Name: preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents
Uploaded: 2020-01-31T12:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH-R01DK106964 og P20DK123971 tilskud til Georgi V. Petkov. Forfatterne takker Dr. Viktor Yarotskyy og Ms Sarah Maxwell for kritisk evaluering af manuskriptet. Vi er også taknemmelige for urologi personale kirurger på MUSC og UTHSC: Drs. Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter, og Anthony Patterson samt MUSC og UTHSC Urology beboere: Drs. Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O'Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata for deres hjælp med indsamling af humant væv.

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Review Board Udvalg fra University of Tennessee Health Science Center (Memphis, TN, IRB # 17-05714-XP), og Medical University of South Carolina (Charleston, SC, IRB # 00045232). De godkendte procedurer tillader heltykkelse urinblære prøver (> 1 cm af > 1 cm) - indeholder alle lag, herunder slimhinde, detrusor glat muskel, og serosa samt er fastgjort blodkar og fedtvæv) - der skal indsamles fra patienter-donorer gennemgår kirurgisk delvis ekstraktion af blære. Patientdonorer er voksne (aldersgruppe undersøgt indtil nu: 25 til 87 år gammel), enten mand eller kvinde, med eller uden symptomer på overaktiv blære (som klassificeret af American Urologisk Association I-PSS score41). Kirurgiske procedurer indebærer en række medicinske tilstande, herunder radikal cystelomi for urotelkarcinom, og adenocarcinom. I sådanne tilfælde, den indsamlede urinblære prøve er fjernt fra det sted, tumor.
1. DSM-væv og fremstilling af slimhindefri DSM-stykker
<ol><li>Undersøg hele tykkelsen urinblære prøve, der ankom i laboratoriet fra operationsstuen i en tæt forseglet beholder fyldt med kold dissektion / fordøjelse sopløsning(figur 1 og tabel 2 for sammensætning af DS). BEMÆRK: Prøven holdes normalt i koldt DS fra et par timer til natten før ankomst til laboratoriet. For længere opbevaring suppleres DS (tabel 2) med 1 mM CaCl2.</li>
	<li>Fjern og skyl den menneskelige hele tykkelse DSM prøve (indeholdende alle lag, herunder slimhinde, DSM, og serosa) med iskold DS til at vaske ud vedlagte snavs og blod.</li>
	<li>Pin urinblæreprøven, slimhinden opad og serosa ned, på en silikoneenantiomerbelagt (Tabel overmaterialer ) 150 mm diameter rund skål fyldt med iskold DS (figur 1B).</li>
	<li>Fjern det tilstødende fedtvæv, blodkar, epitel (urothelium) og muscularis mucosa fra prøven ved skarp dissektion ved hjælp af mikrosaks og pincet.</li>
	<li>Skær flere mucosa-fri DSM stykker (~ 2-3 mm lang og 4-6 mm bred)(Figur 1C).</li>
</ol>2. Enzymatisk dissociation af DSM stykker giver frisk isolerede enkelt DSM celler
<ol><li>Der anbringes 3 til 6 DSM-stykker i et rør, der indeholder 1 til 2 ml forvarmet (~37 °C) DS indeholdende papain og dithiothreitol (DS-P, tabel 2) og inkubere DSM-stykker i DS-P i 30-45 min ved ~ 37 °C forsigtigt at ryste røret lejlighedsvis (en gang hver 10-15 min). BEMÆRK: For at styre temperaturen optimalt for enzymatisk behandling anbringes rør med vævsstykker og enzymopløsninger i enten et glasvævskammer fyldt med vand, der er forbundet med et cirkulerende opvarmet vandbad (figur 1D) eller et temperaturstyret rystevandsbad med høj præcision (figur 1E).</li>
	<li>Fjern DS-P fra røret, vask kortvarigt DSM stykker med iskold DS, kassér kolde DS fra røret forlader DSM stykker sidder i bunden af røret.</li>
	<li>Tilføj 1 til 2 ml DS-holdige kollagentype II (DS-C, tabel 2)til røret med DSM stykker, bland forsigtigt; og inkubere i 25-40 min ved ~ 37 °C forsigtigt ryste røret lejlighedsvis (hver 10-15 min).</li>
	<li>Kassér DS-C og vask enzymbehandlede DSM-stykker 5-10 gange med iskold DS.</li>
	<li>Efter den sidste vask, lad DS opløsning inde i røret; forsigtigt triturate med en brandpoleret Pasteur pipette flere gange for at frigive enkelte DSM celler.</li>
	<li>Anbring et par dråber DS-opløsning, der indeholder spredte DSM-celler, på et glasbundskammer eller en dækseddel og inspiceres visuelt for kvaliteten under et mikroskop (med et mål på 20 x eller 40 x) efter mindst 5 min efter påføringen, så cellerne kan overholde bunden.</li>
	<li>Brug straks friskisolerede DSM-celler til elektrofysiologiske eksperimenter eller opbevar cellerne i et rør, der indeholder DS ved ~ 4 °C enten på is eller i køleskab, indtil de tages i brug (typisk i op til 8 timer under tilberedning). BEMÆRK: Inden for samme præparat varierer cellernes kvalitet fra meget levedygtige til overfordøjede, døde DSM-celler (figur 2). Når den sekventielle papain-collagenase metode giver et meget højt antal ulevedygtige celler, præparatet kasseres, og en ny fordøjelse af DSM stykker udføres, men med reduceret inkubationsintervaller. Hvis proceduren resulterer i for få DSM-celler derefter for den efterfølgende fordøjelse af DSM stykker, inkubationsintervallerne øges. Positiv immunreaktivitet over for α-glat muskelactin bekræfter identiteten af DSM-celler (figur 3).</li>
</ol>3. Registrering af spændingstrin induceret kation strømme fra DSM celler ved hjælp af amphotericin-B perforeret hele celle spænding patch-klemme teknik
<ol><li>Pipette 0,25-1 ml celleaffjedring på et glasbundkammer, der sidder på en fase af et omvendt mikroskop, og lad cellerne klæbe sig til glasbunden.</li>
	<li>Efter inkubation i mindst 45 min. skal ds fjernes fra badet og erstattes med E-opløsningen (tabel 2) med superfusion, hvor opløsningen flyder hjulpet af tyngdekraften via indløbsrør, der bremser DS med den nye opløsning, mens udløbsslangen er forbundet med et vakuumaffaldsfartøj, fjerner kammeropløsningen og forhindrer overløb. Bemærk, at E-opløsning indeholder tetraethylammonium (TEA+) og cæsium (Cs+)ioner til at hæmme K+ strømme.</li>
	<li>Der fremstilles en arbejdsbestandopløsning af amphotericin-B i dimethylsulfoxid (DMSO) (1 mg pr. 10 μL DMSO). For fuldt ud at opløse amphotericin pulver, sonikere (mindst 15 min) og vortex opløsningen godt. BEMÆRK: Dette trin tager normalt mindre end 10 min. Opløsning 3-4 mg amphotericin-B i 30-40 μL Af DSMO i en 1,5 ml mikrocentrifuge rør fungerer godt. Højere mængder amphotericin-B kræver mere DSMO opløsningsmiddel typisk resulterer i et længere interval for blanding og ufuldstændig opløselighed af amphotericin-B faste partikler til stede i røret.</li>
	<li>Opløsningaf amphotericin-B opløses i pipetteopløsningen (opløsning P, tabel 2) for at opnå en endelig koncentration på 200-500 μg/ml. Dette trin kræver omfattende sonikering og vortexing ved en højhastighedsindstilling (8-10/10) for ~ 30 til 60 min pr. trin for at sikre optimal blanding og forebyggelse af amphotericin-B-bundfaldsdannelse i pipetteopløsningen. BEMÆRK: Amphotericin-B vil udfælde over tid og er lysfølsom. Den fungerende pipetteopløsning, der indeholder Amphotericin-B, kontrolleres for opløselighed, håndblandet før pipettefyldning og holdes i mørke.</li>
	<li>Træk flere patch elektroder, brand-polske elektrode tips, og (hvis det er nødvendigt) pels spidserne med dental voks.</li>
	<li>Fyld spidsen af en plasterelektrode med pipetteopløsningen (opløsning P, tabel 2) uden amphotericin-B ved kort at dyppe elektroden i opløsningen.</li>
	<li>Fyld elektroden med samme pipetteopløsning indeholdende amphotericin-B.</li>
	<li>Monter elektroden på en holder, der er tilsluttet en patch-clamp forstærker hovedtrin.</li>
	<li>Ved hjælp af en mikromanipulator skal elektroden placeres lige under overfladen af den ekstracellulære opløsning, så elektrodens spids er lige nedsænket.</li>
	<li>I spændingsklemmetilstanden skal du indstille holdepotentialet til 0 mV og justere strømmen til 0 pA med pipetteforskydningsskiven på den kommercielle forstærker (Materialetabellen).</li>
	<li>Anskaf elektrodemodstanden ved hjælp af membrantestvinduet/funktionen af den kommercielle anskaffelsessoftware (Materialetabel). Hvis du vil aktivere, skal du klikke på Værktøjer>Membrantest>Afspil eller et genvejsikon i softwaren. Den bestemmende elektrodebestandighed skal være i området 2 til 5 MΩ. BEMÆRK: Membrantestfunktion, der leveres i den kommercielle anskaffelsessoftware eller seal test-muligheden på forstærkeren, kan bruges til at overvåge elektrodemodstanden ved gentagne gange at anvende spændingstrin.</li>
	<li>Fortsæt overvågningen elektrode modstand, mens fremme elektroden mod en valgt DSM celle med en mikromanipulator (Figur 4A). BEMÆRK: For at blive betragtet som en levedygtig DSM celle, skal cellen vise spindelformet aflang morfologi, en veldefineret glorie omkring cellen, skarpe kanter, og semi-kontraktile (serpentin) udseende.</li>
