelser som forekommer i biologiske membraner er sjeldne. Åpenbart, disse kunstige lipid bilayers ikke nødvendigvis gjenspeiler de iboende egenskapene til biologiske membraner, inkludert de av mitokondrier, som er heterogene strukturer og sammensatt av et bredt utvalg av fosfolipider og proteiner.
I denne studien, mitokondrier isolert fra rotte hjerner brukes som en in vitro biologisk modell for å undersøke de destruktive virkningene av amyloid fibrils som følge av α-synuclein (som en amyloidogenic protein), storfe insulin (som en modell peptid viser betydelig strukturell homologi med humant insulin involvert i injeksjon-lokaliserte amyloidose), og høne eggehvite lysozyme (HEWL; som en felles modell protein for studie av amyloid aggregering). Interaksjoner og mulige skader av mitokondrie membraner indusert av amyloid fibrils blir deretter undersøkt ved å observere utgivelsen av mitokondrie Malate dehydrogenase (MDH) (ligger i mitokondrie matrise) og mitokondrier reaktive oksygen arter (ROS) ekstrautstyr.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1012171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Clear-bottomed 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA essentially fatty acid-free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (cut off 2 KDa)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Potter Elvehjem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Cary Eclipse VARIAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Made in Iran</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme (HEWL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CS0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sodium tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>analytik jena</td>
			<td>SPEKOL 2000 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1076871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1082191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils

En økende mengde bevis indikerer at membran permeabilization, inkludert interne membraner som mitokondrier, er en vanlig funksjon og primær mekanisme av amyloid aggregat-indusert toksisitet i nevrodegenerative sykdommer. Men de fleste rapporter som beskriver mekanismene for membran avbrudd er basert på fosfolipid modellsystemer, og studier direkte målretting hendelser forekommende på nivået av biologiske membraner er sjeldne. Beskrevet her er en modell for å studere mekanismene for amyloid toksisitet på membran nivå. For mitokondrie isolasjon brukes tetthet gradient medium for å oppnå forberedelser med minimal myelin forurensning. Etter mitokondrie membran integritet bekreftelse, er samspillet av amyloid fibrils som følge av α-synuclein, storfe insulin, og høne eggehvite lysozyme (HEWL) med rotte hjernen mitokondrier, som en in vitro biologisk modell, er undersøkt. Resultatene viser at behandling av hjernen mitokondrier med fibrillær forsamlinger kan føre til ulike grader av membran permeabilization og ROS innhold ekstrautstyr. Dette indikerer struktur avhengige interaksjoner mellom amyloid fibrils og mitokondrie membran. Det er antydet at Biofysiske egenskaper av amyloid fibrils og deres spesifikke binding til mitokondrie membraner kan gi forklaringer for noen av disse observasjonene.

Protokollen beskriver en modell for å studere interaksjoner av amyloid fibril med rotte hjernen mitokondrier som en in vitro biologiske modell. For mitokondrie forberedelser, 15% (v/v) tetthet gradient medium ble brukt til å fjerne myelin som stor forurensning av hjernevevet14. Som vist i figur 1a, sentrifugering på 30 700 x g produserte to forskjellige band av materiale, myelin (som hovedkomponenten i band 1) og band ...

Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Forutsatt her er en protokoll for å undersøke samspillet mellom innfødte form, prefibrillar, og modne amyloid fibrils av ulike peptider og proteiner med mitokondrier isolert fra ulike vev og ulike områder av hjernen.

Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

I denne videoen beskriver vi en modellstudie for mekanismen for amyloid toksisitet på membrannivå ved hjelp av rottehjernemokondrier som en in vitro biologisk modell. Til tross for akkumulerende rapport som beskriver mekanismen for membranperturbasjoner ved amyloid aggregert i fosfolipidmodellsystemer studert direkte rettet mot hendelsene som begynner å utvikle biologisk membran. I den nåværende videoen beskriver vi amyloid fibriller av alfa-synuclein som analyserer rottehjernens mitokondrimembran som en in vitro biologisk modell.Vi tror at mitokondrier som organelle med velemitterte membraner kan gi et ekstremt nyttig biologisk modellsystem for molekylære studier knyttet til mekanismen for amyloid cytotoksisitet på membrannivå knyttet til nevrodegenerative sykdommer. Decapitate rotten med en liten dyr giljotin og fjern hjernen fra skalaen innen ett minutt etter halshugging av rotten for å begrense mulig forverring av mitokondrieegenskaper. Det er viktig å jobbe raskt og holde alt på is gjennom hele prosedyren.Vask vevet to ganger med 30 milliliter isolasjonsbuffer. Overfør til et beger som inneholder kald isolasjonsbuffer og fin hakke hjernen med saks. Overfør vevssuspensjonen til en 20 milliliter kald dounce homogenisator.Homogeniser vevsbitene ved hjelp av ni opp og ned slag med en motorisert pestle. La blandingen stå på is i ca. 30 sekunder etter hvert sett med tre homogeniseringsstrøk for å sikre at homogenatet forblir kaldt. Overfør homogenatet til et forkjølet sentrifugerør og sentrifuge ved 1300 G ved fire Centigrade i tre minutter.Dekanter forsiktig overnatanten og overfør det til et forkjølet sentrifugerør. Sentrifuge ved 21.000 G ved fire Centigrade i 10 minutter. Kast den overnaturlige og resuspend pellet i en tetthet gradient medium ved å forsiktig røre blandingen med pipetten.Sentrifuge i en fast vinkelrotor ved 30, 700 G ved fire Centigrade i fem minutter. Bruk en Pasteur pipette, fjern den skarpe enden av materialet akkumulert på toppen, som for det meste inneholder myelin. Tilsett åtte milliliter isolasjonsbuffer til mitokondriefraksjonen mens du forsiktig rører blandingen med pipetten.Sentrifuge ved 16, 700 G ved fire Centigrade i 10 minutter. Fjern forsiktig supernatanten, slik at bunnen løsnet pellet uforstyrret. Tilsett ett milliliter 10 mg per milliliter fettfri BSA til sentrifugerøret mens du forsiktig rører blandingen med tuppen av pipetten.Gjør opp volumet til fem milliliter ved å legge til isolasjonsbuffer. Sentrifuge ved 6, 900 G ved fire Centigrade i 10 minutter. Dette bør produsere en fast pellet.Dekanter den overnaturlige og forsiktig resuspend mitokondriepellet i isolasjonsbuffer. Fortynn mitokondriehomogenat til ett milligram per milliliter med kald isolasjonsbuffer og legg i to 1,5 milliliter rør, vanligvis 195 mikroliter mitokondrier per rør. Tilsett fem mikroliter 20 % volum per volum Triton X-100 til ett rør som positiv kontroll for maksimal enzymaktivitet og fem mikroliter deionisert vann til et annet rør for kontroll, etterfulgt av blanding med en rører.Inkuber rørene i 10 minutter i varmt vann bad satt til 30 Centigrade. Pellet mitokondrier ved sentrifugering av rør i en fast vinkelrotor ved 16.000 G fire Centigrade i 15 minutter. Samle nøye opp resulterende supernativa for å vurdere aktiviteten til mitokondriemalthydrogenase ved hjelp av en standard spektrofotometrisk analyse som er beskrevet på neste del.Beregn integriteten til mitokondriemembranen som følger. For bestemmelse av malatedehydrogenaseaktivitet, pipette 890 og 880 mikroliter 50 millimolar Tris-HCL buffer til blank og prøve test cuvettes henholdsvis etterfulgt av 100 mikroliter 50 millimolar oksaloacetat og 10 mikroliter på 10 millimolar beta-NADH. Sett cuvettes i et spektrofotometer og referanse mot blank.Tilsett 10 mikroliter mitokondriehomogenat ett mg per milliliter for å prøve cuvette. Bland umiddelbart ved inversjon. Rekordreduksjon i absorbans på grunn av NADH-oksidasjon ved 340 nanometer i ett minutt.For alfa-synuclein amyloid fibrillasjon, tilsett 294 mikroliter proteinoppløsning, 200 mikromolar til hver 1,5 milliliter rør. Tilsett deretter seks mikroliter ThT-oppløsning en millimolar. Bland løsningene og inkuber rørene i en termomikser ved 37 Centigrad under konstant omrøring ved 800 O/min.For storfe insulin amyloidflimmer, tilsett 637 mikroliter proteinoppløsning, 250 mikromos til 1,5 milliliter rør. Tilsett deretter 13 mikroliter ThT-oppløsning en millimolar etterfulgt av omrøring. Tilsett aliquots 200 mikroliter proteinløsninger til hver brønn av en klar bunn 96-brønnsplate.Forsegle platen med krystallklar tetningstape. Legg platen i Cytation 5 fluorescens plateleser. Mål