Name: preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents
Uploaded: 2020-01-31T12:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH-R01DK106964 en P20DK123971 subsidies aan Georgi V. Petkov. De auteurs danken Dr Viktor Yarotskyy en Mevrouw Sarah Maxwell voor kritische evaluatie van het manuscript. We zijn ook dankbaar voor urologie staf chirurgen bij MUSC en UTHSC: Drs. Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter, en Anthony Patterson evenals de MUSC en UTHSC Urologie bewoners: Drs. Taylor Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O'Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata voor hun hulp bij menselijke weefselinzameling.

Alle methoden die hier zijn beschreven zijn goedgekeurd door institutional Review Board Committees van de University of Tennessee Health Science Center (Memphis, TN, IRB # 17-05714-XP), en de Medische Universiteit van South Carolina (Charleston, SC, IRB # 00045232). De goedgekeurde procedures maken hele dikte urineblaasspecimens (>1 cm bij >1 cm) - met alle lagen inclusief slijmvlies, detrusor gladde spier, en serosa ook zijn bevestigd bloedvaten en vetweefsel) - worden verzameld van patiënten-donoren ondergaan chirurgische gedeeltelijke extractie van blaas. Patiënten-donoren zijn volwassen (leeftijdscategorie bestudeerd tot nu toe: 25 tot 87 jaar oud), hetzij mannelijke of vrouwelijke, met of zonder symptomen van overactieve blaas (zoals ingedeeld door american Urological Association I-PSS score41). Chirurgische ingrepen omvatten een verscheidenheid van medische aandoeningen, waaronder radicale cystectomie voor urotheliale carcinoma, en adenocarcinoma. In dergelijke gevallen is het verzamelde urineblaasmonster ver verwijderd van de plaats van tumor.
1. Dissectie van DSM-weefsels en bereiding van mucosa-vrije DSM-stukken
<ol><li>Onderzoek het hele dikteurineblaasmonster dat vanuit de operatiekamer in het lab is aangekomen in een goed afgesloten container gevuld met de koude dissectie/spijsverteringsoplossing(figuur 1 en tabel 2 voor samenstelling van DS). LET OP: Het monster wordt meestal bewaard in koude DS van een paar uur tot 's nachts voor aankomst in het laboratorium. Voor langere opslag wordt DS (tabel 2) aangevuld met 1 mM CaCl2.</li>
	<li>Verwijder en spoel het menselijk DSM-exemplaar met de hele dikte (met alle lagen inclusief slijmvlies, DSM en serosa) met ijskoude DS om vast vuil en bloed uit te wassen.</li>
	<li>Pin de urineblaas specimen, slijmvlies naar boven en serosa naar beneden, op een siliconen enantiomer-gecoate (Tabel van materialen) 150 mm diameter ronde schotel gevuld met ijskoude DS ( Figuur1B).</li>
	<li>Verwijder het aangrenzende vetweefsel, bloedvaten, epitheel (urothelium) en spierslijmvlies uit het monster door scherpe dissectie met behulp van microschaar en tangen.</li>
	<li>Knip verschillende slijmvrije DSM-stukken uit (~ 2-3 mm lang en 4-6 mm breed) (figuur 1C).</li>
</ol>2. Enzymatische dissociatie van DSM-stukken die vers geïsoleerde enkele DSM-cellen opleveren
<ol><li>Plaats 3 tot 6 DSM-stukken in een buis met 1 tot 2 mL voorverwarmde (~37 °C) DS met papaïne en dithiothreitol (DS-P, tabel 2)en incubeer DSM-stukken in DS-P voor 30-45 min bij ~37 °C zachtjes schudden de buis af en toe (eenmaal per 10-15 min). OPMERKING: Om de temperatuur voor enzymatische behandeling optimaal te regelen, worden buizen met weefselstukken en enzymoplossingen geplaatst in een glazen weefselkamer gevuld met water dat is aangesloten op een circulerend verwarmd waterbad(figuur 1D)of een hoognauwkeurig temperatuurgestuurd schudwaterbad(figuur 1E).</li>
	<li>Verwijder DS-P uit de buis, was kort DSM-stukken met ijskoude DS, gooi koude DS uit de buis en laat DSM-stukken aan de onderkant van de buis zitten.</li>
	<li>Voeg 1 tot 2 mL DS-bevattende collageen type II (DS-C, tabel 2)toe aan de buis met DSM-stukken, meng zachtjes; en uitbroed en voor 25-40 min bij ~37 °C zachtjes schudden van de buis af en toe (elke 10-15 min).</li>
	<li>Gooi DS-C weg en was enzymbehandelde DSM-stukken 5-10 keer met ijskoude DS.</li>
	<li>Laat na de laatste wasbeurt de DS-oplossing in de buis achter; voorzichtig triturate met een vuurgepolijste Pasteur pipet meerdere malen om enkele DSM cellen vrij te geven.</li>
	<li>Plaats een paar druppels DS-oplossing met verspreide DSM-cellen op een glazen bodemkamer of een coverslip en controleer visueel op de kwaliteit onder een microscoop (met behulp van een 20x of 40x-doelstelling) na ten minste 5 minuten na de toepassing om de cellen in staat te stellen zich aan de de bodem.</li>