	<li>Når du rører ved celleoverfladen med elektroden - indikeret med en hurtig stigning i elektrodemodstanden målt med membrantestfunktionen - dannes der en giga-tætning ved at påføre elektrodeholderen et let hurtigt tryk via slange. Dette resulterer i et undertryk, der dannes ved elektrodens spids, og som trækker cellemembranen ind i elektroden, der hjælper ved dannelsen af en giga-tætning eller en meget tæt kontakt mellem elektroden og plasmamembranen (figur 4B).</li>
	<li>Når giga-tætningsformerne skal kompenseres, skal du kompensere pipettekapacitansveden ved at justere hurtige og langsomme ringer på den kommercielle forstærker og overvåge giga-tætningsstabilitet (lækagestrøm) ved hjælp af membrantestfunktionen.</li>
	<li>Tillad tid, typisk 30-60 min, for amphotericin-B at diffuse ned pipetteret og indsættes i plasmamembranen danner porer primært selektiv til monovalent kationer. Under dette trin skal du fortsætte med at overvåge giga-forseglingen med membrantestfunktionen. Efterhånden som celleperforering øges, måles kapacitanstransienternes amplitude (sammenlign figur 4B versus figur 4C, der viser henholdsvis ingen og effektiv celleperforering), målt med membrantestfunktionen.</li>
	<li>Når plasterperforering er optimal (bedømt af stabil seriemodstand typisk under 50 MΩ), annulleres kapacitanstransienterne ved at justere ringer for cellekapacitans og seriemodstand på forstærkeren. Serie modstand kompensation kan også udføres på dette tidspunkt(Figur 4D).</li>
	<li>Når stabile spændingstrin inducerede kationstrømme fremkaldt af den angivne protokol er observeret, anvende en sammensat eller fysiologisk tilstand til at teste ved superfusion og registrere svarene for kontrol-, test-tilstand, og udvaskning (hvis det er muligt) med kommerciel erhvervelse software.<ol>
<li>Optag strømme med en rutinemæssig spændingstrinprotokol, der indebærer at holde DSM-celler på -64 eller -74 mV og træde spændingen i 10 mV-intervaller for 400 eller 500 ms fra -94 til +96 eller +106 mV og vende tilbage til bedriftspotentialet. BEMÆRK: Membranens potentielle værdier justeres for et væskekrydspotentiale på 14 mV (ved hjælp af P- og E-opløsninger, tabel 2). Den flydende junction potentiale opnås i den kommercielle erhvervelse software (Tabel over materialer) ved at klikke (Tools> Junction Potentialer) og ind i koncentrationerne af opløsning ion komponenter. En rampeprotokol kan også bruges til at hente aktuelle optagelser.</li>
		<li>Kør spændingsprotokollen i kontinuerligt interval på ~1 min under et eksperimentoptagelsesstrømme for kontrol før tilføjelse, testtilstand og udvaskning.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Dataanalyse og visualisering
<ol><li>Åbn optagede filer i softwaren til analyse af kommercielle data (Materialetabel) til kontrolelementet, testtilstanden og udvaskningen ved at klikke på Filer>Åbn data og vælge filer af interesse for åbning. BEMÆRK: Til analyse typisk tre filer (hver indeholder et enkelt sæt spor til en enkelt protokol køre) for hver betingelse åbnes og analyseres. Svarene er efterfølgende gennemsnit for at opnå en gennemsnitlig respons for hver betingelse. Den software, der bruges til dataindsamling indeholder en mulighed for automatisk at indsamle brugerspecificerede flere testkørsler og gennemsnitlige dem for enkelt output fil, der kan bruges som et alternativ.</li>
	<li>Opnå den gennemsnitlige respons i løbet af de sidste 200 ms for den aktuelle spor målt ved hver spænding; det valgte varighedsinterval afspejler en stabil tilstand af aktivering af spændingstrin. For at gøre dette skal du følge nedenstående trin.<ol>
<li>Vælg en fil af interesse til analyse i den kommercielle analyse software (Tabel over materialer). BEMÆRK: Softwaren placerer den senest importerede fil i det aktive displayvindue. Den åbne fil viser en række overlappende spor opnået med en spænding-trin protokol. Som standard vises fire markører (der viser x- og y-værdier for det fremhævede sporing) i det aktive vindue.</li>
		<li>Vælg analyseområdet ved at placere markøren 2 i slutningen af spændingstrinnet 400 eller 500 ms og markøren 1 i intervallet 200 ms før det, så analyseområdet er 200 ms.</li>
		<li>Få svar for hver spænding ved at klikke på Analysér>Hurtig graf>IV (eller IV-genvejsikonet) (i promptvinduet, før du genererer data, bekræfter, at for y-akse (aktuelle) signalområdeindstillinger "Markører 1..2" og "Middel" er valgt). Klik på OK for at generere I-V-grafen og placere dataene i et kolonnen Resultater, der kan ses ved at få adgang til Windows>Resultater.</li>
		<li>Analysér yderligere filer ved at gentage trin 4.2.1 - 4.2.3. Klik på Analysér>Hurtig graf>IV eller genvejen IV, vælg Tilføj i stedet for at erstatte for at føje yderligere data til resultatarket, når sporingerne behandles.</li>
		<li>Kopier data til et regneark ved at markere kolonnerne af interesse og trykke på CTRL+C for at kopiere og CTRL+V for at indsætte. Gem regnearket Resultater i den kommercielle analysesoftware (Materialetabel) i (*.rlt) format ved at klikke på Filer>Gem som.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For hver celle skal svarene for alle tre betingelser normaliseres til værdien af det maksimale spændingstrin for foradditionskontrolelementet (i henhold til formlen: Response/ResponseControl-Max) og grafer svarene som aktuelle (eller aktuelle tæthedsværdier) i forhold til spændingsrelationer (figur 6).<ol>
<li>I en regnearksprocessor skal du bestemme de gennemsnitlige svar som enten strømme (pA) eller aktuelle tætheder (pA/pF) for kontrol, testtilstand (i dette eksempel 9-phenanthrol) og udvaskning ved hvert spændingstrin.</li>
		<li>Opdel værdier for hver spænding i hver betingelse (kontrol, 9-phenanthrol og udvaskning) med det maksimale kontrolrespons, der opnås ved den højeste spænding (+96 mV i figur 6) for foradditionskontrolelementet efter formlen: Normaliseret respons for tilstand(x) = Response(x)/ ResponseControl-Max for (x).</li>
	</ol>
</li>
	<li>For summarisk analyse skal du arrangere dataene i et format, der nemt kan kopieres til et grafisk program (f.eks.</li>
</ol>

De procedurer, der er beskrevet her, forklarer de trin, der er involveret i forberedelsen af levedygtige, friskisolerede DSM-celler fra hele tykkelsen af humane urinblæreprøver ved hjælp af enzymatisk fordøjelse og i optagelsen af hele cellekationstrømme, der er følsomme over for TRPM4-kanalhæmmeren 9-phenanthrol, der anvender amphotericin-B perforeret patch-clamp-tilgang. Den enzymatiske procedure bygger på en to-trins sekventiel eksponering benævnt heri som sekventiel papain-kollagen fordøjelse metode. DSM væv behandles først med papain og dithiothreitol (et enzym stabiliserende middel) under en nominel Ca2 +-fri tilstand, efterfulgt i andet trin af kollagen type II i overværelse af lav Ca2 +. Begrundelsen for at udføre papain fordøjelse n under lave Ca2 + betingelser i glatte muskelceller daterer sig tilbage til slutningen af 1980'erne. Frisk isolerede halspulsåren glatte muskelceller udarbejdet med papain viste en aflang form, viste levedygtighed (modstand mod Trypan Blue optagelse) og reagerede på kontraktile stimuli (højere Ca2 + og histamin)65. År senere blev denne metode anvendt ved udarbejdelsen af DSM-celler (se tabel 1). Valget af kollagen type II snarere end andre typer vedrører sin relativt høje proteolytiske aktivitet ideel til glat muskelvæv, herunder DSM. Faktisk, kollagenbehandling alene kunne give enkelte DSM celler, omend kræver omfattende enzym eksponering (≥60 min)53,54. Da kollagenaktivitet afhænger af Ca2+, og enzymet er inaktivt under Ca2+-frie forhold, kræver optimal enzymatisk fordøjelse af DSM-stykker tilstedeværelsen af Ca2+ 66. I vores tilfælde indeholder DS-C 100-200 μM [Ca2+] (tabel 2). Efter enzymatisk behandling vaskes fordøjede DSM-stykker forsigtigt flere gange med kold DS uden enzymer eller Ca2+ for at fjerne ethvert enzym, der er bundet til væv. Den iskolde DS hjælper med at bevare DSM celle integritet og til at begrænse enzymatisk aktivitet af eventuelle resterende papain eller kollagen. I det sidste trin frigiver trituration af enzymbehandlede DSM-stykker med en brandpoleret Pasteur pipette enkelt DSM-celle. DSM-celler placeres enten straks på et optagekammer til patch-clamp undersøgelser eller andre typer af eksperimenter eller opbevares på is i DS til brug senere samme dag (typisk inden for 8 timers forberedelse, men cellerne forbliver levedygtige i op til 24 timer).
