Name: interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Detta arbete stöddes av stipendier från forskningsrådet vid Institutet för avancerade studier i grundläggande vetenskaper (IASBS), Zanjan, Iran.

Alla djurförsök utfördes i enlighet med den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av medicinska vetenskaper av Teherans universitet. Maximal ansträngning gjordes för att minimera lidande och skadliga effekter till råttorna genom att skärpa giljotinen bladen och tillämpa resoluta och snabba rörelser av bladet.
1. hjärn homogenisering och mitokondriell isolering
Anmärkning: alla reagenser för mitokondriell isolering utarbetades enligt...

<ol>
	<li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amyloidosis.">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li><li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Link&#246;ping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).</li><li>Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation,+ion+channel+formation,+and+membrane+damage.">Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage.</a> Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).</li><li>Demuro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dysregulation+and+membrane+disruption+as+a+ubiquitous+neurotoxic+mechanism+of+soluble+amyloid+oligomers.">Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).</li><li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+lipid+bilayers+is+a+common+conformation-dependent+activity+of+soluble+amyloid+oligomers+in+protein+misfolding+diseases.">Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).</li><li>Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+oxidative+phosphorylation+genes+in+patients+with+Alzheimer's+disease:+implications+for+early+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+damage.">Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage.</a> Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).</li><li>Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+alterations+in+Parkinson's+disease:+new+clues.">Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues.</a> Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+peptide+channels.">Amyloid peptide channels.</a> The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).</li><li>Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease:+amyloid+pores+from+pathogenic+mutations.">Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations.</a> Nature. 418, 291 (2002).</li><li>Sims, N. R., Anderson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+rat+brain+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation.</a> Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).</li><li>Ghobeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+A&#946;+(25-35)+Fibrillation+Products+with+Mitochondria:+Effect+of+Small-Molecule+Natural+Products.">Interaction of A&#946; (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products.</a> Peptide Science. 102, 473-486 (2014).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).</li><li>Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+some+enzymatic+properties+of+the+inner+and+outer+membrane+of+rat+liver+mitochondria.">Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).</li><li>Hoyer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+a-Synuclein+Aggregate+Morphology+on+Solution+Conditions.">Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).</li><li>Weinreb, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP,+a+protein+implicated+in+Alzheimer's+disease+and+learning,+is+natively+unfolded.">NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded.</a> Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).</li><li>Porter, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+chromatography+of+insulin+and+other+proteins.">Partition chromatography of insulin and other proteins.</a> The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).</li><li>Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+competition+between+renaturation+and+aggregation+during+the+refolding+of+denatured+reduced+egg+white+lysozyme.">A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme.</a> Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).</li><li>Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+isolated+rat+hepatocytes+and+liver+mitochondria:+studies+using+myxothiazol.">Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).</li><li>Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+integrity+and+amyloid+cytotoxicity:+a+model+study+involving+mitochondria+and+lysozyme+fibrillation+products.">Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products.</a> Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).</li><li>Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+silibinin+on+insulin+amyloid+fibrillation,+cytotoxicity+and+mitochondrial+membrane+damage.">Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).</li><li>Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aggregation+and+fibrillation+of+alpha-synuclein.">The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein.</a> Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).</li><li>Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+the+membrane+interaction+of+FYVE+domains.">Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains.</a> Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).</li><li>Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+&#945;-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core.">Lipid bilayer disruption by oligomeric &#945;-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li><li>Kourie, J. I., Henry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+formation+and+membrane-linked+pathologies+of+misfolded+hydrophobic+proteins:+the+role+of+dangerous+unchaperoned+molecules.">Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 29, 741-753 (2002).</li><li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases.">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li><li>Bolognesi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANS+binding+reveals+common+features+of+cytotoxic+amyloid+species.">ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species.</a> ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).</li><li>Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles:+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content.">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li><li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers:+possible+mechanism+of+action.">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li><li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein.">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li><li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains.">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li><li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+&#945;-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson's+disease-role+of+cardiolipin.">Interaction of &#945;-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1.">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li></ol>

