Name: interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Bu çalışma, İran'ın Zanjan kentinde ki Temel Bilimler İleri Araştırmalar Enstitüsü Araştırma Konseyi'nin (IASBS) hibeleri ile desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri Tahran Üniversitesi Tıp Bilimleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uyarınca yapılmıştır. Giyotin bıçaklarını keskinleştirerek ve bıçağın kararlı ve hızlı hareketlerini uygulayarak farelere yönelik acı ve zararlı etkileri en aza indirmek için maksimum çaba sarf edildi.
1. Beyin homojenizasyonu ve mitokondriyal izolasyon
NOT: Mitokondriyal izolasyon için tüm reaktifler Sims ve Anderson...

<ol>
	<li>Merlini, G., Bellotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amyloidosis.">Molecular mechanisms of amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).</li><li>Berg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Link&#246;ping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).</li><li>Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation,+ion+channel+formation,+and+membrane+damage.">Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage.</a> Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).</li><li>Demuro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dysregulation+and+membrane+disruption+as+a+ubiquitous+neurotoxic+mechanism+of+soluble+amyloid+oligomers.">Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).</li><li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+lipid+bilayers+is+a+common+conformation-dependent+activity+of+soluble+amyloid+oligomers+in+protein+misfolding+diseases.">Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).</li><li>Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+oxidative+phosphorylation+genes+in+patients+with+Alzheimer's+disease:+implications+for+early+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+damage.">Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage.</a> Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).</li><li>Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+alterations+in+Parkinson's+disease:+new+clues.">Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues.</a> Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+peptide+channels.">Amyloid peptide channels.</a> The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).</li><li>Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease:+amyloid+pores+from+pathogenic+mutations.">Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations.</a> Nature. 418, 291 (2002).</li><li>Sims, N. R., Anderson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+rat+brain+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation.</a> Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).</li><li>Ghobeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+A&#946;+(25-35)+Fibrillation+Products+with+Mitochondria:+Effect+of+Small-Molecule+Natural+Products.">Interaction of A&#946; (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products.</a> Peptide Science. 102, 473-486 (2014).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).</li><li>Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+some+enzymatic+properties+of+the+inner+and+outer+membrane+of+rat+liver+mitochondria.">Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).</li><li>Hoyer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+a-Synuclein+Aggregate+Morphology+on+Solution+Conditions.">Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).</li><li>Weinreb, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP,+a+protein+implicated+in+Alzheimer's+disease+and+learning,+is+natively+unfolded.">NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded.</a> Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).</li><li>Porter, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+chromatography+of+insulin+and+other+proteins.">Partition chromatography of insulin and other proteins.</a> The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).</li><li>Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+competition+between+renaturation+and+aggregation+during+the+refolding+of+denatured+reduced+egg+white+lysozyme.">A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme.</a> Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).</li><li>Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+isolated+rat+hepatocytes+and+liver+mitochondria:+studies+using+myxothiazol.">Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).</li><li>Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+integrity+and+amyloid+cytotoxicity:+a+model+study+involving+mitochondria+and+lysozyme+fibrillation+products.">Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products.</a> Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).</li><li>Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+silibinin+on+insulin+amyloid+fibrillation,+cytotoxicity+and+mitochondrial+membrane+damage.">Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).</li><li>Fink, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aggregation+and+fibrillation+of+alpha-synuclein.">The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein.</a> Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).</li><li>Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+the+membrane+interaction+of+FYVE+domains.">Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains.</a> Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).</li><li>Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+disruption+by+oligomeric+&#945;-synuclein+depends+on+bilayer+charge+and+accessibility+of+the+hydrophobic+core.">Lipid bilayer disruption by oligomeric &#945;-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).</li><li>Kourie, J. I., Henry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+formation+and+membrane-linked+pathologies+of+misfolded+hydrophobic+proteins:+the+role+of+dangerous+unchaperoned+molecules.">Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 29, 741-753 (2002).</li><li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases.">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li><li>Bolognesi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANS+binding+reveals+common+features+of+cytotoxic+amyloid+species.">ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species.</a> ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).</li><li>Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+interactions+with+phospholipid+vesicles:+relationships+with+fusion+and+release+of+aqueous+content.">Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).</li><li>Roqanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+protect+mitochondrial+membrane+against+permeabilization+induced+by+HEWL+oligomers:+possible+mechanism+of+action.">Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).</li><li>Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+micelle-bound+human+alphasynuclein.">Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).</li><li>Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+selectively+binds+to+anionic+phospholipids+embedded+in+liquid-disordered+domains.">Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains.</a> Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).</li><li>Devi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+and+accumulation+of+&#945;-synuclein+impair+complex+I+in+human+dopaminergic+neuronal+cultures+and+Parkinson+disease+brain.">Mitochondrial import and accumulation of &#945;-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).</li><li>Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+&#945;-synuclein+with+biomembranes+in+Parkinson's+disease-role+of+cardiolipin.">Interaction of &#945;-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).</li><li>Petersen, C. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+&#946;-peptide+is+imported+into+mitochondria+via+the+TOM+import+machinery+and+localized+to+mitochondrial+cristae.">The amyloid &#946;-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).</li><li>Costa, V., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+Huntington's+disease.">Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease.</a> EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1.">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li></ol>