Vi identificerede flere vigtige overvejelser for at opnå enkelte DSM-celler. Den første vedrører den menneskelige DSM prøve kildekvalitet. For optimalt at bevare vævsintegritet, DSM prøver fremstillet af åbne blæreoperationer er placeret i iskold DS så hurtigt som muligt og vedligeholdes i et koldt miljø. Konkret, ved kirurgisk ekstraktion fra patienten, blæreprøven er straks placeret på et fuldt forberedt sidebord på operationsstuen. Grov undersøgelse af hele prøven (normalt opnået under radikal eller simpel cystektomi) og dens åbning følge. Efter visuel inspektion fjernes et stykke heltykkelsesurinstigeprøve fra et fjerntliggende område af prøven, der er groft uinvolveret med tumor, og straks anbringes i en kop (enten 50 eller 100 ml), der indeholder kold (~4 °C) Dissektionsopløsning (DS) (tabel 2) og derefter tæt lukket med låg. På grund af den planlagte karakter af høsten af vævet, operationsstuen personale og hjælpepersonale gør høsten er advaret i begyndelsen af det kirurgiske tilfælde for at få de materialer til rådighed i operationsstuen på tidspunktet for vævudvinding. Disse forholdsregler sammen med den rutinemæssige, gentagne karakter af forarbejdningstrinnene holder den varme iskæmi tid for vævet - fra ekstraktion til placering i den kølede beholder med DS-opløsning - til mindre end 5 min. Beholderen placeres derefter i køleskab eller på is i en køler for at opretholde det kolde miljø og transporteres (iskold) til laboratoriet. Når prøven ankommer til laboratoriet, begynder dissociationstrinnene. Det er meget vanskeligt at forudsige, om en given DSM-prøve vil give DSM-celler af høj kvalitet efter enzymatisk dissociation, så vi fortsætter med de enzymatiske dissociationstrin. I mange tilfælde, parallelt med elektrofysiologiske eksperimenter, vores gruppe udfører isometriske spænding optagelser på DSM strimler udarbejdet af de samme DSM prøver. Vi har konstateret, at vi normalt kan få høj kvalitet DSM celler fra præparater, der også med succes give levedygtige strimler til isometriske sammentrækning undersøgelser (vores ikke-offentliggjorte observation).
Den anden faktor vedrører forskellige enzympartivariabiliteter. Vi bemærkede, at for både papain og kollagen type II, hver gang en ny masse enzym ankommer fra en leverandør, enzymaktivitet i DS for væv fordøjelse kan variere. Vi optimerer derfor rutinemæssigt enzymkoncentrations- og inkubationsintervallerne for hvert nyt parti. For at minimere partiets variabilitetbidrag bestiller vi større mængder af samme parti og laver et stort parti af lageropløsninger i 2 ml-aliquots af enzymer og opbevarer dem ved ~-20 °C indtil brug. Over tid, dog frosne lagre (gemt op til 2 uger) kan miste deres enzymatiske aktivitet. Den tredje variabel vedrører temperaturen af enzymfordøjelsesbehandlinger. Enzymatiske aktiviteter af både papain og kollagen display temperatur-afhængighed. Papain og kollagen type II udviser aktivitet i temperaturområderne omfatter normal krop fysiologi67,68. Derfor sigter vi mod at opretholde enzymbehandlingerne stabile ved ~ 37 °C og undgå højere temperaturer for at bevare DSM-celleintegriteten. Den fjerde overvejelse vedrører variabiliteten af kvaliteten af DSM-celler, der findes inden for hvert præparat, lige fra meget levedygtige (udviser fremragende klassiske glatte muskelegenskaber) til ikke-sunde, overfordøjede celler. Et forlænget enzyminkubationsinterval er en af hovedårsagerne til at opnå et stort antal beskadigede celler. Overdreven enzymbehandlinger forringer også proteinstrukturerne i ionkanaler, receptorer og transportører, hvilket påvirker deres funktionalitet negativt. Fortolkning af resultater fra enzymatisk opnåede, friskisolerede celler bør tage dette hensyn. Optimering af enzymfordøjelsesforhold har til formål at øge procentdelen af meget levedygtige celler. Eksperimentelle tilgange, der bygger på et større antal levedygtige celler såsom mikroarrayanalyser, kræver mere robuste optimeringer end dem, der med succes udføres på færre celler såsom encellede patch-clamp elektrofysiologi eller Ca2+ billeddannelse. Overvejelser om ovennævnte faktorer har styret vores forskningsindsats i løbet af de sidste ti år med at opnå en enkelt DSM-celler af høj kvalitet.