En mängd experimentella resultat stöder hypotesen att cytotoxiciteten av fibrillar aggregat är signifikant förknippad med deras förmåga att interagera med och permeabilize biologiska membran4,5. Emellertid, de flesta av uppgifterna är baserade på konstgjorda lipidbilayers som inte nödvändigtvis återspeglar de inneboende egenskaperna hos biologiska membran, som är heterogena strukturer med en mängd olika fosfolipider och proteiner. Här, med hjälp av...

Amyloid-relaterade sjukdomar, kallas amyloidoser, utgör en stor grupp av sjukdomar som definieras av uppkomsten av olösliga protein fyndigheter i olika vävnader och organ1,2. Bland dem, neurodegenerativa sjukdomar är de vanligaste formerna där protein aggregat visas i centrala eller perifera nervsystemet2. Även om ett antal mekanismer har föreslagits för att vara inblandade i toxiciteten av amyloid aggregat3, en växande mängd bevis pekar på cellmembran störningar och permeabilisering som den primära mekanismen för amyloid patologi4, 5. Förutom plasmamembran, inre organeller (dvs, mitokona) kan också påverkas.
Intressant, framväxande bevis tyder på att mitokondriell dysfunktion spelar en avgörande roll i patogenesen av neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers och Parkinsons sjukdomar6,7. I enlighet med denna fråga har många rapporter indikerat bindning och ackumulering av amyloid β-peptid, α-Synuclein, huntingtin och ALS-länkade muterade SOD1 proteiner till mitokonen8,9,10, 11. mekanismen för membran permeabilisering av amyloid aggregat tros ske antingen genom bildandet av diskreta kanaler (porer) och/eller genom en icke-specifik tvättmedel-liknande mekanism5,12, 13. Det är anmärkningsvärt att de flesta av dessa slutsatser har baserats på rapporter som involverar fosfolipid modellsystem, och studier som direkt riktar sig till de händelser som förekommer i biologiska membran är sällsynta. Klart, dessa konstgjorda lipidbilayers återspeglar inte nödvändigtvis de inneboende egenskaperna hos biologiska membran, inklusive de av mitokonen, som är heterogena strukturer och består av en mängd olika fosfolipider och proteiner.
I den nuvarande studien används mitokondrien som isolerats från rått hjärnor som en in vitro-biologisk modell för att undersöka de destruktiva effekterna av amyloida fibriller som härrör från α-Synuclein (som ett amyloidogent protein), bovint insulin (som en modell peptid som visar betydande strukturell homologi med humant insulin som deltar i injektion-lokaliserad amyloidos), och hönsägg vit lysozym (HEWL; som en gemensam modell protein för studier av amyloid Aggregation). Interaktioner och eventuell skada på mitokondriella membran som induceras av amyloid fibriller utreds sedan genom att observera frisläppandet av mitokondriell malatdehydrogenas (MDH) (som finns i mitokondriell matris) och mitokondrier reaktivt syre Art (ROS) förbättring.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1012171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Clear-bottomed 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA essentially fatty acid-free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (cut off 2 KDa)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Potter Elvehjem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Cary Eclipse VARIAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Made in Iran</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme (HEWL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CS0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sodium tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>analytik jena</td>
			<td>SPEKOL 2000 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1076871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1082191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils

En växande mängd bevis indikerar att membran permeabilisering, inklusive inre membran såsom mitokona, är ett vanligt inslag och primära mekanismen för amyloid aggregerad-inducerad toxicitet i neurodegenerativa sjukdomar. Emellertid, de flesta rapporter som beskriver mekanismerna för membran störningar är baserade på fosfolipid modellsystem, och studier som direkt riktar sig till händelser som inträffar på nivån av biologiska membran är sällsynta. Beskrivs här är en modell för att studera mekanismerna för amyloid toxicitet på membran nivå. För mitokondriell isolering används densitetsgradientmedium för att få preparat med minimal myelin-kontamination. Efter mitokondriell membran integritet bekräftelse, samspelet mellan amyloid fibriller som härrör från α-Synuclein, nötkreatur insulin, och hönsägg vit lysozym (HEWL) med råtta hjärnan Mitochondria, som en in vitro-biologisk modell, undersöks. Resultaten visar att behandling av hjärnans mitokona med fibrillar församlingar kan orsaka olika grader av membran depolarisering och ros innehålls förbättring. Detta indikerar struktur beroende interaktioner mellan amyloid fibriller och mitokondriellt membran. Det föreslås att de biofysiska egenskaperna hos amyloid fibriller och deras specifika bindning till mitokondriella membran kan ge förklaringar till några av dessa observationer.

I protokollet beskrivs en modell för att studera interaktioner mellan amyloid fibrillens med råtta hjärnan mitokona som en in vitro-biologisk modell. För mitokondriell beredning, 15% (v/v) densitet gradient medium användes för att avlägsna myelin som större förorening av hjärnvävnad14. Som framgår av figur 1aproducerade centrifugering vid 30 700 x g två distinkta band av material, myelin (som huvudkomponent i...

Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Förutsatt här är ett protokoll för att undersöka samspelet mellan Native form, prefibrillar, och mogna amyloid fibriller av olika peptider och proteiner med mitokonskisolerade från olika vävnader och olika områden i hjärnan.

