Name: preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents
Uploaded: 2020-01-31T12:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة-R01DK106964 وP20DK123971 منح لجورجي ف. بيتكوف. يشكر المؤلفان الدكتور فيكتور ياروتسكي والسيدة سارة ماكسويل على التقييم النقدي للمخطوطة. ونحن ممتنون أيضا لجراحي المسالك البولية في MUSC وUTHSC: الدكتورتوماس كين، هاري كلارك، ستيفن سافاج، روس رامز، سانديب براساد، جوناثان بيكارد، كريستوفر ليدبيتر، وأنتوني باترسون، فضلا عن MUSC والمقيمين في المسالك البولية UTHSC: الدكتور تايلور فوغان، صامويل ووكر نكلز، ماثيو يونغ، إيرين بيرنز، جاستن إليت، ريان ليفي، أوستن يونغر، مارك كورين، نيما باراداران، أولوغميسولا ماكوي، تريسي تيبتون، برايس وايت، أليسا غريمان، سارة ستاروستا، آرون بلوخ، كريستين كالاواي، لوسيل كوكس، كريستيان ديوان، إيرين هيتمان، برادلي هيوستن، ستيفن ليغ، روبرت ليبي، كول لوكلير، كريستين مارلي، مونيكا أوهانلون، باتريك بروبست، سينثيا شارالدين، إليزابيث تورفيل، دانيال زاباتا لمساعدتهم في جمع الأنسجة البشرية.