Den perforerede patch-clamp teknik har været en grundpille elektrofysiologisk tilgang i over et kvart århundrede. Flere publikationer indeholder nærmere oplysninger om de tekniske overvejelser69,70,71,72,73. Celleperforering kan opnås med amphotericin-B, nystatin, gramicidin eller β-escin (se reference32for overblik over hver). Den største fordel ved perforerede patch-clamp optagelser over andre elektrofysiologiske tilgange er, at den indfødte intracellulære miljø - herunder intracellulære Ca2+og signalering molekyler (f.eks cAMP, PKA, fosfater, og fosfordiesterases) - er bevaret. Denne teknik er derfor velegnet til at undersøge hele celle ion kanal strømme og deres lovgivningsmæssige mekanismer under næsten fysiologiske forhold. En vigtig advarsel er, at intracellulære celle sammensætning ikke kan præcist kontrolleres i modsætning til andre elektrofysiologiske metoder såsom konventionelle hele celle og enkelt-kanal punktafgifter-patch (inde- og outside-out) optagelser. Det er vores erfaring, at tre faktorer rutinemæssigt bidrager til vellykkede eksperimentelle resultater af amphotericin-B-perforerede patch-clamp eksperimenter. Den første er kvaliteten af den DSM-celle, der er valgt til at forsøge en optagelse. Når DSM celler er meget levedygtige viser en semi-kontraktile (serpentin-lignende), høj kontrast skinnende udseende med en veldefineret glorie omkring celleoverfladen og fastgør tæt på glasbunden af optagekammeret derefter giga-forsegling dannelse og celle perforering forekommer relativt let. De anden og tredje faktorer for succes vedrører henholdsvis kildekvaliteten og opløseligheden af amphotericin-B (i dimethylsulfoxid/DMSO og intracellulær pipetteopløsning). Vi observerede uoverensstemmelser mellem forskellige leverandører med hensyn til kilde- og partiudsving. Hver dag udarbejder vi en frisk opløsning af amphotericin-B lageropløsning fra pulver efterfulgt af fortynding i intracellulær pipetteopløsning. Disse trin kræver omfattende sonikering og vortexing. Med frisklavet amphotericin-B-holdig pipetteopløsning, vellykket celleperforering (<50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K mω)="" following="" giga-seal="" formation="" can="" be="" usually="" obtained="" within="" 30="" min.="" the="" concentration="" of="" amphotericin-b="" in="" the="" pipette="" solution="" also="" requires="" optimization="" dependent="" on="" the="" amphotericin-b="" lot="" and="" source.="" under="" our="" experimental="" conditions,="" the="" final="" amphotericin-b="" concentrations="" in="" the="" pipette="" range="" from="" 200="" to="" 500="" µg/ml.="" since="" amphotericin-b="" exhibits="" light="" sensitivity,="" its="" solutions="" need="" to="" be="" kept="" in="" the="" dark.="" using="" the="" amphotericin-b="" perforated="" patch-clamp="" technique,="" our="" group="" recorded="" voltage-step="" induced=""></50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K>+Ca2+og ikke-selektive kationstrømme fra humane, marsvin, mus og/eller rotte-DSM-celler17,21,22,23,29,30,31,35,60. Her beskriver vi betingelserne for registrering af ikke-selektive kationstrømme i humane DSM-celler. 9-Phenanthrol, en blokker af TRPM4 kanaler, dæmpet spænding-trin induceret strømme støtte den rolle, som disse kanaler i kontrollen med DSM ophidselse. Som en note, det normalt kræver mindst 45 min efter at have opnået en giga-forsegling og indledning af perforering at registrere optimal stabil spænding-trin induceret ikke-selektivkation strømme. Spændingsramper kan også bruges som et alternativ til spændingstrinsprotokoller30,64. Her, en spænding-trin protokol fra en hyperpolariseret bedrift membran potentiale blev foretrukket snarere end en rampe protokol, da den tidligere tilgang minimerer effekten af spænding-afhængige inaktivering og giver mulighed for et gennemsnit af fremkaldte strøm over en varighed spændingstrin, hvor rampen giver et enkelt datapunkt pr. spænding. Sidstnævnte punkt gælder især for humane DSM-celler, da strømmene viser variabel aktivitet under spændingstrin (Figur 5OgFigur 6). Den amphotericin-B perforeret patch-clamp teknik har været afgørende for at identificere egenskaberne af DSM celler og andre celletyper og vil fortsætte med at aide i at give nye opdagelser i fremtiden. Desuden kan friskisolerede enkelt DSM-celler med succes anvendes til måling af hele celle K+Cl-, og Ca2+strømme med den konventionelle tilstand af patch-clamp teknik, membran potentieloptagelse med den nuværende klemme, og enkelt kanal optagelser som eksemplificeret ved vores tidligere rapporter23,29,35,64.
Ud over enkeltcellepatch-clamp metoder, friskisolerede DSM celler kan undersøges med andre tekniske tilgange, herunder Ca2 + billeddannelse, RT-PCR/q-RT-PCR, immuncytokemi, in situ nærhed ligation assay, og genomiske tilgange (f.eks microarray, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Som enkelt celle transskription ser bestemmelse metoder fortsætte med at udvikle sig og blive meget følsomme, vi forestiller os i en fremtidig evne til rutinemæssigt og specifikt at forbinde elektriske eller farmakologiske egenskaber af de enkelte DSM celler med deres transskription / proteome profiler. Dette opnås ved først optagelse fra en DSM-celle og derefter udvinde mRNA eller protein efterfulgt af transskripomiske/proteomiske analyser. Selv om sådanne metoder allerede er blevet testet i ikke-DSM-celler, er de i øjeblikket teknisk udfordrende, manglende følsomhed, der skal betragtes som rutine, og begrænset til vellykket påvisning af nogle få udvalgte genprodukter74. Funktionsmolekylær profiludtryk, der forbinder undersøgelser, når de udføres på DSM-celler fra urinblærer, der stammer fra kontrol- og syge patientdonorer, vil give indsigt i fysiologiske processer, der er afgørende for at køre normale DSM-funktioner, patogenese og identificere effektive nye terapeutiske tilgange.

Detrusor glatte muskel (DSM) celler udgør den mest rigelige celletype i urinblæren og i sidste ende kontrollere urin opbevaring og rlaging gennem afslapning og sammentrækning, henholdsvis. DSM celler danner glatte muskel bundter, der fletter med tilstødende bindevæv, nerveprocesser, interstitielle celler, og andre celletyper1. Den nuværende forståelse af DSM-cellernes rolle i urinblærefunktionen er opnået gennem en integreret tilgang på flere niveauer. Hver eksperimentel metode - enten baseret på isolerede enkeltceller in vitro, væv strimler indeholder glatte muskel bundter in vitro / ex vivo, eller in vivo bestemmelser (såsom cytometri og voiding funktion vurderinger) - giver vigtig og specifik indsigt i fysiologiske og farmakologiske egenskaber af DSM (se anmeldelser1,2,3,4,5,6 for detaljer). Fortolkningaf resultater fra isolerede enkelte celler gør det imidlertid muligt specifikt at henføre konklusioner til selve enkeltcelletypen. Denne erkendelse har været den drivende kraft til at etablere en pålidelig og reproducerbar metode til at opnå friskisolerede DSM-celler fra hele tykkelsen urinblære prøver. I modsætning til mange andre celletyper, kan glatte muskelceller ikke pålideligt dyrkes på grund af tabet af deres indfødte fænotype herunder specifikke ændringer i deres elektrofysiologiske og kontraktile egenskaber7,8. Dette faktum styrker yderligere betydningen af undersøgelser, der udføres på fysiologisk aktive friskisolerede DSM-celler.
I slutningen af 1980'erne og begyndelsen af 1990'erne offentliggjorde Isenbergs gruppe (Tyskland) en række elektrofysiologiske undersøgelser af friskisolerede DSM-celler fremstillet af marsvinurinblærer9,10,11,12,13 ( tabel1). Metoden fremhævede to vigtige observationer, der hjalp med at opnå vitale celler og tjente som en indledende retningslinje for andre at følge. De var 1) forbehandling isolerede DSM stykker med Ca2 +-fri opløsning / medium før enzymatisk behandling og 2) væv fordøjelse med en opløsning, der indeholder kollagen. Disse to kritiske trin er blevet indarbejdet i alle de efterfølgende varianter af DSM-celledissociationsprocedurer (tabel 1). I øjeblikket, vores gruppe beskæftiger en to-trins sekventiel papain-collagenase dissociation tilgang. DSM stykker behandles først med en enzymopløsning, der indeholder papain og derefter med kollagennase type II opløses i samme opløsning (DS, dissektion / fordøjelsesopløsning). Denne fremgangsmåde giver enkelt DSM-celler fra forskellige arter, herunder marsvin, svin, rotte, mus og vigtigst menneske (tabel 1).
