Name: interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Научно-исследовательского совета Института перспективных исследований в области фундаментальных наук (IASBS), Занджан, Иран.

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) медицинских наук Тегеранского университета. Максимальные усилия были предприняты, чтобы свести к минимуму страдания и пагубные последствия для крыс путем...

<ol>
	<li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amyloidosis.">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li><li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Link&#246;ping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).</li><li>Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation,+ion+channel+formation,+and+membrane+damage.">Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage.</a> Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).</li><li>Demuro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dysregulation+and+membrane+disruption+as+a+ubiquitous+neurotoxic+mechanism+of+soluble+amyloid+oligomers.">Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).</li><li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+lipid+bilayers+is+a+common+conformation-dependent+activity+of+soluble+amyloid+oligomers+in+protein+misfolding+diseases.">Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).</li><li>Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+oxidative+phosphorylation+genes+in+patients+with+Alzheimer's+disease:+implications+for+early+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+damage.">Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage.</a> Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).</li><li>Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+alterations+in+Parkinson's+disease:+new+clues.">Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues.</a> Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+peptide+channels.">Amyloid peptide channels.</a> The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).</li><li>Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease:+amyloid+pores+from+pathogenic+mutations.">Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations.</a> Nature. 418, 291 (2002).</li><li>Sims, N. R., Anderson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+rat+brain+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation.</a> Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).</li><li>Ghobeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+A&#946;+(25-35)+Fibrillation+Products+with+Mitochondria:+Effect+of+Small-Molecule+Natural+Products.">Interaction of A&#946; (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products.</a> Peptide Science. 102, 473-486 (2014).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).</li><li>Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+some+enzymatic+properties+of+the+inner+and+outer+membrane+of+rat+liver+mitochondria.">Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).</li><li>Hoyer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+a-Synuclein+Aggregate+Morphology+on+Solution+Conditions.">Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).</li><li>Weinreb, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP,+a+protein+implicated+in+Alzheimer's+disease+and+learning,+is+natively+unfolded.">NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded.</a> Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).</li><li>Porter, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+chromatography+of+insulin+and+other+proteins.">Partition chromatography of insulin and other proteins.</a> The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).</li><li>Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+competition+between+renaturation+and+aggregation+during+the+refolding+of+denatured+reduced+egg+white+lysozyme.">A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme.</a> Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).</li><li>Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+isolated+rat+hepatocytes+and+liver+mitochondria:+studies+using+myxothiazol.">Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).</li><li>Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+integrity+and+amyloid+cytotoxicity:+a+model+study+involving+mitochondria+and+lysozyme+fibrillation+products.">Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products.</a> Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).</li><li>Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+silibinin+on+insulin+amyloid+fibrillation,+cytotoxicity+and+mitochondrial+membrane+damage.">Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).</li><li>Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aggregation+and+fibrillation+of+alpha-synuclein.">The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein.</a> Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).</li><li>Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+the+membrane+interaction+of+FYVE+domains.">Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains.</a> Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).</li><li>Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+&#945;-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core.">Lipid bilayer disruption by oligomeric &#945;-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li><li>Kourie, J. I., Henry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+formation+and+membrane-linked+pathologies+of+misfolded+hydrophobic+proteins:+the+role+of+dangerous+unchaperoned+molecules.">Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 29, 741-753 (2002).</li><li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases.">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li><li>Bolognesi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANS+binding+reveals+common+features+of+cytotoxic+amyloid+species.">ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species.</a> ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).</li><li>Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles:+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content.">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li><li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers:+possible+mechanism+of+action.">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li><li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein.">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li><li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains.">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li><li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+&#945;-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson's+disease-role+of+cardiolipin.">Interaction of &#945;-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1.">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li></ol>

Богатство экспериментальных результатов подтверждает гипотезу о том, что цитотоксичность фибриллярных агрегатов в значительной степени связана с их способностью взаимодействовать и пронизать биологические мембраны4,5. Однако большая часть данных осн?...