	<li>Gebruik onmiddellijk vers geïsoleerde DSM-cellen voor elektrofysiologische experimenten of bewaar de cellen in een buis met DS bij ~4 °C op ijs of in een koelkast tot gebruik (meestal voor maximaal 8 uur voorbereiding). OPMERKING: Binnen hetzelfde preparaat varieert de kwaliteit van cellen van zeer levensvatbare tot oververteerde, dode DSM-cellen(figuur 2). Wanneer de sequentiële papain-collagenase methode een zeer hoog aantal niet-levensvatbare cellen oplevert, wordt het preparaat weggegooid en wordt een nieuwe vertering van DSM-stukken uitgevoerd, maar met verminderde incubatieintervallen. Als de procedure resulteert in te weinig DSM-cellen dan voor de daaropvolgende vertering van DSM-stukken, worden de incubatieintervallen verhoogd. Positieve immunoreactiviteit voor α-gladde spieractine bevestigt de identiteit van DSM-cellen (figuur 3).</li>
</ol>3. Het registreren van spannings-stap geïnduceerde kation stromen van DSM cellen met behulp van amphotericine-B geperforeerde hele cel spanning patch-klem techniek
<ol><li>Pipetteer 0,25-1 mL celvering op een glazen bodemkamer zittend op een podium van een omgekeerde microscoop en laat de cellen zich aan de glazen bodem hechten.</li>
	<li>Verwijder DS na incubatie gedurende ten minste 45 min uit het bad en vervang door de E-oplossing (tabel 2) door superfusie waarbij de oplossingstroom die door de zwaartekracht wordt geholpen via inlaatbuizen vertragen DS vervangt door de nieuwe oplossing, terwijl uitlaatbuizen die zijn aangesloten op een vacuümafvalvat de kameroplossing verwijdert en overloop voorkomt. Merk op dat E-oplossing tetraethylammonium (TEA+) en cesium (Cs+) ionen bevat om K+ stromen te remmen.</li>
	<li>Bereid een werkvoorraadoplossing voor van amphotericine-B in dimethylsulfoxide (DMSO) (1 mg per 10 μL DMSO). Om amphotericine poeder volledig op te lossen, sonicate (minstens 15 min) en vortex de oplossing goed. OPMERKING: Deze stap duurt meestal minder dan 10 min. Het oplossen van 3-4 mg amphotericine-B in 30-40 μL DSMO in een 1,5 mL microcentrifuge buis werkt goed. Hogere hoeveelheden amphotericine-B vereisen meer DSMO-oplosmiddel meestal resulteert in een langer interval voor het mengen en onvolledige oplosbaarheid van de amphotericine-B vaste deeltjes aanwezig in de buis.</li>
	<li>Los de voorraadoplossing van amphotericine-B op in de pipetoplossing (oplossing P, tabel 2) om een eindconcentratie van 200-500 μg/mL te verkrijgen. Deze stap vereist uitgebreide sonicatie en vortexing bij een hoge snelheid instelling (8-10/10) voor ~ 30 tot 60 min per stap om een optimale mix en preventie van amphotericine-B neerslag vorming in de pipet oplossing te garanderen. OPMERKING: Amphotericin-B zal over-time neerslaan en lichtgevoelig is. De werkende pipetoplossing met Amphotericin-B wordt gecontroleerd op oplosbaarheid, met de hand gemengd voorafgaand aan pipetvulling en in het donker bewaard.</li>
	<li>Trek meerdere patch elektroden, vuur-poolse elektrode tips, en (indien nodig) jas de uiteinden met tandwas.</li>
	<li>Vul de punt van een patch elektrode met de pipet oplossing (oplossing P, Tabel 2) zonder amphotericine-B door kort dompelen de elektrode in de oplossing.</li>
	<li>Vul de elektrode terug met dezelfde pipetoplossing met amphotericin-B.</li>
	<li>Monteer de elektrode op een houder aangesloten op een patch-clamp versterker kopwerk.</li>
	<li>Plaats met behulp van een micromanipulator de elektrode net onder het oppervlak van de extracellulaire oplossing, zodat de punt van de elektrode net onder water staat.</li>
	<li>Stel in de spanningsklemmodus het houdpotentieel in op 0 mV en pas de stroom aan op 0 pA met de pipetoffsetwijzerplaat op de commerciële versterker(Table of Materials).</li>
	<li>Bepaal de elektrodeweerstand met behulp van het membrane testvenster/-functie van de commerciële acquisitiesoftware (Tabel met materialen). Klik op Extra>Membraantest>Afspelen of een snelpictogram in de software. De vastgestelde elektrodeweerstand moet zich tussen 2 en 5 MΩ bevinden. OPMERKING: Membraantestfunctie in de commerciële acquisitiesoftware of Seal Test-optie op de versterker kan worden gebruikt om de elektrodeweerstand te monitoren door spanningsstappen herhaaldelijk toe te passen.</li>
	<li>Blijf elektrodeweerstand monitoren terwijl u de elektrode naar een gekozen DSM-cel doorzet met een micromanipulator(figuur 4A). OPMERKING: Om als een levensvatbare DSM-cel te worden beschouwd, moet de cel spindelvormige langwerpige morfologie, een goed gedefinieerde halo rond de cel, scherpe randen en semi-contractiele (serpentine) verschijning vertonen.</li>