Enkelt DSM celler giver en kilde til flere molekylærbiologi og fysiologiske eksperimenter. Indtil videre har protein- og mRNA-udtryk undersøgt med immuncytokemi, eller RT-PCR/qRT-PCR-bestemmelser afslørede høje detektionsniveauer for forskellige ionkanaler, herunder den store ledningsspændingsspænding- og Ca2+aktiveret (BK), lille ledningsføring Ca2+-aktiveret K+ type 3 (SK3) spændingsgated K+ (Kv),L-type spænding-gated Ca2 + (Cav),og forbigående receptor potentielle melastatin type 4 (TRPM4) kanaler, samt en Na / Ca2 + veksler 14,15,16,17,18,19,20,21,22. De er alle menes at kontrollere DSM ophidselse, intracellulære Ca2 + niveauer og kontraktilitet. Patch-clamp elektrofysiologiske tilgange, udført direkte på marsvin, mus, rotte, eller menneskelige DSM celler, forudsat direkte demonstration af biofysiske og farmakologiske egenskaber af L-type Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK, og TRPM4 kanaler17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. Tilgangene omfattede en konventionel helecellespændingsklemme, perforeret spændingsklemme og enkeltkanalsoptagelser (cellevedlagte, inde- og udegående konfigurationer). Derudover, membran potentielle registrering af DSM ved hjælp af en strøm-klemme forudsat dokumentation for, at mål-engagerende farmakologiske midler ændre celle ophidselse. For eksempel induceret TRPM4-hæmmer 9-phenanthrol hyperpolarisering i DSM-celler fremstillet af mennesker, marsvin og rottevandblærer19,20,22,31. Blandt de forskellige elektrofysiologiske metoder giver amphotericin-B (og nystatin, gramicidin og β-escin) perforerede patch-clamp-optagelser en vigtig fordel ved at bevare iboende intracellulære signaleringmolekyler og veje. Kun lav molekylvægt kationer og i mindre grad, Cl- - men ikke proteiner eller signalering molekyler, herunder Ca2 + - er gennemtrængelige gennem plasmamembranen porer dannet af amphotericin-B eller nystatin32. Det vellykkede resultat af perforerede patch-clamp eksperimenter afhænger af flere generelle variabler unikke for denne teknik. Her beskriver vi detaljerne i den procedure, der udnytter amphotericin-B, som vores gruppe har brugt med succes gennem årene15,22,33,34,35,36,37,38,39.
Velsagtens, ikke-selektive kation kanaler forbliver en af de mindst forstået kanal typer i DSM celler. Den første rapport fra en ikke-selektiv kation-lignende kanal går tilbage til 1993. Papiret af Wellner og Isenberg11 beskrevet en 33 pS stretch-aktiveret enkelt kanal viser følgende rang rækkefølge af ion permeabilitet: K+> Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+, og hæmning af kanalaktivitet af Gd3 +, en generel hæmmer af ikke-selektive kation kanaler. Næsten et årti senere, Thorneloe og Nelson40 beskrevet Na+ gennemtrængelige kation strømme i mus DSM celler, hæmmet af Gd3 +, ved hjælp af hele celle optagelser. Da molekylære identiteter af ikke-selektive kationkanaler og deres biofysiske karakteriseringer endnu ikke er fastlagt, er fremtidige undersøgelser på dette forskningsområde berettigede. Protokollen beskrevet heri for registrering af ikke-selektive kation kanal strømme - ved hjælp af ekstracellulære og pipette intracellulære opløsninger, der indeholder Cs+, TEA+, og nifedipin (Tabel 2), at fysiologisk og farmakologisk afbøde Kv og Cav strømme - har været og vil fortsat være nyttige i elektrofysiologiske undersøgelser af ikke-selektive kation kanaler. Vi har udnyttet denne specifikke protokol til at bestemme omfanget af hæmning af hele celle kation strømme af TRPM4 kanal blokker 9-phenanthrol i marsvin, rotte og menneskelige DSM celler19,20,22.
Samlet set den metode, der er beskrevet her for at opnå friskisolerede enkelt DSM celler fra human urinblære giver levedygtige celler særdeles velegnet til elektrofysiologiske undersøgelser ved hjælp af forskellige konfigurationer af patch-clamp teknik, Ca2 +-imaging, immuncytokemi, in situ proksimale retssager assay, og enkelt celle RT-PCR/qRT-PCR samt avancerede molekylærbiologi teknikker, herunder microarray analyse, RNA-seq, og CHIP-seq. Brugen af amphotericin-B perforeret patch-clamp metode bevarer den indfødte celle miljø i modsætning til andre konfigurationer. Når de udføres ved hjælp af de specifikke betingelser, der er skitseret her, designet til at ophæve bidrag af K+ og Ca2 + strømme i DSM celler, spænding-trin induceret strømme vise egenskaberne af ikke-selektive kation strømme egnet til biofysiske og farmakologiske karakteriseringer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td>Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-Phenanthrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>211281</td>
			<td>TRPM4 channel inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP928-250</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>European Pharmacopoeia Reference Standards</td>
			<td>5</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-100MG</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9006</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Extracellular solution and DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-7.5</td>
			<td>Capillary for preparation of pulled patch electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8518</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>pCLAMP-10</td>
			<td>Commerical software and part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004177</td>
			<td>DS-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203025</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Miltex Dental Wax Technologies, Inc.</td>
			<td>18058351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer with Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-077-32</td>
			<td>Placed in tissue bath to monitor temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DDT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Reducing agents used together with Papain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Required to pull electrodes with very fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating foam tube rack/holder</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82017-634</td>
			<td>Used for holding tubes with enzymes for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid (Na salt)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>pH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Data Acquisition System</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-442-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroForge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Used for fire-polishing electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7634</td>
			<td>L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of Patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-metalic syringe needle, MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF-34G-5</td>
			<td>Filling of intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>DS-P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Axon Axopatch 200B</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC computer</td>
			<td>DELL</td>
			<td>Custom configuration</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Aspera Instruments</td>
			<td>PH700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427-436</td>
			<td>Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue bath, 100 mL</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>1583-101</td>
			<td>Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl tubing</td>
			<td>ColePalmer</td>
			<td>06405-3</td>
			<td>Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulator bath, Haake D1 L</td>
			<td>Haake</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Connected to tissue bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents

Detrusor glat muskel (DSM) celler til stede i urinblære væggen i sidste ende lette urin opbevaring og annullering. Forberedelse af levedygtige, friske og isolerede DSM-celler udgør en vigtig teknisk udfordring, hvis præstation giver optimale celler til efterfølgende funktionelle og molekylære undersøgelser. Metoden udviklet og udarbejdet heri, med succes brugt af vores gruppe i over et årti, beskriver dissektion af humane urinblære prøver fremstillet af åbne blæreoperationer efterfulgt af en enzymatic to-trins behandling af DSM stykker og mekanisk trituration for at opnå frisk isolerede DSM celler. Det første skridt indebærer dissektion at adskille DSM lag (også kendt som muscularis propria) fra slimhinde (urothelium, lamina propria, og muscularis mucosa) og den tilstødende bindevæv, vaskulære, og fedtvæv til stede. DSM skæres derefter i stykker (2-3 mm x 4-6 mm) i nominel Ca2+-indeholdende dissektions-/fordøjelsesopløsning (DS). DSM stykker er næste overføres til og sekventialt behandlet separat med DS indeholder papain og kollagen nase på ~ 37 °C for 30-45 min pr trin. Efter vasker med DS indeholdende enzym-fri kvæg serum og trituration med en brand-poleret pipette, stykkerne frigive enkelt DSM celler. Friskisolerede DSM-celler er velegnede til patch-clamp elektrofysiologiske og farmakologiske karakteriseringer af ionkanaler. Konkret viser vi, at TRPM4 kanal blocker 9-phenanthrol reducerer spænding-trin fremkaldte kation strømme registreres med amphotericin-B perforeret patch-clamp tilgang. DSM celler kan også studeres ved andre teknikker såsom enkelt celle RT-PCR, microarray analyse, immuncytokemi, in situ nærhed ligation assay, og Ca2 + billeddannelse. Den største fordel ved at udnytte enkelte DSM-celler er, at de fremstillede observationer direkte vedrører enkeltcelleegenskaber, der afsløres. Undersøgelser af friskisolerede humane DSM-celler har givet vigtig indsigt, der karakteriserer egenskaberne ved forskellige ionkanaler, herunder kation-permeable i urinblæren og vil fortsætte som en guldstandard i at belyse DSM cellulære egenskaber og regulerende mekanismer.

Enzymatisk dissociation af DSM stykker giver sunde friskisolerede DSM celler rutinemæssigt anvendes i funktionelle og molekylære undersøgelser såsom: patch-clamp elektrofysiologi og immuncytokemi. Figur 1 opsummerer dissektionstrinnene og visualiserer de opsætninger, der anvendes til temperaturkontrol af enzymatiske behandlingstrin. Figur 2 illustrerer lyse billeder af DSM-celler fra tre humane urinblæreprøver hver fra en anden patientdonor. Sunde enkelt DSM celler er kendetegnet ved spindelformet morfologi, sprøde veldefinerede kanter, en veldefineret glorie omkring cellen, og semi-kontraktile (serpentin-lignende) udseende, når de ses under mikroskopet (se DSM celler markeret med hvide pile i figur 2). De reagerer også på sammentrækning stimulerende midler såsom muskarinic agonist carbachol eller høj K+ (60 mM) applikationer. DSM-celler udviser positiv immunreaktivitet for α-glat muskelactin, der bekræfter deres identitet (figur 3).