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

I denna video beskriver vi en modellstudie för mekanismen för amyloid toxicitet på membrannivå med hjälp av råtthjärnan mitokondrier som en in vitro biologisk modell. Trots ackumulera rapport som beskriver mekanismen för membran perturbations av amyloid aggregat i fosfolipid modell system studerade direkt inriktning på de händelser som börjar på att utveckla biologiska membran. I den nuvarande videon beskriver vi amyloid fibriller av alfa-synuclein analysera råtta hjärnmitokondrierna membranet som en in vitro biologisk modell.Vi anser att mitokondrierna som en organelle med väl karakteriserade membran kan ge en extremt användbar biologisk modell system för molekylära studier relaterade till mekanismen för amyloid cytotoxicitet på membran nivå som avser neurodegenerativa sjukdomar. Halshugga råttan med en liten djur giljotin och avlägsna hjärnan från vågen inom en minut efter att råttan halshuggit den för att begränsa eventuell försämring av mitokondriella egenskaper. Det är viktigt att arbeta snabbt och hålla allt på is under hela proceduren.Tvätta vävnaden två gånger med 30 milliliter isoleringsbuffert. Överför till en bägare som innehåller kall isoleringsbuffert och finhackar hjärnan med sax. Överför vävnadsupphängningen till en 20 milliliter kall dounce-homogenisator.Homogenisera vävnadsbitarna med nio upp- och nedslag med en motoriserad mortelstöt. Låt blandningen vara på is i cirka 30 sekunder efter varje uppsättning av tre homogeniseringsdrag för att säkerställa att homogenatet förblir kallt. Överför homogenatet till ett förkylt centrifugrör och centrifug vid 1, 300 G vid fyra Centigrade i tre minuter.Dekantera försiktigt supernatanten och överför den till ett förkylt centrifugrör. Centrifugera vid 21, 000 G vid fyra Centigrade i 10 minuter. Kassera supernatanten och resuspend pelleten i ett densitetsgradientmedium genom att försiktigt röra om blandningen med pipetten.Centrifugera i en fast vinkelrotor vid 30, 700 G vid fyra Centigrade i fem minuter. Med hjälp av en Pasteur pipetter, ta bort den skarpa änden av material som samlats upptill, som mestadels innehåller myelin. Tillsätt åtta milliliter isolering buffert till mitokondriellt fraktion samtidigt försiktigt omrörning blandningen med pipetten.Centrifugera vid 16, 700 G vid fyra Centigrade i 10 minuter. Ta försiktigt bort supernatanten och lämna den nedersta lösa pelleten ostörd. Tillsätt en milliliter 10 milligram per milliliter fettsyre-fri BSA till centrifug röret medan försiktigt omrörning blandningen med spetsen av pipetten.Gör upp volymen till fem milliliter genom att lägga till isoleringsbuffert. Centrifugera vid 6, 900 G vid fyra Centigrade i 10 minuter. Detta bör producera en fast pellet.Dekantera supernatanten och försiktigt återanvänd den mitokondriella pelleten i isoleringsbuffert. Späd mitokondriellt homogenate till ett milligram per milliliter med kall isolering buffert och placera i två 1,5 milliliter rör, typiskt 195 mikroliter mitokondrierna per rör. Lägg till fem microliter 20%volym per volym Triton X-100 till ett rör som positiv kontroll för maximal enzymaktivitet och fem mikroliter avjoniserat vatten till ett annat rör för kontroll, följt av blandning med en omrörare.Inkubera rören i 10 minuter i varmt vattenbad inställt på 30 Centigrade. Pellet mitokondrier genom centrifugering av rör i en fast vinkel rotor vid 16, 000 G fyra Centigrade i 15 minuter. Samla noggrant in resulterande supernatanter för bedömning av aktiviteten hos mitokondriellt malat dehydrogenas med hjälp av en standardspektrofotometrisk assay som beskrivs på nästa del.Beräkna integriteten hos mitokondriellt membran enligt följande. För malat dehydrogenas aktivitetsbestämning, pipetter 890 och 880 mikroliter 50 millimolar Tris-HCL buffert till blank- och provprovstest cuvettes respektive följt av 100 mikroliter 50 millimolar oxaloacetate och 10 mikroliter på 10 millimolar beta-NADH. Sätt cuvettes i en spektrofotometer och referens mot blank.Tillsätt 10 mikroliter mitokondriellt homogenate ett milligram per milliliter för att prova cuvette. Blanda omedelbart genom inversion. Registrera minskning av absorbans på grund av NADH-oxidation vid 340 nanometer i en minut.För alfa-synuklein amyloidflimmer, tillsätt 294 mikroliter proteinlösning, 200 mikromolar till varje 1,5 milliliter rör. Tillsätt sedan sex microliter ThT-lösning en millimolar. Blanda lösningarna och inkubera rören i en thermomixer vid 37 Centigrade under konstant omrörning vid 800 RPM.För bovint insulin amyloidflimmer, tillsätt 637 mikroliter proteinlösning, 250 mikromolar till 1,5 milliliterrör. Tillsätt sedan 13 microliter ThT-lösning en millimolar följt av omrörning. Lägg till alikvoter 200 mikroliter av proteinlösningar