Name: interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación del Instituto de Estudios Avanzados en Ciencias Básicas (IASBS), Zanjan, Irán.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Ciencias Médicas de la Universidad de Teherán. Se realizaron esfuerzos máximos para minimizar el sufrimiento y los efectos perjudiciales para las ratas afilando las cuchillas de guillotina y aplicando movimientos resueltas y rápidos de la hoja.
1. Homogeneización cerebral y aislamiento mitocondrial
NOTA: Todos los reactivos para el ais...

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	<li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amyloidosis.">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li><li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Link&#246;ping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).</li><li>Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation,+ion+channel+formation,+and+membrane+damage.">Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage.</a> Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).</li><li>Demuro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dysregulation+and+membrane+disruption+as+a+ubiquitous+neurotoxic+mechanism+of+soluble+amyloid+oligomers.">Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).</li><li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+lipid+bilayers+is+a+common+conformation-dependent+activity+of+soluble+amyloid+oligomers+in+protein+misfolding+diseases.">Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).</li><li>Manczak, M., Park, B. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+peptide+channels.">Amyloid peptide channels.</a> The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).</li><li>Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease:+amyloid+pores+from+pathogenic+mutations.">Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations.</a> Nature. 418, 291 (2002).</li><li>Sims, N. R., Anderson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+rat+brain+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation.</a> Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).</li><li>Ghobeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+A&#946;+(25-35)+Fibrillation+Products+with+Mitochondria:+Effect+of+Small-Molecule+Natural+Products.">Interaction of A&#946; (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products.</a> Peptide Science. 102, 473-486 (2014).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).</li><li>Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+some+enzymatic+properties+of+the+inner+and+outer+membrane+of+rat+liver+mitochondria.">Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).</li><li>Hoyer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+a-Synuclein+Aggregate+Morphology+on+Solution+Conditions.">Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).</li><li>Weinreb, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP,+a+protein+implicated+in+Alzheimer's+disease+and+learning,+is+natively+unfolded.">NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded.</a> Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).</li><li>Porter, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+chromatography+of+insulin+and+other+proteins.">Partition chromatography of insulin and other proteins.</a> The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).</li><li>Goldberg, M. 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A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+integrity+and+amyloid+cytotoxicity:+a+model+study+involving+mitochondria+and+lysozyme+fibrillation+products.">Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products.</a> Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).</li><li>Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+silibinin+on+insulin+amyloid+fibrillation,+cytotoxicity+and+mitochondrial+membrane+damage.">Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).</li><li>Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aggregation+and+fibrillation+of+alpha-synuclein.">The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein.</a> Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).</li><li>Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+the+membrane+interaction+of+FYVE+domains.">Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains.</a> Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).</li><li>Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+&#945;-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core.">Lipid bilayer disruption by oligomeric &#945;-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li><li>Kourie, J. I., Henry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+formation+and+membrane-linked+pathologies+of+misfolded+hydrophobic+proteins:+the+role+of+dangerous+unchaperoned+molecules.">Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 29, 741-753 (2002).</li><li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases.">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li><li>Bolognesi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANS+binding+reveals+common+features+of+cytotoxic+amyloid+species.">ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species.</a> ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).</li><li>Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles:+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content.">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li><li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers:+possible+mechanism+of+action.">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li><li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein.">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li><li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains.">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li><li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+&#945;-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson's+disease-role+of+cardiolipin.">Interaction of &#945;-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1.">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li></ol>

Una gran cantidad de resultados experimentales apoya la hipótesis de que la citotoxicidad de los agregados fibrilares se asocia significativamente con su capacidad para interactuar y permeabilizar las membranas biológicas4,5. Sin embargo, la mayoría de los datos se basan en bicapas de lípidos artificiales que no reflejan necesariamente las propiedades intrínsecas de las membranas biológicas, que son estructuras heterogéneas con una amplia variedad de fosfo...