DSM celler er velegnet til patch-clamp elektrofysiologiske undersøgelser af ion kanal egenskaber. Her beskriver vi amphotericin-B perforeret patch-clamp optagelse metode ved hjælp af pipette og ekstracellulære løsninger (Tabel 2) til optimalt at registrere spænding-trin induceret kation kanaler. Under de specifikke betingelser, der anvendes, blokerede Kv og L-type Ca2+ strømme med henholdsvis Cs+/TEA+ og nifedipin, at disse ioniske komponenter ser bort til de hele cellespændingsfremkaldte strømme. Figur 4 og figur 5 viser henholdsvis de eksperimentelle trin i amphotericin-B perforeret patch-clamp metode og repræsentative hele cellestrømme målt enten med en spænding-trin induceret eller en rampe protokol i tre forskellige menneskelige DSM celler, hver fra en anden patient donor. Bemærk, at optagelserne viser en vis grad af variabilitet i form af aktuelle amplitudes og passiv berigtigelse. Yderligere forsøg viste, at 9-phenanthrol, en TRPM4 kanalhæmmer, effektivt og reversibelt hæmmet menneskelige DSM kation strømme ved negative og positive spændinger (Figur 6). Den 9-phenanthrol-følsomme strømkomponent illustrerer en stærkere hæmning ved positive spændinger og udbedring (figur 6C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig01.jpg"> Figur 1: Resumé af diskæmningstrin, der resulterer i fremstilling af detrusor-glatte muskeldele (DSM) og opsætning, der anvendes til enzymatisk dissociation. Vist er billeder af: (A)en hel tykkelse menneskelige urinblære prøve fra en åben blære kirurgi som uvedkommende kirurgisk materiale i iskold DS,b) samme præparat efter fastgørelse med et delvist dissekeret DSM-lag (C) DSM-stykker af variable dimensioner skåret ud fra DSM-laget, der er klar til enzymatisk fordøjelse (mindre stykker) eller andre eksperimentelle undersøgelser (større stykker), (D, E) alternative opsætninger, der anvendes til enzymatisk nedbrydning af DSM-stykker, der består af enten 1) et temperaturstyret cirkulerende vandbad, der er forbundet via slanger til et stort glasvævskammer fyldt med vand en gummiholder til rør, plastrør indeholdende DSM-stykker og enzymopløsninger fremstillet i dissektions-/fordøjelsesopløsning (DS, enten DS-P eller DS-C, tabel 2) og en temperatursonde, der er forbundet med en skærm, der giver mulighed for kontinuerlig overvågning (D) eller (2) et stort vandfyldt temperaturstyret bad, der indeholder en holder og rør med DSM-stykker og enzymopløsninger (E ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig02.jpg"> Figur 2: Repræsentative lyse feltbilleder af humane friskisolerede DSM-celler, der er opnået ved hjælp af den sekventielle papain-kollagennedbrydningsmetode. (A-F) Vises er billeder af levedygtige, fysiologisk aktive DSM-celler betragtes som egnede kandidater til forsøg perforeret patch-clamp optagelser. (G, H) Billeder af ikke-levedygtige eller overfordøjede celler; sådanne celler blev undgået til patch-clamp eksperimenter. Hvide og sorte pile i paneler (A-H) peger på Henholdsvis DSM-celler, der betragtes som levedygtige og ikke-levedygtige, til forsøg på patch-clamp-optagelser. Bemærk, at de sorte pile i paneler (A, C og G) peger på cellefragmenter (cirkulære stykker) eller små celler mangler DSM morfologi og i (H) cellerne synes bleg og forstørret. Billederne er fra tre forskellige urinblæreprøver(A og B : patientdonorkilde 1, C og D : patientdonorkilde to og E-H : patientdonorkilde tre). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig03.jpg"> Figur 3: Udtryk for forbigående receptor potentielme melastatin type 4 (TRPM4) kanal og α-glat muskelspecifikke actin immunreaktiviteter i enkelt humane DSM-celler ved immuncytokemi analyse. (A) Vist er konfokale billeder, der viser immuncytokemisk påvisning af TRPM4 kanal protein udtryk i en menneskelig DSM celle. Rød farvning (nederst til venstre) angiver TRPM4 kanal proteiner; blå (DAPI) farvning registrerer cellekerner (øverst til venstre); grøn farvning indikerer α-glat muskel actin (α-SMA, øverst til højre); det flettede billede (nederst til højre) illustrerer overlapningen af alle tre billeder. (B) Konfokale billeder, der illustrerer dæmpning af immuncytokemisk påvisning af Proteinudtryk for TRPM4-kanaler i nærværelse af et TRPM4-specifikt konkurrerende peptid (CP) i isolerede humane DSM-celler. Blå (DAPI) farvning angiver cellekerner (øverst til venstre); grøn farvning er for α-glat muskel actin (α-SMA, øverst til højre); det flettede billede (nederst til højre) illustrerer overlapningen af alle tre billeder. Resultaterne blev verificeret i fire separate forsøg ved hjælp af DSM hele væv eller flere DSM celler isoleret fra fire patienter. Billeder er fra Hristov et al. (2016)22 og bruges med tilladelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig04.jpg"> Figur 4: Skematisk illustration af trin involveret i giga-sæl dannelse og amphotericin-B perforering af humane DSM celler. Illustreret er rumlige positioner af en amphotericin-B indeholdende pipette og en DSM celle sammen med tilhørende reaktioner for membran test opnået i den kommercielle erhvervelse software(Tabel over materialer)ved at ændre spændingtrin (enten -10 eller -20 mV i dette eksempel) bestemme modstand. Konfigurationer er: (A) før celleindflyvning med en elektrode,B) efter giga-tætningsdannelse opnået ved at placere amphotericin-B indeholdende pipette (amphotericin-B, der er repræsenteret ved røde prikker) på celleoverfladen og påtryk ,c)har den oncellens konfiguration, der er vist ~ 45 min efter giga-tætningsdannelse, på dette tidspunkt spredt pipette, og dens molekyler er indsat i plasmamembranen ved spidsen af elektrodedannelsen, der danner gennemtrængelige porer, og (D) den samme konfiguration som i (C), men med kapacitans transienter annulleret ved hjælp af ringer til hele celle kapacitans og serie modstand på forstærkeren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig05.jpg"> Figur 5: Helecellekationsstrømme registreret med amphotericin-B perforeret patch-clamp metode i humane DSM-celler. A) Et diagram over spændingstrinsprotokollen illustrerer et holdepotentiale på -74 mV og spændingstrin på 400 ms varighed fra -94 til +96 mV udført i 10 mV-intervaller og derefter returneret til -74 mV. (B, C) Repræsentative strømspor sammen med strømtæthed-spænding plots fra to forskellige humane DSM celler, hver fra en anden urinblære prøve / patient-donor opnået med spænding-trin protokol beskrevet i (A). D) Et eksempel på et aktuelt spor, der er opnået med en rampeprotokol (grafisk repræsenteret i topstarten som spændingsskift fra -94 til +116 mV over en varighed på 1 mV/ms, bedriftspotentiale var -94 mV). Til højre i paneler (B-D) viser graferne det aktuelle tæthedsspændingsforhold for hver DSM-celle, der registreres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig06.jpg"> Figur 6: TRPM4 kanalblokker 9-phenanthrol-medieret hæmning af spænding-trin induceret kation strømme i humane DSM celler. (A) Vist er repræsentative strømme målt med den spændingstrinprotokol, der er beskrevet i fig. 5A for kontrol, 9-phenanthrol og udvaskning. (B) Resumé af normaliserede reaktioner versus spænding til kontrol, 9-phenanthrol, og udvaskning i syv DSM celler (fra syv forskellige patient-donorer). C) Forskelsstrøm for 9-phenanthrol-følsom komponent fremstillet ved at trække værdierne i tilfælde af 9-phenanthrol (30 μM) fra de i litraB) anfoert kontrol . Data i (B) og (C) vises som midler med fejlstænger for SEM * viser betydning (p<0.05, parret Student's test) til sammenligning af kontrol vs 9-phenanthrol ved hver spænding. Paneler (A) og(B) er gengivet fra Hristov et al. (2016)22 og brugt med tilladelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>Arter</td>