تشكل خلايا العضلة الملساء (DSM) الأكثر وفرة في المثانة وتتحكم في نهاية المطاف في تخزين البول وإبطاله من خلال الاسترخاء والانكماش ، على التوالي. تشكل خلايا DSM حزم العضلات الملساء التي تتشابك مع الأنسجة الضامة المجاورة والعمليات العصبية والخلايا الخلالية وأنواع الخلايا الأخرى1. وقد تحقق الفهم الحالي لدور خلايا DSM في وظيفة المثانة البولية من خلال نهج متكامل متعدد المستويات. كل طريقة تجريبية - سواء كانت تستند إلى خلايا مفردة معزولة في المختبر ، وشرائط الأنسجة التي تحتوي على حزم العضلات الملساء في المختبر / الجسم الحي السابق ، أو في تحديدات الجسم الحي (مثل قياس الخلايا وتقييمات وظيفة الإبطال) - توفر رؤى مهمة ومحددة في الخصائص الفسيولوجية والدوائية لـ DSM (يرجى الاطلاع على المراجعات1،2،3،4، 6للحصول على التفاصيل). ومع ذلك، فإن تفسير النتائج التي تم الحصول عليها من الخلايا المفردة المعزولة يسمح بعزو الاستنتاجات على وجه التحديد إلى نوع الخلية الواحدة نفسه. وقد تم هذا الإدراك القوة الدافعة لإنشاء طريقة موثوقبها وقابلة للاستنساخ للحصول على خلايا DSM معزولة حديثا من عينات المثانة البولية سمك كامل. على عكس العديد من أنواع الخلايا الأخرى ، لا يمكن أن تكون خلايا العضلات الملساء مثقفة بشكل موثوق بسبب فقدان النمط الظاهري الأصلي بما في ذلك تغييرات محددة في خصائصها الكهروفيزيولوجية والتعاقدية7،8. هذه الحقيقة يعزز كذلك أهمية الدراسات التي أجريت على خلايا DSM المعزولة حديثا النشطة من الناحية الفسيولوجية.
في أواخر عام 1980 وأوائل عام 1990 ، نشرت مجموعة Isenberg (ألمانيا) سلسلة من الدراسات الكهروفيزيولوجية على خلايا DSM المعزولة حديثًا التي تم الحصول عليها من المثانة البولية لخنزير غينيا9،10،11،12،13 ( الجدول1). وسلطت هذه الطريقة الضوء على ملاحظتين هامتين ساعدتا في الحصول على خلايا حيوية وكانت بمثابة مبدأ توجيهي أولي يتبعه الآخرون. كانوا 1) قبل علاج قطع DSM معزولة مع كاليفورنيا2 +حل حر / المتوسطة قبل العلاج الأنزيمي و 2) هضم الأنسجة مع حل يحتوي على الكولاجين. وقد أدرجت هاتين الخطوتين الحاسمتين في جميع المتغيرات اللاحقة لإجراءات التفكيك الخلوي DSM(الجدول 1). حاليا، مجموعتنا توظف نهج انفصال الباباين الكولاجيني متتابعة من خطوتين. يتم التعامل أولا ً مع قطع DSM مع محلول إنزيم يحتوي على الباباين ثم مع الكولاجين من النوع الثاني solubilized في نفس الحل (DS ، محلول التشريح / الهضم). هذا النهج ينتج خلايا DSM واحدة من أنواع مختلفة بما في ذلك خنزير غينيا والخنزير والجرذ والفأر ، والأهم من ذلك الإنسان(الجدول 1).
توفر خلايا DSM المفردة مصدرًا للعديد من التجارب البيولوجية والفسيولوجية الجزيئية. حتى الآن، البروتين والحمض النووي الريبي التعبيرات درس مع الكيمياء المناعية، أو RT-PCR/qRT-PCR كشفت عن مستويات عالية من الكشف عن قنوات الأيون المختلفة بما في ذلك الجهد التوصيل كبيرة- وكاليفورنيا2 +-تنشيط (BK)، التوصيل الصغيرة Ca2 +- تنشيط K+ نوع 3 (S K3)، الجهد مسور K+ (Kv)،L-نوع الجهد مسور كاليفورنيا2 + (كاليفورنياالخامس)،ومستقبلات عابرة المحتملة melastatin نوع 4 (TRPM4) قنوات، فضلا عن مبادل نا / كاليفورنيا2 + 14،15،16،17،18،19،20،21،22. ويعتقد أنهم جميعا للسيطرة على excitability DSM, داخل الخلايا كاليفورنيا2 + المستويات وانقباض. التصحيح المشبك النهج الكهروفيزيولوجية، التي أجريت مباشرة على خنزير غينيا، الماوس، الفئران، أو خلايا DSM الإنسان، قدمت مظاهرة مباشرة من الخصائص الفيزيائية الحيوية والدوائية من L-نوع كاليفورنياV،Kv (Kv.2.x Kv7)، SK، BK، وقنوات TRPM417،19،20،21،22،23،24،25 ،26،27،28،29،30،31. وشملت النهج التقليدية الجهد الخلية الكاملة المشبك، والجهد المبوّج، وتسجيلات ذات قناة واحدة (خلية المرفقة، من الداخل إلى الخارج والخارج تكوينات). بالإضافة إلى ذلك، فإن التسجيل المحتمل للغشاء DSM باستخدام المشبك الحالي قدم أدلة على أن العوامل الدوائية التي تستهدف الانخراط تغير من مدى الجاذبية الخلية. على سبيل المثال، تسبب مثبط TRPM4 9-فينانثول فرط الاستقطاب في خلايا DSM التي تم الحصول عليها من البشر، خنزير غينيا، والمثانة البولية الفئران19،20،22،31. من بين الأساليب الكهربية المختلفة ، توفر تسجيلات المشبك الكهربي الكهربي (amphotericin-B) (والنيستاتين والجراميسيدين وα-escin) ميزة رئيسية من خلال الحفاظ على جزيئات ومسارات الإشارات داخل الخلايا الجوهرية. فقط منخفضة الوزن الجزيئي المكاشنات وإلى حد أقل، Cl- ولكن ليس البروتينات أو الجزيئات إشارة بما في ذلك كاليفورنيا2 + - هي نفاذة من خلال المسام غشاء البلازما التي شكلتها أمبوشتيريسين-B أو نيستاتين32. تعتمد النتيجة الناجحة لتجارب المشبك المشبك المعلل على العديد من المتغيرات العامة الفريدة لهذه التقنية. هنا ، ونحن نصف تفاصيل الإجراء باستخدام amphotericin - B أن مجموعتنا قد استخدمت بنجاح على مدى سنوات15،22،33،34،35،36،37،38،39.