	<li>Bij het aanraken van het celoppervlak met de elektrode - aangegeven door een snelle toename van de elektrodeweerstand gemeten met de Membraantestfunctie - vorm je een giga-afdichting door zachte snelle negatieve druk op de elektrodehouder via buizen toe te passen. Dit resulteert in negatieve druk die ontstaat aan de punt van de elektrode die het celmembraan in elektrode trekt en helpt bij de vorming van een giga-afdichting of een zeer nauw contact tussen de elektrode en het plasmamembraan (figuur 4B).</li>
	<li>Zodra de giga-seal zich vormt, compenseert u pipetcapaciteit door snelle en langzame wijzerplaten op de commerciële versterker aan te passen en de giga-afdichtingsstabiliteit (lekstroom) te monitoren met behulp van de Membrane Test-functie.</li>
	<li>Laat tijd, meestal 30-60 min, voor amphotericin-B te verspreiden vaststelling van de pipet en worden ingevoegd in het plasma membraan vormen poriën voornamelijk selectief monovalent kationen. Tijdens deze stap u de giga-afdichting met de Membraantestfunctie blijven monitoren. Naarmate de celperforatie toeneemt, neemt ook de amplitude van de capacitantietransiënten (vergelijk figuur 4B versus figuur 4C, waarbij respectievelijk geen en effectieve celperforatie wordt weergegeven) gemeten met de functie Membraantest.</li>
	<li>Wanneer de patchperforatie optimaal is (beoordeeld op stabiele serieweerstand meestal onder de 50 MΩ), annuleer t.a.v. de capaciteitvan voorbijgaande aard door de wijzerplaten aan te passen voor celcapaciteit en serieweerstand op de versterker. Series weerstand compensatie kan ook worden uitgevoerd op dit moment(figuur 4D).</li>
	<li>Zodra stabiele spanningsstep geïnduceerde kationstromen die door het gespecificeerde protocol worden opgeroepen, een samengestelde of fysiologische toestand toepassen om te testen door superfusie en de reacties op de controle-, testconditie en washout (indien mogelijk) met de commerciële acquisitiesoftware.<ol>
<li>Record stromen met een routine voltage-step protocol dat dsm-cellen op -64 of -74 mV houdt en de spanning in stappen van 10 mV voor 400 of 500 ms van -94 tot +96 of +106 mV moet opvoeren en terug te keren naar het houdpotentieel. OPMERKING: De membraanpotentiële waarden worden aangepast voor een vloeibaar verbindingspotentieel van 14 mV (met behulp van P- en E-oplossingen, tabel 2). Het vloeistofverbindingspotentieel wordt verkregen in de commerciële acquisitiesoftware ( Table ofMaterials) door te klikken op (Tools>Junction Potentials) en de concentraties van oplossingsionencomponenten in te voeren. Een ramp protocol kan ook worden gebruikt om de huidige opnames te verkrijgen.</li>
		<li>Voer het spanningsprotocol uit in continu ~1 min-interval tijdens een experiment met het opnemen van stromen voor pre-toevoegingscontrole, testconditie en washout.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Gegevensanalyse en visualisatie
<ol><li>Open opgenomen bestanden in de commerciële data-analysesoftware(Tabel met materialen)voor de besturing, testconditie en washout door op Bestand>Gegevens te openen en bestanden van belang te selecteren voor het openen. OPMERKING: Voor analyse worden meestal drie bestanden (elk met één set traces naar één protocolrun) voor elke voorwaarde geopend en geanalyseerd. De antwoorden worden vervolgens gemiddeld om een gemiddelde reactie voor elke voorwaarde te verkrijgen. De software die wordt gebruikt voor het verkrijgen van gegevens bevat een optie om automatisch door de gebruiker opgegeven meerdere testruns te verzamelen en deze te gemiddelde voor een enkel uitvoerbestand dat als alternatief kan worden gebruikt.</li>
	<li>De gemiddelde respons over de laatste 200 ms verkrijgen voor het huidige spoor gemeten bij elke spanning; het gekozen duurinterval weerspiegelt een steady-state niveau van spanningsstap stroomactivering. Volg hiervoor de onderstaande stappen.<ol>
<li>Selecteer een bestand van belang voor analyse in de commerciële analysesoftware (Tabel met materialen). OPMERKING: De software plaatst het meest recent geïmporteerde bestand in het actieve weergavevenster. Het open bestand toont een reeks overlappende sporen verkregen met een voltage-step protocol. In het actieve venster worden standaard vier cursors (x- en y-waarden voor de gemarkeerde tracering weergegeven).</li>
		<li>Kies het bereik voor analyse door cursor 2 aan het einde van de spanningsstap van 400 of 500 ms en cursor 1 te positioneren met een interval van 200 ms daarvoor, zodat het analysebereik 200 ms bedraagt.</li>