			<td colspan="2">Oplysninger om procedure</td>
			<td>Referencer</td>
		</tr><tr><td>Marsvin</td>
			<td colspan="2">DSM stykker skyllet med Ca2 +-fri medium (i mM: 100 NaCl, 10 KCl, 1,2 KH2PO4,5 MgCl2, 20 glukose, 50 taurin, målt pCa = 6 (eller 1 mM) og derefter skæres i stykker og behandles typisk 90-120 min (4 perioder på 30 min) med medium enzym (i mM: 130 KOH, 20 taurin, 5 pyruvat, 5 kreatin, 10 mM HEPES, justeret med methansulfonsyre til pH 7,4, 1 mg/ml kollagen, 0,2 mg/ml pronase E, 1 mg/ml fedtsyrefri albumin, pCa=4.2 (63 mM) eller 3,7 (200 mM). Enkelt DSM-celler blev opbevaret i Kraft-Bruhe (KB)-medium (i mM: 85 KCl, 30 K2PO4, 5 MgSO4, 5 Na2ATP, 5 K-pyruvat, 5 kreatin, 20 taurin, 5 beta-OH-butyrate, 1 mg/ml fedtsyre fri albumin, justeret med KOH til pH 7,2). Alternativ metode: DSM stykker skyllet i 10 min i en Ca2 +-frimedium (i mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgCl2, 10 glukose, 20 taurin, 5 HEPES, justeret med NaOH til pH 7,4). Derefter inkuberes DSM-stykker, der er inkuberet i det samme Ca2+-gratis medium suppleret med 5 mg% kollagen, 2 mg% pronase og 100 μM CaCl2 for 2x20 min omrøring.</td>
			<td>Klockner & Isenberg (1985)13,34 Klockner & Isenberg (1986)35 Schneider et al. (1991)10 Bonev & Isenberg (1992)9 Weidelt & Isenberg (2000)36 Moore et al. (2004)14
</td>
		</tr><tr><td>Marsvin, Landrace-svin og humant</td>
			<td colspan="2">DSM stykker præ-inkuberet i 5 min i Ca2 +-fri Krebs opløsning derefter skæres i stykker og enzymatisk fordøjet i Ca2 +-fri Krebs opløsning, der indeholder 0,5-2 mg/ml kollagen type I og 0,1-0,5 mg/ml pronase ved 36 ° C i 20-30 min konstant omrørt. I nogle tilfælde blev fordøjede stykker yderligere ophidset af en stump tippet pipette eller ved at spinne, indtil de gav celler. Isolerede celler blev opbevaret i modificeret Krebs-opløsning (beskrevet i Klockner & Isenberg13) og blev normalt anvendt inden for 3 timer. Sammensætningen af Krebs opløsningvar (mM): 140 Na+,6 K+, 2 Ca2+, 1,2 Mg2 +, 152,4 Cl-, 10 glukose, 10 HEPES, pH 7,35-7,4 med Tris. For Ca2+-fri opløsning blev Ca2+ og Mg2+ udeladt fra Krebs-opløsningen.</td>
			<td>Inoue & Brading (1990)37 Inoue & Brading (1991)38 Nakayama & Brading (1995)39,40</td>
		</tr><tr><td>Menneskelige</td>
			<td colspan="2">DSM stykker placeret i Ca2 +-fri HEPES Tyrode's løsning (i mM: 105.4 NaCl, 20,0 eller 22,3 NaHCO3, 3,6 KCl, 0,9 MgCl2, 0,4 NaH2PO4, 19,5 eller 4,9 HEPES, 5,4 eller 5,5 glukose, 4,5 eller 5,5 Na-pyruvat) og skæres i DSM stykker. DSM-stykker dyppet i en enzymopløsning (Ca2+ gratis HEPES-opløsning med 0,7 mg/ml kollagentype I, 0,7 mg/ml papain, 1 mg/ml albumin) natten over ved 4°C. Strimlerne blev derefter opvarmet ved 36,5 °C i 15 til 30 min. vaskes og tritureres forsigtigt i frisk opløsning. Isolerede celler, der blev opbevaret i Ca2+ indeholdende HEPES Tyrodes opløsning eller anvendes straks til forsøg.</td>
			<td>Montgomery & Fry (1992)24 Gallegos and Fry (1994)41 Fry et al. (1994)42 Sui et al. (2001)43 Wu et al. (2002)44
</td>
		</tr><tr><td>Marsvin</td>
			<td colspan="2">DSM skåret i stykker i PSS (i mM: 137 NaCl, 5,4 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2, 0,42 KH2P04, 4,17 NaHCO3, 10 glukose, 10 HEPES, pH 7,4 med NaOH). DSM stykker placeret i 10 min i følgende fordøjelsesopløsning (i mM: 80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glucose, 2 MgCl2og 0,2 CaCl2) og derefter overføres til et hætteglas, der indeholder samme opløsning, men med 1 mg/ml kollagen 2, 1 mg/ml trypsinhæmmer (undertiden udeladt), 1 mg/ml fedtfri kvægalbumin, for ~ 70 min ved 35 °C eller ~60 min ved 37°C. Enkelte DSM-celler blev opnået ved trituration gennem en Pasteur pipette i samme opløsning uden calcium og enzymer. Efter trituration blev Ca2+ (1 mM) tilføjet, og cellerne blev opbevaret ved 4°C. Cellerne blev altid brugt samme dag.</td>
			<td>Bonev & Nelson (1993)53,54 Heppner et al. (1997)26 Petkov et al. (2001)47 Shieh et al. (2001, 2007)48,49
</td>
		</tr><tr><td>Marsvin, mus, rotte og menneskelige</td>
			<td colspan="2">Protokol anvender en to-trins enzymatisk dissociation behandling efter skarp dissektion i Ca2 +-fri fordøjelse løsning (i mM: 80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glukose, og 2 MgCl2). Først blev DSM-stykker behandlet i 25-45 min ved 37°C med 1-2 mg/ml papain, 1 mg/ml dithioerythreitol og 1 mg/ml kvægserumalbumin i opløsning (i mM: 80 mononatriumglutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 2 MgCl2,10 HEPES og 10 glukose, justeret til pH 7.3 med NaOH) og derefter DSM stykker overført til fordøjelsesopløsning, der indeholder 1-5 mg/ml kollagen XI (Sigma) eller collagenase type 2, 1 mg/ml kvæg serum albumin, 0 eller 1 mg/ml trypsinhæmmer og 100 μMCa2+, i 6-30 min. Efter inkubationblev det fordøjede væv vasket flere gange i fordøjelsesopløsning uden enzymer og Ca2+ og derefter forsigtigt tritureret til at give enkelte glatte muskelceller.</td>
			<td>Petkov et al. (2001)50 Thorneloe & Nelson (2003)51 Thorneloe & Nelson (2004)33 Petkov & Nelson (2005)27 Hristov et al. (2008)52 Layne et al. (2010)53 Hristov et al. (2011)15 Xin et al. (2012)54 Parajuli et al. (2012)25 Malysz et al. (2013)29 Parajuli et al. (2013)31 Lee et al. (2013)55 Malysz et al. (2014)23 Smith et al. (2013)19, 20 Hristov et al. (2016)22 Lee et al. (2017)56 Yarotskyy et al. (2018)57
</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Oversigt over enzymatiske tilgange, der anvendes til isolering af enkelte DSM-celler fra urinblærer af forskellige arter.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Løsningstype</td>
			<td>Sammensætning (i mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS (DS (Dissektion/fordøjelsesløsning)</td>
			<td>80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2, og 11 glukose, pH justeret til 7,4 (med 10 M NaOH)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-P (Papain-holdige DS)</td>
			<td>DS indeholdende 1-2 mg/ml papain, 1 mg/ml dithiothreitol og 1 mg/ml kvægserumalbumin</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-C (Kollagen-holdige DS)</td>
			<td>DS-opløsning indeholdende 1-2 mg/ml kollagentype II, 1 mg/ml kvægserumalbumin, 0 eller 1 mg/ml trypsinhæmmer og 100-200 μM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>P (Pipette)</td>
			<td>110 CsOH, 110 aspartisyre, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA og 30 CsCl,pH justeret til 7,2 med CsOH, og suppleret med amphotericin-B (300-500 μg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E (Ekstracellulært)</td>
			<td>10 tetraethylammoniumchlorid (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES og 10 glucose, pH justeret til 7.3-7.4 med NaOH eller CsOH, og 0,002-3 (2-3 mM) nifedpinei</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Sammensætninger af dissektions-/fordøjelsesopløsning (DS) og pipetterings- og ekstracellulære opløsninger, der anvendes i perforerede patch-clamp-eksperimenter.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

Vi beskriver en metode til fremstilling af enkelt friskisolerede detrusor glatte muskelceller fra humane urinblære prøver anvender en to-trins enzymatisk procedure. De opnåede levedygtige DSM-celler kan studeres ved forskellige enkeltcelleteknikker, herunder den beskrevne amphotericin-B patch-clamp elektrofysiologi for at afsløre fysiologiske og farmakologiske egenskaber.