Амилоидные расстройства, известные как амилоидозы, представляют собой большую группу заболеваний, определяемых появлением нерастворимых белковых отложений в различных тканях и органах1,2. Среди них нейродегенеративные расстройства являются наиболее часто встречаются формы, при которых белковые агрегаты появляются в центральной или периферической нервной системе2. Хотя ряд механизмов были предложены, чтобы участвовать в токсичности амилоидных агрегатов3, растущее количество доказательств указывает на нарушение клеточной мембраны и пермяки в качестве основного механизма амилоидной патологии4, 5. В дополнение к плазменной мембране, внутренние органеллы (т.е. митохондрии) также могут быть затронуты.
Интересно, что новые данные свидетельствуют о том, что митохондриальная дисфункция играет важную роль в патогенеза нейродегенеративных расстройств, в том числе болезни Альцгеймера и Паркинсона6,7. В соответствии с этим вопросом, многочисленные доклады указали связывание и накопление амилоида й-пептида, з-синуклеина, Хантингтина и связанных с ALS мутантов SOD1 белков митохондрии8,9,10, 11. Механизм мембранной пермяки амилоидных агрегатов, как полагают, происходит либо через образование дискретных каналов (пор) и/или через неспецифический моющее средство, как механизм5,12, 13. Следует отметить, что большинство из этих выводов были основаны на докладах с использованием фосфолипидных модельных систем, и исследования, непосредственно ориентированные на события, происходящие в биологических мембранах, редки. Очевидно, что эти искусственные липидные двуслойки не обязательно отражают внутренние свойства биологических мембран, в том числе митохондрий, которые являются неоднородными структурами и состоят из широкого спектра фосфолипидов и белков.
В настоящем исследовании, митохондрии, изолированные от мозга крыс используются в качестве биологической модели in vitro для изучения разрушительных эффектов амилоидных фибриллов, возникающих из-синуклеина (как амилоидогенный белок), инсулин абилоидогенных (в качестве модели пептида, показывающего значительные структурные гомологии с человеческим инсулином, участвующих в инъекционно-локализованных амилоидоз), и курица яичный белок лизозим (HEWL; как общий тип белка для изучения амилоидной агрегации). Взаимодействия и возможное повреждение митохондриальных мембран, индуцированных амилоидными фибриллами, затем исследуются, наблюдая за выбросом митохондриального малиата дегидрогеназы (MDH) (расположен в митохондриальной матрице) и митохондрий реактивного кислорода видов (ROS) повышение.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1012171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Clear-bottomed 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA essentially fatty acid-free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (cut off 2 KDa)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Potter Elvehjem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Cary Eclipse VARIAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Made in Iran</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme (HEWL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CS0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sodium tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>analytik jena</td>
			<td>SPEKOL 2000 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1076871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1082191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils

Растущее количество доказательств указывает на то, что мембранная пермяковая, включая внутренние мембраны, такие как митохондрии, является общей чертой и основным механизмом амилоидной агрегированной токсичности при нейродегенеративных заболеваниях. Однако большинство отчетов, описывающих механизмы нарушения мембран, основаны на фосфолипидных модельных системах, и исследования, непосредственно нацеленные на события, происходящие на уровне биологических мембран, редки. Описана здесь модель для изучения механизмов токсичности амилоидов на мембранном уровне. Для митохондриальной изоляции, градиентная среда плотности используется для получения препаратов с минимальным загрязнением миелина. После подтверждения целостности митохондриальной мембраны, взаимодействие амилоидных фибриллов, возникающих из-за з-синуклеина, бычьего инсулина и куриного яичного белка лизозима (HEWL) с митохондриями мозга крысы, как биологическая модель in vitro, исследуется. Результаты показывают, что лечение митохондрий мозга с фибриллярными сборками может вызвать различные степени проницаемости мембраны и повышения содержания ROS. Это указывает на структурно-зависимые взаимодействия между амилоидными фибрилями и митохондриальной мембраной. Предполагается, что биофизические свойства амилоидных фибрилков и их специфические связывания с митохондриальными мембранами могут служить объяснением некоторых из этих наблюдений.

Протокол описывает модель для изучения взаимодействия амилоидной фибриль с митохондриями мозга крыскаки в качестве биологической модели in vitro. Для митохондриальной подготовки, 15% (v/v) плотность градиента среды был использован для удаления миелина в качестве основного загрязнения ткан...

Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Здесь предусмотрен протокол для исследования взаимодействия между родной формой, префибриллярными и зрелыми амилоидными фибриллями различных пептидов и белков с митохондриями, изолированными из различных тканей и различных областей мозга.