يمكن القول إن قنوات الميشن غير الانتقائية لا تزال واحدة من أنواع القنوات الأقل فهمًا في خلايا DSM. ويعود التقرير الأول لقناة غير انتقائية شبيهة بالتبليغ إلى عام 1993. ورقة من قبل ويلنر وIsenberg11 وصف 33 pS تمتد تنشيط قناة واحدة عرض ترتيب الترتيب التالي من نفاذية الأيون: K+> نا+>Cs+> > B2 +> Ca + 2+، وتثبيط نشاط القناة من قبل GD 3+، وهو مثبط عام من قنوات cation غير انتقائية. ما يقرب من عقد من الزمان في وقت لاحق، ثورنلو ونيلسون40 وصف نا+ التيارات الميشن نفاذة في خلايا DSM الماوس، التي تمنعها GD3 +، وذلك باستخدام التسجيلات الخلية الكاملة. وبما أن الهويات الجزيئية لقنوات التعامُن غير الانتقائية وتوصيفاتها البيوفيزيائية لم تحدد بعد، فإن هناك ما يبرر إجراء تحقيقات في المستقبل في هذا المجال البحثي. البروتوكول الموصوف هنا لتسجيل التيارات قناة المكاية غير انتقائية - باستخدام الحلول خارج الخلية وماصة داخل الخلايا التي تحتوي على Cs+، TEA+، ونيفديبين(الجدول 2)أن من الناحية الفسيولوجية والدوائية تخفيف Kالخامس وCaالخامس التيارات - وكان وسيظل مفيدا في التحقيقات الكهربية الفسيولوجية من قنوات المقاسم غير انتقائية. لقد استخدمنا هذا البروتوكول المحدد لتحديد مدى تثبيط التيارات الملجة الخلية الكاملة من قبل TRPM4 قناة مانع 9-phenanthrol في غينيا الخنزير والجرذ والإنسان DSM الخلايا19،20،22.
معا، والطريقة الموصوفة هنا للحصول على خلايا DSM واحدة معزولة حديثا من المثانة البولية البشرية يوفر خلايا قابلة للحياة مناسبة للغاية للتحقيقات الكهروفيزيولوجية باستخدام تكوينات مختلفة من تقنية التصحيح المشبك، كاليفورنيا2 +-التصوير، والكيمياء المناعية، في الموقع تحليل التقاضي القريب، وخلية واحدة RT-PCR/qRT-PCR فضلا عن تقنيات البيولوجيا الجزيئية المتقدمة بما في ذلك تحليل الميكروريس، RNA-seq، وCHIP-seq يحافظ استخدام طريقة المشبك المبكر على المشبك المبكر على بيئة الخلية الأصلية على عكس التكوينات الأخرى. عندما نفذت باستخدام الشروط المحددة المبينة هنا، تهدف إلى نفي مساهمات K+ وCa2+ التيارات في خلايا DSM، الجهد خطوة المستحثة التيارات عرض خصائص التيارات المكاية غير انتقائية مناسبة للتوصيفات البيوفيزيائية والدوائية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td>Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-Phenanthrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>211281</td>
			<td>TRPM4 channel inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP928-250</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>European Pharmacopoeia Reference Standards</td>
			<td>5</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-100MG</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9006</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Extracellular solution and DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-7.5</td>
			<td>Capillary for preparation of pulled patch electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8518</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>pCLAMP-10</td>
			<td>Commerical software and part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004177</td>
			<td>DS-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203025</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Miltex Dental Wax Technologies, Inc.</td>
			<td>18058351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer with Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-077-32</td>
			<td>Placed in tissue bath to monitor temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DDT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Reducing agents used together with Papain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Required to pull electrodes with very fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating foam tube rack/holder</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82017-634</td>
			<td>Used for holding tubes with enzymes for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid (Na salt)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>pH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Data Acquisition System</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-442-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroForge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Used for fire-polishing electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7634</td>
			<td>L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of Patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-metalic syringe needle, MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF-34G-5</td>
			<td>Filling of intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>DS-P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Axon Axopatch 200B</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC computer</td>
			<td>DELL</td>
			<td>Custom configuration</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Aspera Instruments</td>
			<td>PH700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427-436</td>
			<td>Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue bath, 100 mL</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>1583-101</td>
			<td>Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl tubing</td>
			<td>ColePalmer</td>
			<td>06405-3</td>
			<td>Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulator bath, Haake D1 L</td>
			<td>Haake</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Connected to tissue bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents

الخلايا العضلية الملساء (DSM) الموجودة داخل جدار المثانة البولية تسهل في نهاية المطاف تخزين البول وإبطاله. إعداد خلايا DSM قابلة للحياة، طازجة، معزولة يمثل تحديا تقنيا هاما الذي يوفر إنجازا الخلايا المثلى للدراسات الوظيفية والجزيئية اللاحقة. الطريقة التي تم تطويرها وتفصيلها هنا ، وتستخدم بنجاح من قبل مجموعتنا لأكثر من عقد من الزمان ، تصف تشريح عينات المثانة البولية البشرية التي تم الحصول عليها من جراحات المثانة المفتوحة تليها علاج أنزيم من خطوتين لقطع DSM والثلاثي الميكانيكي للحصول على خلايا DSM معزولة حديثًا. الخطوة الأولى تنطوي على تشريح لفصل طبقة DSM (المعروف أيضا باسم بروبريا العضلات) من الغشاء المخاطي (المسالك البولية، الصفيحة بروبريا، والغشاء المخاطي العضلي) والأنسجة الضامة المجاورة، والأوعية الدموية، والأنسجة الدهنية الحالية. ثم يتم قطع DSM إلى قطع (2-3 مم × 4-6 مم) في Caالاسمية 2 +- تحتوي على محلول التشريح / الهضم (DS). يتم نقل قطع DSM التالية إلى وتعامل بشكل متسلسل بشكل منفصل مع DS التي تحتوي على الباباين والكولاجين في ~ 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة لكل خطوة. بعد غسل مع DS التي تحتوي على مصل البقر الخالي من الإنزيم والثلاثي مع ماصة مصقولة بالنار ، تطلق القطع خلايا DSM واحدة. خلايا DSM المعزولة حديثًا مناسبة بشكل مثالي للتوصيفات الكهروفيزيولوجية والدوائية للقنوات الأيونية. على وجه التحديد، نظهر أن Channel Blocker TRPM4 9-phenanthrol يقلل من الجهد خطوة التيارات الملقط أثار المسجلة مع نهج المشبك المشبك المشبك أمفوريسين-B المبلل. ويمكن أيضا أن تدرس خلايا DSM من قبل تقنيات أخرى مثل خلية واحدة RT-PCR، تحليل الميكروريف، والكيمياء المناعية، في تحليل ربط القرب الموقعي، وتصوير كاليفورنيا2+ . الميزة الرئيسية لاستخدام خلايا DSM واحدة هو أن الملاحظات التي أجريت تتصل مباشرة خصائص خلية واحدة كشفت. وقد وفرت الدراسات التي أجريت على خلايا DSM الإنسان معزولة حديثا رؤى هامة تميز خصائص قنوات الأيون المختلفة بما في ذلك الميشن نفاذة في المثانة البولية، وسوف تستمر كمعيار الذهب في توضيح الخصائص الخلوية DSM والآليات التنظيمية.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