Los trastornos relacionados con el amiloide, conocidos como amiloidosis, constituyen un gran grupo de enfermedades definidas por la aparición de depósitos de proteínas insolubles en diferentes tejidos y órganos1,2. Entre ellos, los trastornos neurodegenerativos son las formas más frecuentes en las que aparecen agregados proteicos en el sistema nervioso central o periférico2. Aunque se ha propuesto que una serie de mecanismos participen en la toxicidad de los agregados amiloide3 , un creciente cuerpo de evidencia apunta a la alteración de la membrana celular y la permeabilización como el mecanismo primario de la patología amiloide4, 5. Además de la membrana plasmática, los orgánulos internos (es decir, las mitocondrias) también pueden verse afectados.
Curiosamente, la evidencia emergente sugiere que la disfunción mitocondrial juega un papel crítico en la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y Parkinson6,7. De acuerdo con este número, numerosos informes han indicado la unión y acumulación de amiloides-péptido, sinucleína, Huntingtin, y proteínas MUTANTes SOD1 vinculadas a ELA a las mitocondrias8,9,10, 11. Se cree que el mecanismo de permeabilización de la membrana por agregados amiloide ocurre ya sea a través de la formación de canales discretos (poros) y/o a través de un mecanismo no específico similar al detergente5,12, 13. Cabe destacar que la mayoría de estas conclusiones se han basado en informes que involucran sistemas de modelos de fosfolípidos, y los estudios dirigidos directamente a los eventos que ocurren en las membranas biológicas son raros. Claramente, estas bicapas de lípidos artificiales no reflejan necesariamente las propiedades intrínsecas de las membranas biológicas, incluidas las de las mitocondrias, que son estructuras heterogéneas y están compuestas por una amplia variedad de fosfolípidos y proteínas.
En el presente estudio, las mitocondrias aisladas de cerebros de ratas se utilizan como modelo biológico in vitro para examinar los efectos destructivos de las fibrillas amiloideas derivadas de la sinucleína (como proteína amiloidógena), insulina bovina (como un péptido modelo que muestra homología estructural significativa con insulina humana implicada en la amiloidosis localizada por inyección), y lisozima blanca de huevo de gallina (HEWL; como una proteína modelo común para el estudio de la agregación amiloide). Las interacciones y posibles daños de las membranas mitocondriales inducidas por las fibrillas amiloides se investigan observando la liberación de malato mitocondrial deshidrogenasa (MDH) (ubicado en la matriz mitocondrial) y oxígeno reactivo mitocondria (ROS).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1012171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Clear-bottomed 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA essentially fatty acid-free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (cut off 2 KDa)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Potter Elvehjem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Cary Eclipse VARIAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Made in Iran</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme (HEWL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CS0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sodium tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>analytik jena</td>
			<td>SPEKOL 2000 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1076871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1082191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils

Un creciente cuerpo de evidencia indica que la permeabilización de la membrana, incluyendo membranas internas como las mitocondrias, es una característica común y el mecanismo primario de toxicidad inducida por agregadoa amiloide en enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, la mayoría de los informes que describen los mecanismos de interrupción de la membrana se basan en sistemas de modelos de fosfolípidos, y los estudios dirigidos directamente a los eventos que ocurren a nivel de membranas biológicas son raros. Descrito aquí es un modelo para estudiar los mecanismos de toxicidad amiloide a nivel de membrana. Para el aislamiento mitocondrial, el medio de gradiente de densidad se utiliza para obtener preparaciones con una contaminación mínima de la mielina. Después de la confirmación de la integridad de la integridad de la membrana mitocondrial, se investiga la interacción de las fibrillas amiloide derivadas de la sinucleína, la insulina bovina y el lysozima blanca de huevo de hien (HEWL) con las mitocondrias cerebrales de rata, como modelo biológico in vitro. Los resultados demuestran que el tratamiento de las mitocondrias cerebrales con conjuntos fibrilares puede causar diferentes grados de permeabilización de la membrana y mejora del contenido de ROS. Esto indica interacciones dependientes de la estructura entre las fibrillas amiloideas y la membrana mitocondrial. Se sugiere que las propiedades biofísicas de las fibrillas amiloideas y su unión específica a las membranas mitocondriales pueden proporcionar explicaciones para algunas de estas observaciones.

El protocolo describe un modelo para estudiar las interacciones de la fibrilla amiloide con las mitocondrias cerebrales de rata como un modelo biológico in vitro. Para la preparación mitocondrial, se utilizó un medio de gradiente de densidad del 15% (v/v) para eliminar la mielina como contaminación importante del tejido cerebral14. Como se muestra en la Figura 1A,la centrifugación a 30.700 x g produjo dos bandas distintas de material, la mielina <span st...

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Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Aquí se proporciona un protocolo para investigar las interacciones entre la forma nativa, las fibrillas prefibrilares y las fibrillas amiloideas maduras de diferentes péptidos y proteínas con mitocondrias aisladas de diferentes tejidos y diversas áreas del cerebro.