		<li>Reacties voor elke spanning verkrijgen door te klikken op Analyseren>Snelle grafiek>IV (of het itemiaal-snelkoppelingspictogram) (in het promptvenster voordat gegevens worden verzameld, bevestigen dat voor y-axis (Current) signal Region opties "Cursors 1..2" en "Mean" zijn geselecteerd). Klik op OK om de I-V-grafiek te genereren en de gegevens in een kolomblad resultaten te plaatsen dat kan worden weergegeven door toegang te krijgen tot Windows>Resultaten.</li>
		<li>Analyseer extra bestanden door de stappen 4.2.1 - 4.2.3 te herhalen. Klik op Analyseren>Snelle grafiek>IV of de snelkoppeling iv-pictogram, selecteer Toevoegen in plaats van Vervangen om extra gegevens toe te voegen aan het deelvenster Resultaten bij het verwerken van de sporen.</li>
		<li>Kopieer gegevens naar een spreadsheet door de kolommen met interesse te selecteren en druk op Ctrl+C om te kopiëren en Ctrl+V om te plakken. Sla het werkblad Resultaten op in de indeling Commerciële analysesoftware(Tabel met materialen)in de indeling (*.rlt) door op Bestand>Opslaan alste klikken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normaliseer voor elke cel de antwoorden voor alle drie de omstandigheden op de waarde van de maximale spanningsstap voor de pre-addition controle (volgens de formule: Response/ResponseControl-Max)en grafiek de antwoorden als huidige (of huidige dichtheid) waarden versus spanningsverhoudingen(figuur 6).<ol>
<li>Bepaal in een werkbladprocessor de gemiddelde antwoorden als stromen (pA) of huidige dichtheden (pA/pF) voor controle, testconditie (in dit voorbeeld 9-fenanthrol) en washout bij elke spanningsstap.</li>
		<li>Verdeel waarden voor elke spanning van elke toestand (controle, 9-fenanthrol en washout) door de maximale controlerespons verkregen bij de hoogste spanning (+96 mV in figuur 6)voor de pre-toevoeging sturing volgens de formule: Genormaliseerde respons voor conditie(x) = Respons(x)/ ResponseControl-Max voor (x).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor overzichtsanalyse u de gegevens in een indeling rangschikken die eenvoudig naar een grafisch programma (bijvoorbeeld GraphPad Prism) kan worden gekopieerd voor visualisatie.</li>
</ol>

De hier beschreven procedures verklaren de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van levensvatbare, vers geïsoleerde DSM-cellen uit menselijke urineblaasmonsters met hele dikte met behulp van enzymatische spijsvertering en bij de registratie van hele celkationstromen die gevoelig zijn voor de TRPM4-kanaalremmer 9-fenanthrol met behulp van de geperforeerde patchklembenadering van amphotericin-B. De enzymatische procedure is gebaseerd op een sequentiële blootstelling in twee stappen die hierin wordt aangeduid als de sequentiële papain-collagenase vergistingsmethode. DSM weefsels worden eerst behandeld met papaïne en dithiothreitol (een enzym stabiliserende agent) onder een nominale Ca2 +-vrije toestand, gevolgd in de tweede stap door collagenase type II in aanwezigheid van lage Ca2 +. De reden voor het uitvoeren van papaïne spijsvertering onder lage Ca2 + voorwaarden in gladde spiercellen dateert uit de late jaren 1980. Vers geïsoleerde halsslagader gladde spiercellen bereid met papaïne weergegeven een langwerpige vorm, toonde levensvatbaarheid (weerstand tegen Trypan Blue opname) en reageerde op contractiele stimuli (hogere Ca2 + en histamine)65. Jaren later werd deze methode toegepast bij de bereiding van DSM-cellen (zie tabel 1). De keuze van collageen type II in plaats van andere soorten heeft betrekking op de relatief hoge proteolytische activiteit bij uitstek geschikt voor gladde spierweefsels, waaronder DSM. De behandeling van collageen kan immers alleen maar enkele DSM-cellen opleveren, zij het dat uitgebreide enzymblootstelling (≥60 min)53,54vereist. Aangezien collageenactiviteit afhankelijk is van Ca2+ en het enzym inactief is onder de Ca2+-vrije omstandigheden, vereist een optimale enzymatische vertering van DSM-stukken de aanwezigheid van Ca2+ 66. In ons geval bevat DS-C 100-200 μM [Ca2+] (Tabel 2). Na enzymatische behandeling worden verteerde DSM-stukken een aantal keren voorzichtig gewassen met koude DS zonder enzymen of Ca2+ om een enzym gebonden aan weefsels te verwijderen. De ijskoude DS helpt de dsm-celintegriteit te behouden en enzymatische activiteit van een resterende papaïne of collageenase te beperken. In de laatste stap, trituratie van enzym-behandelde DSM stukken met een brand gepolijst Pasteur pipet releases enkele DSM cel. DSM-cellen worden onmiddellijk op een opnamekamer geplaatst voor patch-clamp studies of andere soorten experimenten of opgeslagen op ijs in DS voor gebruik later op dezelfde dag (meestal binnen 8 uur na de voorbereiding, maar de cellen blijven levensvatbaar voor maximaal 24 uur).