نحن نصف طريقة لإعداد واحد معزولة حديثا خلايا العضلات الملساء معزولة من عينات المثانة البولية البشرية التي تستخدم إجراء الأنزيمية خطوتين. يمكن دراسة خلايا DSM القابلة للحياة التي تم الحصول عليها من خلال تقنيات خلية واحدة مختلفة بما في ذلك الفيزيولوجيا الكهربية المثبتة في البوهوتريسين-B الموصوفة للكشف عن الخصائص الفسيولوجية والدوائية.

إعداد واستخدام خلايا العضلات الملساء الإنسان معزولة حديثا لتوصيف 9-فينانترول الحساسة التيارات التيشن

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...

خلايا العضلات الملساء detrusor تشكيل جدار المثانة التي تسهل في نهاية المطاف البول الفراغ والتخزين. بروتوكول لدينا يوفر طريقة موثوق بها وموثوق بها لعزل حديثا من خلايا العضلات الملساء واحدة. خلايا العضلات الملساء المُعزلة حديثاً للبشر توفر فرصة للفحص الكهربائي والفيزيائي على مستوى الخلية الواحدة.من خلال دراسة خلايا العضلات الملساء أحادية الانسانية من السيطرة ، والمثانات البولية البشرية العادية والمريضة ، لدينا الفرصة للتحقق من صحة الأهداف الدوائية مثل القنوات الأيونية. خلايا العضلات الملساء أحادية الجسم البشري هي مثالية للتجارب الكهربائية الفيزيولوجية مثل الفيزيولوجيا الكهربائية المشبك. هنا سوف نقدم مثالا لدراسة قناة أيون واحد اسمه TRPM4، مستقبلات عابرة melastatin أربع قنوات، وهو قناة الموجبة غير انتقائية.قد يعاني المبتدئون من خطوات التسلخ والعلاج الأنزيمي التي تتطلب الكفاءة والألفة بما في ذلك التعرف على الخطوات الهامة الحاسمة للحصول على خلايا DSM المعزولة الجديدة. من المهم أن تكون على دراية بأنستولوجيا المثانة البشرية ، والخطوات البروتوكولية لعزل الخلايا الفردية تبقى مرنة ، وتتوقع في البداية الحصول على خلايا دون المستوى الأمثل باستخدام هذا البروتوكول. تبدأ بفحص كامل سمك عينة المثانة البولية.دبوس العينة، الغشاء المخاطي التي تواجه صعودا وسيروزا أسفل على طبق سيليكون المغلفة enantiomer جولة 150 ملم مليئة الجليد الباردة DS وإزالة بعناية كل من الغشاء المخاطي عن طريق تشريح حاد. قطع العديد من الغشاء المخاطي خالية detrusor العضلات الملساء أو قطع DSM. ضع ثلاث إلى ست قطع DSM في أنبوب مع ملليلتر واحد إلى ملليلتر من DS مسبقًا التي تحتوي على papain و dithiothreitol ، أو DS-P.احتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة، مع التأكد من هز أنبوب كل 10 إلى 15 دقيقة. بعد الحضانة، وإزالة DS-P من الأنبوب وغسل لفترة وجيزة القطع DSM مع الجليد الباردة DS. نقل DS مع قطع DSM إلى أنبوب جديد وإزالة DS، وترك القطع DSM في الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة واحد إلى ملليلتر من DS التي تحتوي على نوع الكولاجين الثاني، أو DS-C، إلى الأنبوب.واحتضانه في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في بعض الأحيان. تخلص من DS-C واغسل قطع DSM المعالجة بالانزيم خمس إلى 10 مرات مع الجليد البارد DS. بعد الغسيل الأخير ترك DS داخل الأنبوب، و triturate بلطف القطع مع ماصة باستور مصقول النار لإطلاق سراح خلايا DSM واحد. Pipette 0.25 إلى ملليلتر واحد من تعليق الخلية على غرفة أسفل الزجاج يجلس على خشبة المسرح من المجهر المقلوب واحتضانه لمدة 45 دقيقة على الأقل للسماح للخلايا بالتمسك.ثم, إزالة DS من الحمام واستبداله بحل E عبر القذف الفائق. سحب أقطاب التصحيح متعددة، وطلاء النار نصائح القطب، ومعطف النصائح في شمع الأسنان إذا لزم الأمر. املأ طرف قطب التصحيح مع محلول الماصات بدون الأمفوتريسين-B عن طريق غمس القطب لفترة وجيزة في الحل.نجاح التصحيح المشبك الفيزيولوجيا الكهربائية يعتمد على جودة الخلية DSM وmubilization amphotericin-B. قم بتلمير القطب مع نفس المحلل الماصات الذي يحتوي على الأمفوتيريسين-B و جبل القطب على حامل متصل بمضخم مضخم مضخم رقعة. استخدام ميكرومانيبولاتور لوضع القطب أسفل سطح الحل خارج الخلية بحيث يتم غمر فقط غيض من القطب.