Interacciones con y la permeabilización de membrana de las mitocondrias cerebrales por Amiloide Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

En este video, describimos un estudio modelo para el mecanismo de toxicidad amiloide a nivel de membrana utilizando mitocondrias cerebrales de rata como un modelo biológico in vitro. A pesar de acumular un informe que describe el mecanismo de perturbaciones de membrana por agregado amiloide en sistemas modelo de fosfolípidos estudiados directamente dirigidos a los eventos que comienzan en el desarrollo de la membrana biológica. En el presente video, describimos fibrillas amiloide de alfa-sinucleína analizando la membrana de las mitocondrias cerebrales de rata como un modelo biológico in vitro.Creemos que las mitocondrias como orgánulo con membranas bien caracterizadas pueden proporcionar un sistema de modelos biológicos extremadamente útil para estudios moleculares relacionados con el mecanismo de citotoxicidad amiloide a nivel de membrana relacionada con enfermedades neurodegenerativas. Decapitar a la rata con una pequeña guillotina animal y eliminar el cerebro de la escala dentro de un minuto de la decapitación de la rata para limitar el posible deterioro de las propiedades mitocondriales. Es importante trabajar rápidamente y mantener todo sobre hielo durante todo el procedimiento.Lave el tejido dos veces con 30 mililitros de tampón de aislamiento. Transfiera a un vaso de precipitados que contenga un amortiguador de aislamiento frío y picar finamente el cerebro con tijeras. Transfiera la suspensión tisular a un homogeneizador de douncia fría de 20 mililitros.Homogeneizar las piezas de tejido usando nueve golpes hacia arriba y hacia abajo con un pestillo motorizado. Dejar la mezcla sobre hielo durante aproximadamente 30 segundos después de cada conjunto de tres golpes de homogeneización para asegurar que el homogeneización permanezca frío. Transfiera el homogeneato a un tubo centrífuga preenfriado y centrífuga a 1.300 G a cuatro centígrados durante tres minutos.Decantar cuidadosamente el sobrenadante y transferirlo a un tubo de centrífuga pre-refrigerado. Centrífuga a 21.000 G a cuatro centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspúle el pellet en un medio de gradiente de densidad agitando suavemente la mezcla con la pipeta.Centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 30, 700 G a cuatro centígrados durante cinco minutos. Con una pipeta Pasteur, retire el extremo afilado del material acumulado en la parte superior, que en su mayoría contiene mielina. Agregue el tampón de aislamiento de ocho mililitros a la fracción mitocondrial mientras remueve suavemente la mezcla con la pipeta.Centrífuga a 16.700 G a cuatro centígrados durante 10 minutos. Retire con cuidado el sobrenadante, dejando el pellet suelto de fondo sin perturbar. Añadir un mililitro 10 miligramos por mililitro de BSA sin ácidos grasos al tubo centrífugo mientras remueve suavemente la mezcla con la punta de la pipeta.Ine a la base del volumen a cinco mililitros agregando búfer de aislamiento. Centrífuga a 6.900 G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Esto debería producir un pellet firme.Decantar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet mitocondrial en tampón de aislamiento. Diluir el homogeneato mitocondrial a un miligramo por mililitro con tampón de aislamiento frío y colocar en dos tubos de 1,5 mililitros, típicamente 195 microlitro de mitocondrias por tubo. Añadir cinco microlitrotro 20% de volumen por volumen Triton X-100 a un tubo como control positivo para la máxima actividad enzimática y cinco microlitor desionizado de agua a otro tubo para su control, seguido de la mezcla con un agitador.Incubar los tubos durante 10 minutos en un baño de agua tibia a 30 grados centígrados. Mitocondrias de pellet por centrifugación de tubos en un rotor de ángulo fijo a 16.000 G cuatro centígrados durante 15 minutos. Recoja cuidadosamente los sobrenadantes resultantes para evaluar la actividad del malato deshidrogenasa mitocondrial utilizando un ensayo espectrofotométrico estándar descrito en la siguiente parte.Calcule la integridad de la membrana mitocondrial de la siguiente manera. Para la determinación de la actividad de malato deshidrogenasa, pipetea 890 y 880 microlitros 50 mililolar Tris-HCL tampón a las cubetas de prueba en blanco y de muestra respectivamente seguidas de 100 microlitro 50 mililolares oxaloacetato y 10 microlitro de beta-NADH 10 milimétricas. Coloque las cubetas en un espectrofotómetro y haga referencia contra el espacio en blanco.Añadir 10 microliter homogeneización mitocondrial un miligramo por mililitro para muestrear la cubeta. Mezclar inmediatamente por inversión. Registre la disminución de la absorbancia debido a la oxidación de NADH a 340 nanómetros durante un minuto.Para la fibrilación amiloide alfa-sinucleína, agregue 294 microlitro de solución proteica, 200 micromolares a cada tubo de 1,5 mililitros. A continuación, agregue seis microlitr ThT solución un milimolar. Mezclar las soluciones e incubar los tubos en un termomezclador a 37 centígrados bajo agitación constante a 800 RPM.Para la fibrilación