We hebben een aantal belangrijke overwegingen geïdentificeerd voor het succesvol verkrijgen van enkele DSM-cellen. De eerste heeft betrekking op de menselijke DSM specimen bron kwaliteit. Om de weefselintegriteit optimaal te bewaren, worden DSM-monsters die zijn verkregen uit open blaasoperaties zo snel mogelijk in ijskoude DS geplaatst en in een koude omgeving onderhouden. Met name bij chirurgische extractie van de patiënt wordt het blaasmonster onmiddellijk op een volledig voorbereide bijzettafel in de operatiekamer geplaatst. Bruto onderzoek van het hele monster (meestal verkregen tijdens radicale of eenvoudige cystectomie) en de opening volgen. Na visuele inspectie wordt een stuk van hele dikte urineladder specimen verwijderd uit een afgelegen gebied van het monster schromelijk niet betrokken bij tumor en onmiddellijk geplaatst in een beker (50 of 100 mL) met koude (~ 4 °C) Dissectie Solution (DS) (Tabel 2) en vervolgens stevig gesloten met een deksel. Vanwege de geplande aard van de oogst van het weefsel worden het personeel van de operatiekamer en het hulppersoneel dat de oogst uitvoert aan het begin van de chirurgische zaak gewaarschuwd om de materialen beschikbaar te hebben in de operatiekamer op het moment van weefselextractie. Deze voorzorgsmaatregelen samen met de routine, repetitieve aard van de verwerking stappen houden de warme ischemie tijd voor het weefsel - van extractie tot plaatsing in de gekoelde container met DS-oplossing - tot minder dan 5 min. De container wordt vervolgens in een koelkast of op ijs in een koeler geplaatst om de koude omgeving te behouden en (ijskoud) naar het laboratorium te vervoeren. Zodra het monster in het laboratorium aankomt, beginnen dissectie en enzymatische dissociatiestappen. Het is zeer moeilijk te voorspellen of een bepaald DSM-exemplaar DSM-cellen van hoge kwaliteit zal opleveren na enzymatische dissociatie, dus gaan we verder met de enzymatische dissociatiestappen. In veel gevallen voert onze groep, parallel aan elektrofysiologische experimenten, isometrische spanningsopnamen uit op DSM-strips die zijn opgesteld uit dezelfde DSM-exemplaren. We hebben ontdekt dat we meestal dsm-cellen van hoge kwaliteit kunnen verkrijgen uit preparaten die ook met succes levensvatbare strips leveren voor isometrische contractiestudies (onze ongepubliceerde observatie).
De tweede factor heeft betrekking op verschillende enzymlotvariabiliteiten. We merkten op dat voor zowel papaïne als collageen type II, telkens wanneer er een nieuw enzym van een leverancier aankomt, de enzymactiviteit in DS voor weefselvertering kan variëren. Wij optimaliseren daarom routinematig de enzymconcentratie en incubatieintervallen voor elke nieuwe partij. Om de bijdrage van de partijvariabiliteit te minimaliseren, bestellen we grotere hoeveelheden van dezelfde partij en maken we een grote partij voorraadoplossingen in 2 mL aliquots enzymen en slaan ze op ~-20 °C tot het gebruik. Na verloop van tijd kunnen bevroren voorraden (opgeslagen tot 2 weken) echter hun enzymatische activiteit verliezen. De derde variabele heeft betrekking op de temperatuur van enzymspijsverteringsbehandelingen. Enzymatische activiteiten van zowel papaïne als collageen ase tonen temperatuurafhankelijkheid. Papaïne en collageen type II vertonen activiteit in de temperatuurbereiken die de normale lichaamsfysiologieomvatten 67,68. Daarom streven we ernaar om de enzymbehandelingen stabiel te houden bij ~ 37 °C om hogere temperaturen te vermijden om de dsm-celintegriteit te behouden. De vierde overweging betreft de variabiliteit van de kwaliteit van DSM-cellen die aanwezig zijn in elk preparaat, variërend van zeer levensvatbaar (vertonen uitstekende klassieke gladde spierkenmerken) tot niet-gezonde, oververteerde cellen. Een langdurig enzym incubatieinterval is een van de belangrijkste redenen voor het verkrijgen van een hoog aantal beschadigde cellen. Overmatige enzymbehandelingen schaden ook de eiwitstructuren van ionenkanalen, receptoren en transporters, die hun functionaliteit negatief beïnvloeden. Interpretatie van de resultaten verkregen uit enzymatisch verkregen, vers geïsoleerde cellen moet rekening houden met deze overweging. Optimalisatie van enzymvertering voorwaarden is gericht op het verhogen van het percentage van zeer levensvatbare cellen. Experimentele benaderingen die afhankelijk zijn van een hoger aantal levensvatbare cellen, zoals microarray-analyses, vereisen robuustere optimalisaties dan die met succes worden uitgevoerd op minder cellen, zoals eencellige patch-clamp elektrofysiologie of Ca2+ beeldvorming. De aandacht voor de bovengenoemde factoren heeft onze onderzoeksinspanningen in de afgelopen tien jaar geleid bij het verkrijgen van hoogwaardige enkele DSM-cellen.