ثم، تحديد مقاومة القطب باستخدام وظيفة نافذة اختبار الغشاء من البرمجيات اقتناء التجارية وتقدم القطب نحو الخلية من الفائدة. عند لمس سطح الخلية مع القطب الكهربائي، تشكل جيجا الختم عن طريق تطبيق ضغط سلبي سريع لطيف إلى القطب عن طريق الأنابيب. وهذا يؤدي إلى الضغط السلبي في غيض من القطب مما أدى إلى نجاح جيجا الختم كما أكد من قبل اختبار الغشاء.السماح 30 إلى 60 دقيقة ل amphotericin-B لنشر أسفل الماصة ويتم إدراجها في غشاء البلازما, تشكيل المسام انتقائية في المقام الأول إلى أحادية التكافؤ الكاتيونات. مواصلة رصد جيجا ختم مع وظيفة اختبار الغشاء. عندما تكون إنثقاب التصحيح الأمثل، قم بإلغاء العابرين بالسعة عن طريق ضبط الأوجه للسعة الخلوية ومقاومة السلسلة على مكبر الصوت.بمجرد ملاحظة التيارات ثبات مستوى الجهد، تسجل التيارات مع بروتوكول خطوة الجهد التوجيه كما هو موضح في المخطوطة. تطبيق مركب أو حالة اختبار فسيولوجية لاختبار عن طريق الضخ الفائق وتسجيل الاستجابات لظروف التحكم والاختبار وكذلك الاغتسال. يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل خلايا DSM صحية وجديدة للدراسات الفنية والجزيئية.تتميز خلايا DSM واحدة صحية من قبل مورفولوجيا على شكل المغزل، حواف واضحة واضحة المعالم، هالة محددة جيدا حول الخلية، ومظهر شبه انقبالي عندما ينظر إليها تحت المجهر. وعلاوة على ذلك، تستجيب خلايا DSM المعزولة حديثًا للتحفيز الميكانيكي والكارباخول. وينبغي تجنب شظايا الخلية والخلايا غير القابلة للحياة أو الإفراط في هضمها في التجارب اللاحقة التصحيح المشبك.وقد استخدمت الخلايا المعزولة في amphotericin-B مثقبة التصحيح المشبك التجارب حيث تم قياس التيارات الخلية الكاملة مع إما الجهد خطوة الناجمة أو بروتوكول منحدر في ثلاث خلايا DSM الإنسان مختلفة. وكشفت التجارب أن 9-phenanthrol, المانع قناة TRPM4, بشكل فعال وعكسي تثبيط الإنسان DSM التيارات الموجبة. 9-phenanthrol الحساسة الحالي مكون يوضح تثبيط أقوى في الفولتية الإيجابية وتصحيح الخارج.حالة خطوات العلاج الأنزيمية، والخطوات 2.2 و 2.3، بما في ذلك درجة الحرارة، ومدة العلاجات انزيم، ومصادر لوت انزيم وجودة خلايا DSM، هي المحددات الرئيسية للحصول على خلايا DSM الإنسان عالية الجودة. خلايا DSM الإنسان هي أيضا مناسبة بشكل مثالي لتقييم مستويات رسول الثانية داخل الخلايا بما في ذلك الكالسيوم وCOM دوري, الكشف عن تعبيرات البروتين عن طريق الكيمياء المناعية, والتعبير المشترك من قبل في موضعية التقاضي السحيق المقايسة, والتعبير مرنا من قبل RT-PCR, qRT-PCR, microarrays, وتسلسل الجيل القادم. وقد تقدمت خلايا DSM الإنسان فهمنا لأدوار BK, الكالسيوم, TRPM4 قنوات في المثانة.وسوف تسمح التطورات المستقبلية بربط الخصائص الكهروفيزيائية أو الدوائية على وجه التحديد مع ملفات النص أو البروتيوم.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

تنسيق كا 2 + الكشف العابر في العضلات الملساء

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

عزل الشريان السري الإنسان خلايا العضلات الملساء (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

فيفو السابقين تقييم من تعب، وانقباض في عضلات الهيكل العظمي تناوب متفرقة

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

على قناة واحدة وتحليل الكالسيوم التصوير في Podocytes من الكبيبات المعزولة حديثا

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

التصوير متحد البؤر قياس التقلبات الكالسيوم داخل الهيولى العضلية شبكية من مثقف خلايا العضلات الملساء عن طريق الحنق المستندة إلى

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption: نقل معزولة الإنسان MSC الميتوكوندريا إلى خلايا الجذعية ورم أرومي دبقي

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...