Deneysel sonuçlar zenginliği fibriller agregaların sitotoksisitesi önemli ölçüde etkileşim ve biyolojik membranlar 4 permeabilize yetenekleri ile ilişkili olduğu hipotezini destekler4,5. Ancak, verilerin çoğu mutlaka fosfolipidler ve proteinlerin geniş bir yelpazede heterojen yapılar olan biyolojik membranların içsel özelliklerini yansıtmayan yapay lipid iki katmanları dayanmaktadır. Burada beyin mitokondrisi in vitro biyolojik membran olarak ...

Amiloidoz olarak bilinen amiloid ile ilişkili bozukluklar, farklı doku ve organlarda çözünmez protein yataklarının görünümü ile tanımlanan hastalıkların büyük bir grup oluşturmaktadır1,2. Bunlar arasında nörodejeneratif bozukluklar, protein agregalarının merkezi veya periferik sinir sisteminde en sık görülen formlardır2. Amiloid agregalarının toksisitesi dahil olduğu öne sürülse de3, amiloid patolojisinin birincil mekanizması olarak hücre zarının bozulması na ve permeabilizasyonuna işaret eden kanıt ların giderek arttığı bir vücut4, 5. Plazma zarına ek olarak, iç organeller (yani, mitokondri) de etkilenebilir.
İlginçtir, ortaya çıkan kanıtlar mitokondriyal disfonksiyon nörodejeneratif bozuklukların patogenezinde kritik bir rol oynadığını göstermektedir, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları da dahil olmak üzere6,7. Bu soruna uygun olarak, çok sayıda rapor bağlanma ve amiloid β-peptid birikimi göstermiştir, α-sinüklein, Huntingtin, ve ALS bağlı mutant SOD1 proteinleri mitokondri8,9,10, 11. Amiloid agregalar tarafından membran permeabilizasyon mekanizması ya ayrık kanalların oluşumu ile meydana geldiği düşünülmektedir (gözenekleri) ve / veya nonspesifik bir deterjan benzeri mekanizma ile5,12, 13. yıl. Bu sonuçların çoğunun fosfolipid model sistemlerini içeren raporlara dayandığı ve biyolojik membranlarda meydana gelen olayları doğrudan hedef alan çalışmaların nadir olduğu dikkat çekicidir. Açıkçası, Bu yapay lipid iki katmanları mutlaka biyolojik membranların içsel özelliklerini yansıtmaz, mitokondri olanlar da dahil olmak üzere, heterojen yapılar ve fosfolipidler ve proteinlerin geniş bir yelpazede oluşan.
Bu çalışmada, sıçan beyinlerinden izole edilen mitokondri, α-sinükleinden kaynaklanan amiloid fibrillerin (amiloidojenik protein olarak), sığır insülininin (bir model peptid olarak gösteren bir model peptid olarak) yıkıcı etkilerini incelemek için in vitro biyolojik bir model olarak kullanılmaktadır. enjeksiyon lokalize amiloidoz dahil insan insülin ile önemli yapısal homoloji), ve tavuk yumurtası beyaz lysozyme (HEWL; amiloid agregasyon çalışması için ortak bir model protein olarak). Amiloid fibriller tarafından indüklenen mitokondriyal membranların etkileşimleri ve olası hasarı mitokondriyal magenaz (MDH) (mitokondriyal matrikste bulunan) ve mitokondri reaktif oksijen salınımı gözlemleyerek araştırılır. türler (ROS) geliştirme.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1012171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Clear-bottomed 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA essentially fatty acid-free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (cut off 2 KDa)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Potter Elvehjem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrophotometer</td>
			<td>Cary Eclipse VARIAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Made in Iran</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme (HEWL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CS0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sodium tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>217255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>analytik jena</td>
			<td>SPEKOL 2000 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1076871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1082191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>QUELAB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactions with and membrane permeabilization of brain mitochondria by amyloid fibrils