amiloides de insulina bovina, agregue 637 microlitro de solución proteica, 250 micromolares a 1,5 mililitros de tubo. A continuación, añadir 13 microlitr ThT solución un milimolar seguido de agitación. Añadir alícuotas 200 microlitros de soluciones proteicas a cada pozo de una placa inferior clara de 96 pozos.Selle la placa con cinta adhesiva cristalina. Cargue la placa en el lector de placas de fluorescencia Cytation 5. Mida la fluorescencia ThT a intervalos de 30 minutos durante 12 horas.Utilice la excitación a 440 nanómetros y la emisión a 485 nanómetros. Seleccione los pozos. Agitar la placa durante cinco segundos antes de cada medición.Ajuste la temperatura a 57 centígrados sin agitación. Preparar dos series de tubos de 1,5 mililitros que contengan homogeneados mitocondriales, una serie para ensayo de liberación de MDH y otra para la medición de ROS mitocondrial. Añadir alícuotas de fibrillas frescas o amiloideas de alfa-sinucleína, insulina bovina o lysozyme de huevo de gallina al homogenerato mitocondrial seguido de pipeteo suave.Incubar tubos que contengan suspensiones mitocondriales durante 30 minutos en baño de agua tibia establecido en 30 grados centígrados. Para el ensayo de liberación de malato deshidrogenasa, centrífugo incubado homogeneizas mitocondriales a 16.000 G durante 15 minutos. Recoja cuidadosamente los sobrenadantes resultantes para el ensayo de la actividad de la MDH mitocondrial como se describe en la sección de protocolo parte cuatro.Calcule la liberación de MDH de la siguiente manera. Para la medición de ROS mitocondrial, pipeta 191 microlitro de homogeneato mitocondrial incubado a cada pozo de una placa de 96 pozos. Añadir cuatro microlitrotro de 50 micromolares DCFDA.A continuación, agregue cinco microlitros de succinato milimolar. Incubar el plato durante 30 minutos en un baño de agua tibia en 30 centígrados mientras se remueve suavemente. Cargue la placa en un lector de placas de fluorescencia Cytation 5 y mida la intensidad de la fluorescencia de acuerdo con la sección de protocolo.La integridad de la membrana mitocondrial se evaluó midiendo la actividad de MDH en las mitocondrias aisladas antes y después de la interrupción de la membrana y la liberación de enzimas por Triton X-100. Como puede ver, típicamente encontramos que las preparaciones mitocondriales están alrededor del 93% intactas. Se llevó a cabo un ensayo de fluorescencia thT para monitorear el crecimiento de las fibrillas amiloideas.La curva para la fibrilación amiloide de tres proteínas mostró un patrón sigmoidal típico, llegando a una meseta en aproximadamente 96, 12, y 96 horas para alfa-sinucleína, insulina bovina y lysozime de huevo de gallina respectivamente, lo que sugiere la formación de fibrillas amiloideas que fue más confirmada por la medición de AFM. La posible permeabilización y daño de la membrana mitocondrial por fibrillas amiloideas se investigó mediante la liberación de MDH mitocondrial y medición de ROS mitocondrial. Como se ve en el gráfico izquierdo, se observó una liberación sustancial de MDH tras la adición de las fibrillas amiloideas alfa-sinoucleína a las mitocondrias.Mientras que una ligera liberación fue detectada por insulina fibrillas, se encontró que las fibrillas de lysozyme de clara de huevo de gallina eran ineficaces. El gráfico derecho muestra el efecto de las fibrillas amiloideas en el contenido de ROS mitocondrial. Si bien no se observó ninguna mejora significativa en el ROS mitocondrial al agregar la lisozima de la clara de huevo de gallina o las fibrillas amiloideas de insulina, el tratamiento con fibrillas de alfa-sinucleina condujo a un aumento considerable en el contenido de ROS de las mitocondrias cerebrales.El presente vídeo describe un estudio modelo para el mecanismo de la citotoxicidad agregada del peroné a nivel de membrana, que demuestra cómo las fibrillas amiloideas derivadas de diversas proteínas pueden causar diferentes grados de daño de membrana y permeabilización. Mientras que algunos temas de fibrillas amiloideas y su membrana de unión específica parecen proporcionar la capacidad de interactuar con y causar desestabilización y perturbaciones posteriores de las membranas. Después de este video, usted será capaz de investigar la interacción de la forma nativa, pre-fibrilar, y fibrilla amiloide madura de diferentes péptidos y con mitocondrias aisladas de diferentes tejidos o varias áreas del cerebro.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Investigación

Bioquímica

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Un protocolo de purificación HPLC Tailored que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 y 40 péptidos beta amiloide, capaz de Formación de oligómeros

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Uso de dos electroforesis del Gel de la agarosa detergente semi desnaturalización Dimensional para confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o amiloide-como

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Generación de monómero Exon1 huntingtina nativo, sin etiquetar y fibrillas utilizando una estrategia de fusión de SUMO

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...