De geperforeerde patch-klem techniek is al meer dan een kwart eeuw een steunpilaar elektrofysiologische benadering. Verschillende publicaties geven details over de technische overwegingen69,70,71,72,73. Celperforatie kan worden verkregen met amphotericine-B, nystatine, gramicidine of β-escine (zie referentie32voor overzicht van elk). Het belangrijkste voordeel van geperforeerde patch-klem opnames over andere elektrofysiologische benaderingen is dat de inheemse intracellulaire omgeving - met inbegrip van intracellulaire Ca2+en signaalmoleculen (bijvoorbeeld cAMP, PKA, fosfaten en fosfodiesterases) - worden bewaard. Deze techniek is dus bij uitstek geschikt voor het onderzoeken van hele cel ionenkanaalstromen en hun regulerende mechanismen onder bijna fysiologische omstandigheden. Een belangrijk voorbehoud is dat intracellulaire celsamenstelling niet precies kan worden gecontroleerd in tegenstelling tot andere elektrofysiologische methoden zoals conventionele whole-cell en single-channel excised-patch (binnen- en buiten-out) opnames. In onze ervaring dragen drie factoren routinematig bij aan succesvolle experimentele resultaten van geamputeerde patch-clamp experimenten. De eerste is de kwaliteit van de DSM-cel die is gekozen om een opname te proberen. Wanneer DSM-cellen zeer levensvatbaar zijn met een semi-contractiele (serpentine-achtige), hoog contrast glanzende verschijning met een goed gedefinieerde halo rond het celoppervlak en hechten strak aan de glazen bodem van de opnamekamer dan giga-seal vorming en cel perforatie optreden relatief eenvoudig. De tweede en derde factoren voor succes hebben respectievelijk betrekking op de kwaliteit van de bron en de oplosbaarheid van amphotericine-B (in dimethylsulfoxide/DMSO en intracellulaire pipetoplossing). We constateerden verschillen tussen verschillende leveranciers in termen van bron- en lotvariabiliteit. Elke dag bereiden we een nieuwe oplossing van amphotericine-B voorraad oplossing uit poeder, gevolgd door de verdunning in intracellulaire pipet oplossing. Deze stappen vereisen uitgebreide sonicatie en vortexing. Met vers gemaakte amphotericine-B-bevattende pipetoplossing, succesvolle celperforatie (<50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K mω)="" following="" giga-seal="" formation="" can="" be="" usually="" obtained="" within="" 30="" min.="" the="" concentration="" of="" amphotericin-b="" in="" the="" pipette="" solution="" also="" requires="" optimization="" dependent="" on="" the="" amphotericin-b="" lot="" and="" source.="" under="" our="" experimental="" conditions,="" the="" final="" amphotericin-b="" concentrations="" in="" the="" pipette="" range="" from="" 200="" to="" 500="" µg/ml.="" since="" amphotericin-b="" exhibits="" light="" sensitivity,="" its="" solutions="" need="" to="" be="" kept="" in="" the="" dark.="" using="" the="" amphotericin-b="" perforated="" patch-clamp="" technique,="" our="" group="" recorded="" voltage-step="" induced=""></50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K>+Ca2+, en niet-selectieve kationstromen uit menselijke, cavia's, muizen- en/of ratten-DSM-cellen17,21,22,23,29,30,31,35,60. Hier beschrijven we voorwaarden voor het registreren van niet-selectieve kationstromen in menselijke DSM-cellen. 9-Phenanthrol, een blokker van TRPM4 kanalen, verzwakte spanning-stap geïnduceerde stromen ter ondersteuning van de rol van deze kanalen in de controle van DSM prikkelbaarheid. Als opmerking, het vereist meestal ten minste 45 min na het verkrijgen van een giga-afdichting en initiatie van perforatie om een optimale stabiele spanning-stap geïnduceerde niet-selectieve kation stromen record. Spanningshellingen kunnen ook worden gebruikt als alternatief voor voltage-step protocollen30,64. Hier, een voltage-step protocol van een hypergepolariseerde bedrijf membraan potentieel werd de voorkeur in plaats van een helling protocol, omdat de voormalige aanpak minimaliseert het effect van spanning-afhankelijke inactivering en zorgt voor het gemiddelde van opgeroepen stroom over een duur van een spanningsstap waarbij de helling een enkel gegevenspunt per spanning biedt. Dit laatste punt geldt vooral voor menselijke DSM-cellen, omdat de stromen variabele activiteit vertonen tijdens spanningsstappen (Figuur 5EnFiguur 6). De geperforeerde patchklemtechniek van amphotericin-B is essentieel geweest bij het identificeren van de eigenschappen van DSM-cellen en andere celtypen en zal blijven helpen bij het bieden van nieuwe ontdekkingen in de toekomst. Bovendien kunnen vers geïsoleerde enkele DSM-cellen met succes worden gebruikt voor het meten van+Cl-, en Ca2+stromen met de conventionele modus van de patch-clamp techniek, membraan potentiële opname met de huidige klem, en single channel opnames zoals geïllustreerd door onze eerdere rapporten23,29,35,64.
Naast single cell patch-clamp methoden, vers geïsoleerde DSM cellen kunnen worden bestudeerd met andere technische benaderingen, waaronder Ca2 + imaging, RT-PCR/q-RT-PCR, immunocytochemie, in situ nabijheid ligatie test, en genomische benaderingen (bijvoorbeeld microarray, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Aangezien single cell transcriptome bepalingsmethoden blijven evolueren en zeer gevoelig worden, zien we ons in een toekomstige mogelijkheid om routinematig en specifiek elektrische of farmacologische eigenschappen van individuele DSM-cellen te koppelen aan hun transcriptoom/proteomeprofielen. Dit zal worden bereikt door eerst opname uit een DSM-cel en vervolgens het extraheren van mRNA of eiwit, gevolgd door transcriptomische / proteomische analyses. Hoewel dergelijke methoden al in niet-DSM-cellen zijn getest, zijn ze momenteel technisch uitdagend, gebrek aan gevoeligheid om als routine te worden beschouwd en beperkt tot een succesvolle detectie van een paar geselecteerde genproducten74. Functie-moleculaire profielexpressie koppelen studies wanneer gedaan op DSM cellen verkregen uit urineblazen afgeleid van controle en zieke patiënt-donoren zal inzicht geven in fysiologische processen die essentieel zijn voor het besturen van normale DSM-functies, pathogenese, en bij het identificeren van effectieve nieuwe therapeutische benaderingen.