Kanıt büyüyen bir vücut membran permeabilizasyon gösterir, mitokondri gibi iç membranlar da dahil olmak üzere, nörodejeneratif hastalıklarda amiloid agrega kaynaklı toksisite ortak bir özellik ve birincil mekanizma. Ancak, membran bozulma mekanizmaları açıklayan raporların çoğu fosfolipid model sistemlerine dayanmaktadır ve biyolojik membranlar düzeyinde meydana gelen olayları doğrudan hedefleyen çalışmalar nadirdir. Burada açıklanan membran düzeyinde amiloid toksisite mekanizmaları incelemek için bir modeldir. Mitokondriyal izolasyon için, yoğunluk gradyan ortamı minimal miyelin kontaminasyonu ile preparatlar elde etmek için kullanılır. Mitokondriyal membran bütünlüğü doğruladıktan sonra α-sinüklein, büyükbaş insülin ve tavuk yumurtası aknüksü (HEWL) ile sıçan beyni mitokondrisinden kaynaklanan amiloid fibrillerin in vitro biyolojik model olarak etkileşimi araştırılır. Sonuçlar fibriller meclisleri ile beyin mitokondri tedavisi membran permeabilizasyon ve ROS içerik geliştirme farklı derecelerde neden olabileceğini göstermektedir. Bu amiloid fibriller ve mitokondriyal membran arasındaki yapıya bağlı etkileşimleri gösterir. Amiloid fibrillerin biyofiziksel özellikleri nin ve mitokondriyal membranlara özel bağlanmasının bu gözlemlerin bazılarına açıklama getirebileceği ileri sürülebilir.

Protokol bir in vitro biyolojik model olarak sıçan beyin mitokondri ile amiloid fibril etkileşimleri incelenmesi için bir model açıklar. Mitokondriyal preparat için beyin dokusunun majör kontaminasyonu olarak miyelini çıkarmak için %15 (v/v) yoğunluk gradyan ortamı kullanılmıştır14. Şekil 1A'dagösterildiği gibi, 30.700 x g'daki santrifüj, zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyoniçeren miyelin (bant</span...

Watch this Scientific Journal Video about Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils at JoVE.com