ThT-fluorescens med 30-minutters intervaller i 12 timer.Bruk eksitasjon ved 440 nanometer og utslipp ved 485 nanometer. Velg brønnene. Rist platen i fem sekunder før hver måling.Still inn temperaturen ved 57 Centigrade uten agitasjon. Forbered to serier med 1,5 milliliter rør som inneholder mitokondriehomogenater, én serie for MDH-utgivelsesanalyse og andre for mitokondrie-ROS-måling. Tilsett aliquots av friske eller amyloid fibriller av alfa-synuclein, storfe insulin eller høne eggehvite lysozyme til mitokondrie homogenat etterfulgt av forsiktig pipettering.Inkuber rør som inneholder mitokondriesuspensjoner i 30 minutter i varmt vann bad satt til 30 Celsius. For malate dehydrogenase release analyse, sentrifuge inkubated mitokondrie homogenater ved 16,000 G i 15 minutter. Samle nøye inn resulterende supernativa for å analysere aktiviteten til mitokondrie MDH som beskrevet i protokolldelen del fire.Beregn utgivelsen av MDH som følger. For mitokondrie-ROS-måling er pipette 191 mikroliter inkubert mitokondriehomogenat til hver brønn av en 96-brønns plate. Tilsett fire mikroliter på 50 mikromos DCFDA.Deretter legger du til fem mikroliter på 200 millimolar succinate. Inkuber platen i 30 minutter i varmt vann bad satt til 30 Celsius mens forsiktig omrøring. Legg platen i en Cytation 5 fluorescens plateleser og måle fluorescens intensitet i henhold til protokolldelen.Mitokondriemembranintegriteten ble vurdert ved å måle MDH-aktivitet i de isolerte mitokondriene før og etter membranavbrudd og enzymutgivelse av Triton X-100. Som du ser, fant vi vanligvis at mitokondriepreparater er ca 93%intakt. ThT fluorescens analyse ble utført for å overvåke veksten av amyloid fibriller.Kurven for amyloidflimmer av tre proteiner viste et typisk sigmoidmønster, og nådde til et platå på henholdsvis ca. 96, 12 og 96 timer for alfasynuclein, storfeinsulin og høneeggehvite lysozym, noe som tyder på dannelse av amyloid fibriller som ble mer bekreftet av AFM-måling. Mulig permeabilisering og skade på mitokondriemembran av amyloid fibriller ble undersøkt ved frigjøring av mitokondrie MDH og mitokondrie ROS måling. Som du ser i venstre graf, ble betydelig frigjøring av MDH observert ved tilsetning av alfa-synuclein amyloid fibriller til mitokondrier.Mens en liten frigjøring ble oppdaget av insulin fibriller, ble hønseeggehvite lysozymfibriller funnet å være ineffektive. Høyre graf viser effekten av amyloid fibriller på mitokondrie ROS innhold. Selv om ingen signifikant forbedring i mitokondrie-ROS ble observert ved tilsetning av høneeggehvite lysozym eller insulin amyloid fibriller, førte behandling med alfa-synuclein fibriller til en betydelig økning i ROS-innholdet i hjerne mitokondrier.Den nåværende videoen beskriver en modellstudie for mekanismen for fibula aggregert cytotoksisitet på membrannivå, som viser hvordan amyloid fibriller som oppstår fra ulike proteiner kan forårsake forskjellige grader av membranskade og permeabilisering. Mens noen emner av amyloid fibriller og deres spesifikke bindende membran synes å gi kapasitet til å samhandle med og forårsake destabilisering og påfølgende perturbasjoner av membraner. Etter denne videoen vil du kunne undersøke samspillet mellom innfødt form, pre-fibrillar og modne amyloid fibriller av forskjellige peptider og med mitokondrier isolert fra forskjellige vev eller ulike områder av hjernen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode for å visualisere og analysere Membran samspill proteiner av transmisjonselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

En Tailored HPLC rensing protokoll som gir høy renhet amyloid beta 42 og amyloid beta 40 peptider, i stand til oligomerdannelsen

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid vev beiset med selvlysende konjugert Oligothiophenes av hyperspektral AC Confocal mikroskopi og fluorescens levetid bildebehandling

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering gjenkjenning av LRRK2 aktivitet SDS-side med en fosfat-bindende kode

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning av vaskemiddel-sensitive interaksjoner mellom membran proteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Bruk av to-dimensjonale semi denaturing vaskemiddel Agarose Gel geleelektroforese å bekrefte størrelse heterogenitet av Amyloid eller Amyloid-lignende fiber

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Generasjon av innfødte, ukodede Huntingtin Exon1 Monomer og Fibrils bruker en SUMO Fusion strategi

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning av små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjelp av membran fraksjoneres og GTPase-koblede Immunosorbent analysen

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...