Detrusor gladde spier (DSM) cellen vormen de meest voorkomende celtype in de urineblaas en uiteindelijk controle urine opslag en voiding door ontspanning en contractie, respectievelijk. DSM-cellen vormen vloeiende spierbundels die verstrengelen met aangrenzend bindweefsel, zenuwprocessen, interstitiële cellen en andere celtypen1. Het huidige begrip van de rol van DSM-cellen in de urineblaasfunctie is bereikt door middel van een geïntegreerde aanpak op meerdere niveaus. Elke experimentele methode - of het nu gaat om geïsoleerde enkelvoudige cellen in vitro, weefselstrips met gladde spierbundels in vitro/ex vivo, of in vivo bepalingen (zoals cytometrie en voiding function assessments) - biedt belangrijke en specifieke inzichten in fysiologische en farmacologische eigenschappen van DSM (zie beoordelingen1,2,3,4,5,6 voor details). De interpretatie van de resultaten die zijn verkregen uit geïsoleerde enkele cellen maakt het echter mogelijk conclusies specifiek toe te schrijven aan het eencellige type zelf. Deze realisatie is de drijvende kracht geweest voor het vaststellen van een betrouwbare en reproduceerbare methode voor het verkrijgen van vers geïsoleerde DSM-cellen uit de gehele dikte urineblaasmonsters. In tegenstelling tot veel andere celtypen kunnen gladde spiercellen niet betrouwbaar worden gekweekt als gevolg van het verlies van hun inheemse fenotype, inclusief specifieke veranderingen in hun elektrofysiologische en contractiele eigenschappen7,8. Dit feit versterkt verder het belang van studies uitgevoerd op fysiologisch actieve vers geïsoleerde DSM cellen.
Eind jaren tachtig en begin jaren negentig publiceerde isenbergs groep (Duitsland) een reeks elektrofysiologische studies naar vers geïsoleerde DSM-cellen verkregen uit proefkonijnenurineblazen9,10,11,12,13 ( tabel1). De methode benadrukte twee belangrijke waarnemingen die hielpen bij het verkrijgen van vitale cellen en diende als een eerste richtlijn voor anderen te volgen. Ze waren 1) voorbehandeling van geïsoleerde DSM-stukken met Ca2+-vrije oplossing/medium voorafgaand aan enzymatische behandeling en 2) weefselvertering met een oplossing die collageen ase bevat. Deze twee kritieke stappen zijn opgenomen in alle volgende varianten van DSM-celdissociatieprocedures(tabel 1). Momenteel, onze groep maakt gebruik van een twee-stap sequentiële papaïne-collageen dissociatie aanpak. DSM-stukken worden eerst behandeld met een enzymoplossing die papaïne bevat en vervolgens met collageentype II in dezelfde oplossing (DS, dissectie/spijsverteringsoplossing). Deze aanpak levert enkele DSM-cellen op van verschillende soorten, waaronder cavia, varken, rat, muis en vooral menselijk(tabel 1).
Enkele DSM-cellen vormen een bron voor meerdere moleculaire biologie en fysiologische experimenten. Tot nu toe bestudeerden eiwit- en mRNA-uitdrukkingen met immunocytochemie, of RT-PCR/qRT-PCR-bepalingen onthulden hoge detectieniveaus voor verschillende ionenkanalen, waaronder de grote geleidingsspanning- en Ca2+-geactiveerd (BK), kleine geleiding Ca2+-geactiveerde K+ type 3 (SK 3), voltage-gated K+ (Kv),L-type voltage-gated Ca2+ (Cav), en voorbijgaande receptor potentiële melastatine type 4 (TRPM4) kanalen, evenals een Na/Ca2+ wisselaar 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Ze zijn allemaal gedacht aan DSM excitability controle, intracellulaire Ca2 + niveaus en contractility. Patch-clamp elektrofysiologische benaderingen, rechtstreeks uitgevoerd op cavia-, muis-, ratten- of menselijke DSM-cellen, gaven directe demonstratie van biofysische en farmacologische eigenschappen van L-type Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK en TRPM4 kanalen17,19,20,21,22,23,24, 25,25 ,26,27,28,29,30,31. De benaderingen omvatten een conventionele spanningsklem voor hele cellen, een geperforeerde spanningsklem en single-channel opnames (celbevestigd, binnenstebuiten- en buiten-outconfiguraties). Bovendien, membraan potentiële opname van DSM met behulp van een stroom-klem geleverd bewijs dat target-boeiende farmacologische middelen veranderen de cel prikkelbaarheid. Zo veroorzaakte de TRPM4-remmer 9-fenanthrol hyperpolarisatie in DSM-cellen verkregen van mensen, cavia en urineblazen van ratten19,20,22,31. Onder de verschillende elektrofysiologische methoden, de amphotericine-B (en nystatine, gramicicidive, en β-escin) geperforeerde patch-klem opnames bieden een belangrijk voordeel door het behoud van intrinsieke intracellulaire signalering moleculen en paden. Alleen lage moleculaire gewichtskationen en in mindere mate, Cl- - maar niet eiwitten of signaalmoleculen waaronder Ca2 + - zijn doorlaatbaar door de plasma membraan poriën gevormd door amphotericine-B of nystatine32. Het succesvolle resultaat van geperforeerde patch-clamp experimenten hangt af van verschillende algemene variabelen die uniek zijn voor deze techniek. Hier beschrijven we de details van de procedure met behulp van amphotericin-B die onze groep in de loop der jaren15,22,33,34,35,36,37,38,39heeft gebruikt .