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Burada verilen farklı dokulardan ve beynin çeşitli bölgelerinden izole mitokondri ile farklı peptidler ve proteinlerin yerli formu, prefibrillar ve olgun amiloid fibrils arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Bu videoda, in vitro biyolojik model olarak sıçan beyin mitokondrisi kullanarak membran düzeyinde amiloid toksisite mekanizması için bir model çalışma açıklayınız. Fosfolipid model sistemlerinde amiloid agrega ile membran pertürbasyonlarının mekanizmasını açıklayan rapor birikimine rağmen, biyolojik membran geliştirmeye başlayan olayları doğrudan hedef alan çalışmalar. Bu videoda, alfa-sinüklein amiloid fibriller bir in vitro biyolojik model olarak sıçan beyin mitokondri membran analiz açıklar.İyi karakterize membranlara sahip bir organel olarak mitokondrinin, nörodejeneratif hastalıklara bağlı membran düzeyinde amiloid sitotoksisite mekanizması ile ilgili moleküler çalışmalar için son derece yararlı bir biyolojik model sistemi sağlayabileceğine inanıyoruz. Küçük bir hayvan giyotin ile sıçan decapitate ve mitokondriyal özellikleriolası bozulmayı sınırlamak için sıçan ın decapitation bir dakika içinde ölçekten beyin kaldırmak. Bu hızlı bir şekilde çalışmak ve prosedür boyunca buz üzerinde her şeyi tutmak önemlidir.30 mililitre izolasyon tamponu ile dokuyu iki kez yıkayın. Soğuk izolasyon tamponu içeren bir kabın aktarımı ve ince makas ile beyin kıyma. Doku süspansiyonu 20 mililitrelik soğuk bir homogenizer aktarın.Motorlu bir pestisit ile dokuz yukarı ve aşağı vuruş kullanarak doku parçalarını homojenize. Homojenin soğuk kalmasını sağlamak için karışımı üç homojenizasyon vuruşundan sonra yaklaşık 30 saniye buzüzerinde bırakın. Homojeni önceden soğutulmuş bir santrifüj tüpüne ve santrifüje 1, 300 G'da dört santigrat derecede üç dakika aktarın.Dikkatle supernatant decant ve önceden soğutulmuş santrifüj tüpü aktarın. Santrifüj 21, 000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika. Supernatant atın ve yavaşça pipet ile karışımı karıştırarak bir yoğunluk gradyan ortamda pelet resuspend.Sabit açı rotorunda santrifüj 30, 700 G dört santigrat derecede beş dakika. Pasteur pipeti kullanarak, çoğunlukla miyelin içeren üstte biriken malzemenin keskin ucunu çıkarın. Mitokondriyal fraksiyona sekiz mililitre likit izolasyon tamponu eklerken, pipetle karışımı hafifçe karıştırın.Santrifüj 16, 700 G dört santigrat derecede 10 dakika. Dikkatle supernatant çıkarın, alt gevşek pelet rahatsız bırakarak. Hafifçe pipet ucu ile karışımı karıştırArak tüp centrifuge tüp mililitre yağ asidi içermeyen BSA başına bir mililitre 10 miligram ekleyin.İzolasyon arabelleği ekleyerek hacmi beş mililitreye kadar yapın. Santrifüj 6, 900 G dört santigrat derecede 10 dakika. Bu sağlam bir pelet üretmek gerekir.Supernatant decant ve yavaşça izolasyon tampon içinde mitokondriyal pelet resuspend. Soğuk izolasyon tamponu ile mililitre başına bir miligrama kadar seyreltilmiş mitokondriyal homojenve iki 1,5 mililitrelik tüpler, genellikle tüp başına mitokondri mikrolitre yer. Maksimum enzim aktivitesi için pozitif kontrol olarak bir tüpe triton X-100 başına beş mikrolitre %20 hacim ve kontrol için başka bir tüpe beş mikrolitre deiyonize su ekleyin ve ardından bir karıştırıcı ile karıştırın.Tüpleri 30 santigrat dereceye ayarlanmış ılık su banyosunda 10 dakika kuluçkaya yatırın. 16 sabit açı rotor tüplerin santrifüj tarafından Pelet mitokondri 15 dakika için 16, 000 G dört Santigrat. Bir sonraki bölümde açıklanan standart bir spektrofotometrik test kullanarak mitokondriyal malate dehidrogenaz aktivitesini değerlendirmek için elde edilen süpernatantları dikkatlice toplayın.Mitokondriyal membranın bütünlüğünü aşağıdaki gibi hesaplayın. Malate dehidrogenaz aktivitesi tayini için, pipet 890 ve 880 mikrolitre 50 milimolar Tris-HCL tampon boş ve örnek test cuvettes sırasıyla 100 mikrolitre 50 milimolar okaloasetat ve 10 milimolar beta-NADH 10 mikrolitre izledi. Bir spektrofotometre ve referans boş karşı cuvettes koyun.