Взаимодействие с и Мембрана Пермябилизация митохондрий мозга амилоида Фибрилс

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

В этом видео мы описываем модель исследования механизма токсичности амилоидов на мембранном уровне с использованием митохондрий мозга крыс в качестве биологической модели in vitro. Несмотря на накопление отчета, описывающего механизм мембранных возмущений амилоидным агрегатом в системах фосфолипидных моделей, изученных непосредственно напрямую, нацеленных на события, начинающиеся с развития биологической мембраны. В настоящем видео мы описываем амилоидные фибриллы альфа-синуклеина, анализирующие мембрану митохондрий мозга крысы, как биологическую модель in vitro.Мы считаем, что митохондрии как органеллы с хорошо охарактеризованными мембранами могут обеспечить чрезвычайно полезную биологическую модельную систему для молекулярных исследований, связанных с механизмом амилоидной цитотоксичности на мембранном уровне, связанной с нейродегенеративными заболеваниями. Обезглавить крысу с небольшой гильотиной животных и удалить мозг из шкалы в течение одной минуты после обезглавливания крысы, чтобы ограничить возможное ухудшение митохондриальных свойств. Важно работать быстро и держать все на льду на протяжении всей процедуры.Вымойте ткань дважды с 30 миллилитров буфера изоляции. Передача в стакан, содержащий холодный буфер изоляции и мелко фарш мозга с ножницами. Перенесите подвеску ткани на 20 миллилитров холодного гомогенизатора dounce.Гомогенизировать части ткани с помощью девяти вверх и вниз ударов с моторизованным пестиком. Оставьте смесь на льду примерно на 30 секунд после каждого набора из трех ударов гомогенизации, чтобы гомогенат остается холодным. Перенесите гомогенат в предварительно охлажденную центрифугу и центрифугу при 1300 Г в течение трех минут.Тщательно decant supernatant и передать его в предварительно охлажденной центрифуги трубки. Центрифуга при 21 000 Г в четыре по Цельсию в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелейте гранулы в градиентной среде плотности, аккуратно помешивая смесь пипеткой.Центрифуга в роторе с фиксированным углом на 30, 700 G в четыре по Цельсию в течение пяти минут. Используя пипетки Pasteur, удалите острый конец материала, накопленного в верхней части, которые в основном содержат миелин. Добавьте восьмимилитрный буфер изоляции к митохондриальной фракции, аккуратно перемешивая смесь с пипеткой.Центрифуга в 16, 700 G в четыре по Цельсию в течение 10 минут. Аккуратно удалите супернатант, оставляя дно рыхлой гранулы нетронутыми. Добавьте один миллилитр 10 миллиграмм на миллилитр жирных кислот, свободных BSA в центрифугу трубки, осторожно помешивая смесь с кончиком пипетки.Составить объем до пяти миллилитров, добавив буфер изоляции. Центрифуга при 6 900 Г в четыре по Цельсию в течение 10 минут. Это должно производить твердые гранулы.Декант supernatant и мягко повторного перерасхода митохондриальных гранул в буфер изоляции. Разбавить митохондриальный гомогенат до одного миллиграмма на миллилитр с холодным буфером изоляции и поместить в две 1,5 миллилитровые трубки, как правило, 195 микролитр митохондрий на трубку. Добавьте пять микролитров 20% объема Triton X-100 в одну трубку в качестве положительного контроля для максимальной активности ферментов и пять микролитров деионизированной воды в другую трубку для контроля, а затем смешивание с мешалка.Инкубировать трубки в течение 10 минут в теплой водяной бане установить до 30 Centigrade. Пеллет митохондрии путем центрифугации труб в роторе с фиксированным углом в 16 000 Г четыре по Цельсию в течение 15 минут. Тщательно соберите полученные супернатанты для оценки активности митохондриальной дегидрогеназы малата с помощью стандартного спектрофотометрического анализа, описанного на следующей части.Рассчитайте целостность митохондриальной мембраны следующим образом. Для определения активности малата дегидрогеназы, пипетка 890 и 880 микролитр 50 миллимолярный буфер Tris-HCL для пустого и образцового теста кюветы соответственно следуют 100 микролитр 50 миллимолярный оксалоацетат и 10 микролитр 10 миллимолярной бета-NADH. Положите кюветы в спектрофотометр и ссылки против пустой.Добавьте 10 микролитров митохондриального гомогената по миллиграмму на миллилитр, чтобы попробовать кюветт. Немедленно смешайте с помощью инверсии. Рекордное снижение абсорбции из-за окисления NADH на 340 нанометров в течение одной минуты.Для мерцательной аритмии альфа-синуклеина добавьте 294 микролитра белкового раствора, 200 микромолеров в каждую 1,5 миллилитровую трубку. Затем добавьте шесть микролитров ThT раствора один миллимолярный. Смешайте растворы и инкубировать трубки в термомиксер при 37 Centigrade под постоянным перемешиванием при 800 об/мин.Для фибрилляции инсулина из крупного рогатого скота добавьте 637 микролитров белкового раствора, 250 микромоляров в 1,5 миллилитровую трубку. Затем добавьте 13 микролитров ThT раствор один миллимолярный с последующим перемешиванием. Добавьте aliquots 200 микролитров белковых растворов к каждой колодец ясной нижней 96-хорошо пластины.