till varje brunn av en klar botten 96-brunnsplatta.Täta plattan med kristallklar tätningstejp. Ladda plattan i Cytation 5 fluorescensplåtsläsare. Mät ThT-fluorescens med 30-minutersintervall i 12 timmar.Använd excitation vid 440 nanometer och utsläpp vid 485 nanometer. Välj brunnarna. Skaka plattan i fem sekunder före varje mätning.Ställ in temperaturen på 57 Centigrade utan agitation. Förbered två serier av 1,5 milliliterrör som innehåller mitokondriellt homogenat, en serie för MDH-frisättningsanalys och annat för mitokondriell ROS-mätning. Tillsätt alikvoter av färska eller amyloidfibriller av alfa-synuklein, bovint insulin eller höna äggvita lysozym till mitokondriellt homogenat följt av försiktigt pipettering.Inkubera rör som innehåller mitokondriella suspensioner i 30 minuter i varmt vattenbad inställt på 30 Centigrade. För malat dehydrogenase release assay, inkuberade centrifug mitokondriellt homogenater vid 16, 000 G i 15 minuter. Samla försiktigt resulterande supernatants för assaying aktiviteten av mitokondriellt MDH som beskrivs på protokoll avsnitt del fyra.Beräkna utsättningen av MDH enligt följande. För mitokondriell ROS-mätning, pipetter 191 mikroliter av inkuberat mitokondriellt homogenate till varje brunn av en 96-brunnsplatta. Lägg till fyra mikroliter av 50 mikromolar DCFDA.Tillsätt sedan fem mikroliter av 200 millimole succinate. Inkubera plattan i 30 minuter i varmt vattenbad inställt på 30 Centigrade medan du försiktigt rör om. Ladda plattan i en Cytation 5 fluorescensplatta läsare och mäta fluorescens intensitet enligt protokollet avsnitt.Mitokondriellt membran integritet bedömdes genom att mäta MDH verksamhet i den isolerade mitokondrierna före och efter membran störningar och enzym release av Triton X-100. Som ni ser, fann vi typiskt att mitokondriella preparat är ca 93%intakt. ThT fluorescens analys genomfördes för att övervaka tillväxten av amyloid fibriller.Kurvan för amyloid förmak av tre proteiner visade ett typiskt sigmoidalt mönster, når till en platå på ca 96, 12 och 96 timmar för alfa-synuclein, nötkreatur insulin och höna äggvita lysozym respektive, vilket tyder på bildandet av amyloid fibriller som var mer bekräftas av AFM mätning. Möjliga permeabilization och skador av mitokondriellt membran av amyloid fibriller undersöktes genom frisättning av mitokondriellt MDH och mitokondriellt ROS mätning. Som ni ser i den vänstra grafen, observerades betydande frisättning av MDH vid tillägg av alfa-synuclein amyloid fibriller till mitokondrierna.Medan en liten frisättning upptäcktes av insulin fibriller, hen äggvita lysozym fibriller befanns vara ineffektiva. Höger graf visar effekten av amyloid fibriller på mitokondriellt ROS innehåll. Medan ingen signifikant förbättring i mitokondriellt ROS observerades vid tillägg av höna äggvita lysozym eller insulin amyloid fibriller, behandling med alfa-synuklein fibriller ledde till en avsevärd ökning av ROS innehåll av hjärnan mitokondrierna.Den föreliggande videon beskriver en modellstudie för mekanismen för fibula aggregerad cytotoxicitet på membrannivå, som visar hur amyloid fibriller som uppstår från olika proteiner kan orsaka olika grader av membranskador och permeabilisering. Medan vissa ämnen av amyloid fibriller och deras specifika bindande membran verkar ge med kapacitet att interagera med och orsaka destabilisering och efterföljande störningar av membran. Efter denna video, du kommer att kunna undersöka samspelet mellan native form, pre-fibrillar, och mogna amyloid fibriller av olika peptider och med mitokondrier isolerade från olika vävnader eller olika områden i hjärnan.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

En skräddarsydd HPLC reningsprotokoll som ger hög renhet Amyloid Beta 42 och Amyloid Beta 40 Peptider som kan oligomerbildning

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid vävnader färgas med självlysande konjugerade Oligothiophenes av Hyperspektrala Confocal Microscopy och fluorescens livstid Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detektion av LRRK2 aktivitet med SDS-PAGE med en fosfat-bindande tagg

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisande av tvättmedel-känsliga samspelet mellan membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Användning av två dimensionell semi denatureringen tvättmedel agaros Gel Electrophoresis bekräfta storlek heterogenitet av Amyloid eller Amyloid-liknande fibrer

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Generation av infödda, otaggade Huntingtin Exon1 Monomer och fibriller med en SUMO Fusion strategi

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Upptäckt av små GTPase Prenylation och GTP bindande använder membran fraktionering och GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...