Örnek cuvette için mililitre başına 10 mikrolitre mitokondriyal homojen ekleyin. Hemen ters tarafından karıştırın. Bir dakika için 340 nanometre DE NADH oksidasyonu nedeniyle absorbans rekor azalma.Alfa-sinüklein amiloid fibrilasyon için, protein çözeltisi 294 mikrolitre ekleyin, her 1.5 mililitre tüp 200 mikromolar. Sonra altı mikrolitre ThT çözeltisi bir milimolar ekleyin. Çözeltileri karıştırın ve tüpleri 37 Santigrat'ta bir termomikte 800 RPM'de sürekli karıştırarak kuluçkaya yatırın.Sığır insülin amiloid fibrilasyon için, protein çözeltisi 637 mikrolitre, 1.5 mililitre tüp 250 mikromolar ekleyin. Sonra karıştırma takip 13 mikrolitre ThT çözeltisi bir milimolar ekleyin. Net bir alt 96-iyi plaka her kuyuya protein çözeltileri aliquots 200 mikrolitre ekleyin.Plakayı kristal berraklığında sızdırmazlık bandı ile kapatın. Plakayı Cytation 5 floresan plaka okuyucusuna yükleyin. ThT floresanını 12 saat boyunca 30 dakikalık aralıklarla ölçün.440 nanometrede uyarma ve 485 nanometrede emisyon kullanın. Kuyuları seçin. Her ölçümden önce plakayı beş saniye sallayın.Sıcaklığı ajitasyon olmadan 57 santigrat dereceye ayarlayın. Mitokondriyal homojenler içeren 1,5 mililitrelik tüpler, MDH salınım tayı için bir seri ve mitokondriyal ROS ölçümü için diğer iki seri hazırlayın. Alfa-sinüklein taze veya amiloid fibrils aliquots ekleyin, sığır insülin veya tavuk yumurtası beyaz lysozyme mitokondriyal homojenate ve ardından yavaşça pipetleme.30 Santigrat dereceye ayarlanmış ılık su banyosunda 30 dakika boyunca mitokondriyal süspansiyonlar içeren tüp. Malate dehidrogenaz salınım ıskalaması için santrifüj 16,000 G'de 15 dakika kuluçkaya yatırılan mitokondriyal homojendir. Protokol bölüm dört açıklanan mitokondriyal MDH etkinliğini atamak için elde edilen supernatants dikkatle toplamak.MDH'nin serbest bırakılmasını aşağıdaki gibi hesaplayın. Mitokondriyal ROS ölçümü için, pipet 191 mikrolitre inkübir mitokondriyal 96 kuyulu bir plakanın her kuyusu için homojendir. 50 mikromolar DCFDA dört mikrolitre ekleyin.Sonra 200 milimolar sinkin beş mikrolitre ekleyin. Hafifçe karıştırarak 30 Santigrat ayarlayın ılık su banyosunda 30 dakika boyunca plaka kuluçka. Plakayı Bir Cytation 5 floresan plaka okuyucusuna yükleyin ve protokol bölümüne göre floresan yoğunluğunu ölçün.Triton X-100 ile membran bozulması ve enzim salınımından önce ve sonra izole mitokondride MDH aktivitesi ölçülerek mitokondriyal membran bütünlüğü değerlendirildi. Gördüğünüz gibi, mitokondriyal preparatların %93 civarında sağlam olduğunu gördük. ThT floresan tsay amiloid fibrils büyümesini izlemek için yapılmıştır.Üç proteinin amiloid fibrilasyon eğrisi tipik bir sigmoidal desen gösterdi, alfa-synüklein için yaklaşık 96 ulaşan, 12, ve 96 alfa-synüklein için saat, sığır insülin, ve tavuk yumurtası beyaz lysozyme sırasıyla, AFM ölçümü ile doğrulandı amiloid fibrils oluşumunu düşündüren. Mitokondriyal membranın amiloid fibriller tarafından olası permeabilizasyonu ve hasarı mitokondriyal MDH ve mitokondriyal ROS ölçümü ile araştırıldı. Sol grafikte de gördüğünüz gibi, mitokondriye alfa-sinüklein amiloid fibrillerin eklenmesiyle MDH'nin önemli ölçüde salınımı gözlenmiştir.İnsülin fibriller tarafından hafif bir salınım saptanırken, tavuk yumurtası beyaz lysozyme fibrils etkisiz bulundu. Sağ grafik, amiloid fibrillerin mitokondriyal ROS içeriği üzerindeki etkisini göstermektedir. Tavuk yumurtası beyaz lysozyme veya insülin amiloid fibrillerin eklenmesi yle mitokondriyal ROS'ta önemli bir gelişme gözlenmezken, alfa-sinüklein fibrilleri ile tedavi beyin mitokondrisinin ROS içeriğinde önemli bir artışa yol açtı.Bu video, çeşitli proteinlerden kaynaklanan amiloid fibrillerin farklı derecelerde membran hasarına ve permeabilizasyona nasıl yol açabileceğini gösteren, membran düzeyinde fibula agrega sitotoksisite mekanizması için bir model çalışma açıklar. Amiloid fibriller ve spesifik bağlayıcı membran bazı konular ile etkileşim ve membranların bozulma ve sonraki tedirginliklere neden kapasitesi sağlamak için görünür iken. Bu videodan sonra, farklı dokulardan veya beynin çeşitli bölgelerinden izole edilmiş mitokondri ile doğal form, pre-fibrillar ve farklı peptidlerin olgun amiloid fibrils etkileşimini araştırmak mümkün olacak.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Amiloid doku Imaging ile Işıksaçan konjuge Oligothiophenes Hyperspectral tarafından Confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu görüntüleme lekeli

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Yerli, etiketsiz Huntingtin Exon1 Monomer ve SUMO Fusion strateji kullanarak liflerinde nesil

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...