Forberedelse og udnyttelse af friskisolerede menneskelige detrusor glatte muskelceller til karakterisering af 9-Phenanthrol-følsomme kation strømme

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...

Detrusor glatte muskelceller danner væggen af urinblæren, der i sidste ende letter urin voiding og opbevaring. Vores protokol giver en valideret og pålidelig metode til frisk isolering af enkelt glatte muskelceller. Friskisolerede humane detrusor glatte muskelceller giver mulighed for elektrofysiologiske og molekylære undersøgelser på enkeltcelleniveau.Ved at studere enkelt detrusor glatte muskelceller fra kontrol, normal, og syge menneskelige urinblærer, vi har mulighed for at validere farmakologiske mål såsom ion kanaler. Enkelt human detrusor glatte muskelceller er ideelle til elektrofysiologiske eksperimenter såsom patch-clamp elektrofysiologi. Her vil vi præsentere et eksempel på at studere en enkelt ionkanal ved navn TRPM4, forbigående receptor potentiel melastatin fire kanal, som er en ikke-selektiv kation kanal.Nybegyndere kan kæmpe med dissektion og enzymatisk behandling skridt, som kræver effektivitet og fortrolighed, herunder anerkendelse af kritiske vigtige skridt for at opnå friske isolerede DSM-celler. Det er vigtigt at være fortrolig med human blære histologi, protokol trin til isolering af enkelte celler forbliver modstandsdygtige, og i første omgang forventer at få suboptimale celler ved hjælp af denne protokol. Begynd med at undersøge hele tykkelsen urinblære prøve.Prøven, slimhinden vender opad og serosa ned på en silikone-enantiomer-belagt 150 mm rund skål fyldt med iskold DS og fjern forsigtigt hele slimhinden ved skarp dissektion. Skær flere slimhinder-fri detrusor glat muskel eller DSM stykker. Placer tre til seks DSM stykker i et rør med en til to milliliter forvarmte DS indeholdende papain og dithiothreitol, eller DS-P.Inkuber dem ved 37 grader Celsius i 30 til 45 minutter, og sørg for at ryste røret hver 10 til 15 minutter. Efter inkubationen fjernes DS-P fra røret og DSM-stykkerne vaskes kort med iskold DS. Overfør DS med DSM stykker til et nyt rør og fjern DS, forlader DSM stykker i bunden af røret. Der føjes en til to milliliter DS, der indeholder kollagentype II, eller DS-C, til røret.Og inkubere det ved 37 grader Celsius med lejlighedsvis rystelser. Kassér DS-C og vask de enzymbehandlede DSM-stykker fem til 10 gange med iskold DS. Efter den sidste vask forlade DS inde i røret, og forsigtigt triturere stykkerne med en brand-poleret Pasteur pipette til at frigive enkelt DSM celler. Pipette 0,25 til en milliliter celleaffjedring på et glasbundskammer, der sidder på scenen af et omvendt mikroskop, og inkubere det i mindst 45 minutter, så cellerne kan klæbe.Fjern derefter DS fra badet og udskift den med E-opløsning via superfusion. Træk flere patch elektroder, brand-polere elektrode tips, og pels spidserne i dental voks, hvis det er nødvendigt. Fyld spidsen af en plasterelektrode med pipettens opløsning uden amphotericin-B ved kort at dyppe elektroden i opløsningen.Succes patch clamp elektrofysiologi afhænger af DSM cellekvalitet og amphotericin-B opløselighed. Opfyld elektroden med samme pipetteopløsning, der indeholder amphotericin-B, og monter elektroden på en holder, der er tilsluttet en patch clamp forstærkerhovedfase. Brug en mikromanipulator til at placere elektroden lige under overfladen af den ekstracellulære opløsning, så spidsen af elektroden er lige nedsænket.Derefter bestemme elektrodemodstanden ved hjælp af membrantestvinduets funktion af den kommercielle anskaffelsessoftware og fremme elektroden mod den celle af interesse. Når du rører ved celleoverfladen med elektroden, dannes der en giga-forsegling ved at påføre elektroden let hurtigt undertryk via slangen. Dette resulterer i undertryk på spidsen af elektroden resulterer i en vellykket giga-tætning som bekræftet af membrantesten.Der skal gå 30 til 60 minutter, før amphotericin-B kan diffuse ned i pipetten og indsættes i plasmamembranen, der danner porerne, der primært er selektive til monovalente kationer. Fortsæt overvågningen af giga-forseglingen med membrantestfunktionen. Når plasterets perforering er optimal, skal kapacitanstransienterne annulleres ved at justere drejeskiverne for cellekapacitans og seriemodstand på forstærkeren.Når de stabile spændingstrins-kationstrømer er observeret, registreres strømme med routingspændingstrinprotokollen som beskrevet i manuskriptet. Påfør en forbindelse eller en fysiologisk test tilstand til at teste ved superfusion og registrere svarene for kontrol og test betingelser samt udvaskning. Denne protokol kan bruges til at isolere sunde, friske DSM-celler til funktionelle og molekylære undersøgelser.Sunde enkelt DSM celler er karakteriseret ved spindelformet morfologi, sprøde veldefinerede kanter, en veldefineret glorie omkring cellen og semi-kontraktile udseende, når det ses under mikroskopet. Desuden reagerer de nyisolerede DSM-celler på mekanisk stimulering og carbachol. Cellefragmenter og ikke-levedygtige eller overfordøjede celler bør undgås i efterfølgende patch-clamp-eksperimenter.De isolerede celler er blevet anvendt i amphotericin-B perforerede patch-clamp eksperimenter, hvor helcellestrøm blev målt med enten en spænding-trin induceret eller rampe protokol i tre forskellige menneskelige DSM celler. Eksperimenter viste, at 9-phenanthrol, en TRPM4 kanalhæmmer, effektivt og reversibilt hæmmet menneskelige DSM kation strømme. Den 9-phenanthrol-følsomme strømkomponent illustrerer en stærkere hæmning ved positive spændinger og udadgående berigtigelse.Tilstand af enzymatiske behandlingstrin, trin 2.2 og 2.3, herunder temperatur, varighed af enzymbehandlinger, enzym lotkilder og kvaliteten af DSM-celler, er vigtige determinanter for at opnå menneskelige DSM-celler af høj kvalitet. Humane DSM-celler er også velegnet til at evaluere intracellulære sekunder messenger niveauer, herunder calcium og cyklisk AMP, detektering protein ekspressioner ved immunocytokemi, og co-ekspression ved in situ proksimale retssager assay, og mRNA udtryk ved RT-PCR, qRT-PCR, microarrays, og næste generation sekventering. Humane DSM celler har avancerede vores forståelse af roller BK, calcium, TRPM4 kanaler i urinblæren.Fremtidige udviklinger vil gøre det muligt specifikt at forbinde elektrofysiologiske eller farmakologiske egenskaber med transcriptome eller proteome profiler.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Vurdering af kontraktilitet, udmattelse og Alternans i isoleret skeletmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolering af pulmonal glatte muskelceller fra Neonatal Mus

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Måling af Glat muskel funktion i den isolerede vævsbad-ansøgninger til Farmakologi Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

To-foton Imaging af intracellulære Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Håndtering og nitrogenoxid Produktion i Endothelial og glatte muskelceller af en isoleret rotteaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Single-channel Analyse og Calcium Imaging i podocytterne af frisk isolerede glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Måling af calcium Udsving Inden for reticulum af dyrkede glatte muskelceller Brug FRET-baserede Konfokal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering af murint koronar vaskulær glat muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...