Печать пластины с кристально чистой лентой уплотнения. Загрузите пластину в считыватель пластин Cytation 5 флуоресценции. Измерьте флуоресценцию ThT с 30-минутными интервалами в течение 12 часов.Используйте возбуждение на 440 нанометров и выбросы на 485 нанометров. Выберите колодцы. Встряхните пластину в течение пяти секунд перед каждым измерением.Установите температуру на уровне 57 градусов без агитации. Подготовь две серии из 1,5 миллилитровых трубок, содержащих митохондриальные гомогенаты, одну серию для анализа выпуска MDH и другую для митохондриальных измерений ROS. Добавьте алициты свежих или амилоидных фибриллятов альфа-синуклеина, бычьего инсулина или куриного яичного белка к митохондриальному гомогенату, за которым последует мягко трубоукалы.Инкубационые трубки, содержащие митохондриальные суспензии в течение 30 минут в теплой водяной бане, устанавливаются до 30 по Цельсию. При анализе выброса малат-дегидрогеназ центрифуги инкубировали митохондриальные гомогенаты при 16 000 Г в течение 15 минут. Тщательно соберите полученные супернатанты для анализа активности митохондриального MDH, как описано в разделе протокола 4.Рассчитайте выпуск MDH следующим образом. Для митохондриального измерения ROS, пипетка 191 микролитер инкубации митохондриального гомогената к каждой колодец 96-хорошо пластины. Добавьте четыре микролитер из 50 микромолейных DCFDA.Затем добавьте пять микролитров 200 миллимолярный сукчинат. Инкубировать тарелку в течение 30 минут в теплой водяной бане установить до 30 Centigrade при осторожном перемешивании. Загрузите пластину в считыватель пластин Cytation 5 и измерьте интенсивность флуоресценции в соответствии с разделом протокола.Целостность митохондриальной мембраны оценивалась путем измерения активности MDH в изолированных митохондриях до и после нарушения мембраны и высвобождения ферментов Triton X-100. Как вы видите, мы обычно обнаружили, что митохондриальные препараты около 93%intact. ThT флуоресценция анализ был проведен для мониторинга роста амилоидных фибрилляций.Кривая для амилоидной фибрилляции трех белков показала типичный сигмоидный узор, достигнув плато примерно в 96, 12 и 96 часов для альфа-синуклеина, бычьего инсулина и лизозима куриного яичного белка соответственно, что свидетельствует о образовании амилоидных фибрилляций, что было более подтверждено измерением AFM. Возможная проницаемая и повреждение митохондриальной мембраны амилоидными фибриллями была исследована путем высвобождения митохондриального MDH и митохондриального измерения ROS. Как вы видите на левом графике, существенное высвобождение MDH наблюдалось при добавлении альфа-синуклеиновых амибриллоидов в митохондрии.В то время как небольшой релиз был обнаружен инсулин фибрилляции, куриное яйцо белый лизозим фибриллы были признаны неэффективными. Правый график показывает влияние амилоидных фибрилляций на митохондриальное содержание ROS. Хотя никакого значительного улучшения митохондриального ROS не наблюдалось при добавлении лизозима куриного яичного белка или инсулина амилоидных фибрилляций, лечение фибрилляциями альфа-синуклеина привело к значительному увеличению содержания ROS в митохондриях мозга.Настоящее видео описывает модельное исследование механизма фибулы совокупной цитотоксиситности на мембранном уровне, демонстрируя, как амилоидные фибриллы, возникающие из различных белков, могут вызвать разную степень повреждения мембраны и проницаемости. В то время как некоторые темы амилоидных фибрилляций и их специфической связывающей мембраны, как представляется, обеспечивают способность взаимодействовать с и вызывать дестабилизацию и последующие возмущения мембран. После этого видео, вы сможете исследовать взаимодействие родной формы, до фибриллярия, и зрелые амилоидные фибриллы различных пептидов и с митохондриями изолированы от различных тканей или различных областях мозга.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Метод визуализации и анализа Мембранные белков, взаимодействующих с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Очищением протокол заказуНаша ВЭЖХ, который дает высокой чистоты бета-амилоида 42 и бета-амилоида 40 Пептиды, способные олигомеров формирования

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging амилоида тканей витражи с светящиеся конъюгированных Oligothiophenes путем использования гиперспектральных конфокальная микроскопия и флуоресценции жизни изображений

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Обнаружение моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранные белки

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Использование двух мерных полу денатурируя стирального геля агарозы подтвердить размер неоднородность волокон амилоида или амилоид как

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Поколения родной, расставленными гентингтина Exon1 мономера и фибрилл, используя стратегию Fusion сумо

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Обнаружение малых ГТФазы Prenylation и GTP привязки с помощью мембраны фракционирования и ГТФазы-Assay иммуносорбента

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...