Ongetwijfeld blijven niet-selectieve kationkanalen een van de minst begrepen kanaaltypen in DSM-cellen. Het eerste verslag van een niet-selectief kation-achtig kanaal dateert uit 1993. Het papier van Wellner en Isenberg11 beschreef een 33 pS stretch-geactiveerd enkelkanaal met de volgende rangvolgorde van ionendoorlaatbaarheid: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+, en remming van kanaalactiviteit door Gd3+, een algemene remmer van niet-selectieve kationkanalen. Bijna tien jaar later beschreven Thorneloe en Nelson40 Na+ permeabele kationstromen in dsm-cellen van muizen, geremd door Gd3+,met behulp van whole-cell opnames. Aangezien moleculaire identiteiten van niet-selectieve kationkanalen en hun biofysische karakteriseringen nog moeten worden bepaald, zijn toekomstige onderzoeken op dit onderzoeksgebied gerechtvaardigd. Het hierbeschreven protocol voor de registratie van niet-selectieve kationkanaalstromen - met behulp van extracellulaire en pipet intracellulaire oplossingen die Cs+, TEA+en nifedipine(tabel 2) bevatten die de Kv- en Cav-stromen fysiologisch en farmacaal verzachten - is en zal nuttig blijven bij elektrofysiologische onderzoeken naar niet-selectieve katiekanalen. We hebben dit specifieke protocol gebruikt om de mate van remming van de hele cel kation stromen door de TRPM4 kanaal blokker 9-fenanthrol in cavia, rat en menselijke DSM cellen19,20,22.
Samen, de methode hier beschreven voor het verkrijgen van vers geïsoleerde enkele DSM cellen uit menselijke urineblaas biedt levensvatbare cellen zeer geschikt voor elektrofysiologische onderzoeken met behulp van verschillende configuraties van de patch-clamp techniek, Ca2 +-imaging, immunocytochemie, in situ proximale litigation test, en eencellige RT-PCR / qRT-PCR evenals geavanceerde moleculaire biologie technieken met inbegrip van microarray analyse, RNA-seq, en CHIP-seq. Het gebruik van de geperforeerde patchklemmethode met amphotericin-B behoudt de oorspronkelijke celomgeving in tegenstelling tot andere configuraties. Wanneer uitgevoerd met behulp van de specifieke voorwaarden die hier worden beschreven, ontworpen om bijdragen van K+ en Ca2+ stromen in DSM-cellen te ontkennen, tonen spanningsstap-geïnduceerde stromen de eigenschappen van niet-selectieve kationstromen die geschikt zijn voor biofysische en farmacologische karakteriseringen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td>Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-Phenanthrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>211281</td>
			<td>TRPM4 channel inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP928-250</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>European Pharmacopoeia Reference Standards</td>
			<td>5</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-100MG</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9006</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Extracellular solution and DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-7.5</td>
			<td>Capillary for preparation of pulled patch electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8518</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>pCLAMP-10</td>
			<td>Commerical software and part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004177</td>
			<td>DS-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203025</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Miltex Dental Wax Technologies, Inc.</td>
			<td>18058351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer with Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-077-32</td>
			<td>Placed in tissue bath to monitor temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DDT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Reducing agents used together with Papain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Required to pull electrodes with very fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating foam tube rack/holder</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82017-634</td>
			<td>Used for holding tubes with enzymes for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid (Na salt)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>pH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Data Acquisition System</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-442-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroForge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Used for fire-polishing electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7634</td>
			<td>L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of Patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-metalic syringe needle, MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF-34G-5</td>
			<td>Filling of intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>DS-P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Axon Axopatch 200B</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC computer</td>
			<td>DELL</td>
			<td>Custom configuration</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Aspera Instruments</td>
			<td>PH700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427-436</td>
			<td>Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue bath, 100 mL</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>1583-101</td>
			<td>Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl tubing</td>
			<td>ColePalmer</td>
			<td>06405-3</td>
			<td>Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulator bath, Haake D1 L</td>
			<td>Haake</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Connected to tissue bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents

Detrusor gladde spier (DSM) cellen aanwezig in de urineblaaswand uiteindelijk vergemakkelijken urineopslag en voiding. Voorbereiding van de levensvatbare, verse en geïsoleerde DSM-cellen vormt een belangrijke technische uitdaging waarvan de prestatie optimale cellen biedt voor latere functionele en moleculaire studies. De methode ontwikkeld en uitgewerkt hierin, met succes gebruikt door onze groep voor meer dan een decennium, beschrijft dissectie van menselijke urineblaas monsters verkregen uit open blaas operaties, gevolgd door een enzymatische twee-staps behandeling van DSM stukken en mechanische trituratie om vers geïsoleerde DSM cellen te verkrijgen. De eerste stap omvat dissectie om de DSM-laag (ook bekend als muscularis propria) te scheiden van slijmvlies (urothelium, lamina propria en muscleis mucosa) en de aangrenzende bind-, vaat- en vetweefsel aanwezig. De DSM wordt vervolgens in stukken gesneden (2-3 mm x 4-6 mm) in nominale Ca2+-bevattende dissectie/spijsverteringsoplossing (DS). DSM-stukken worden vervolgens overgedragen aan en achtereenvolgens afzonderlijk behandeld met DS die papaïne en collagenase bij ~37 °C voor 30-45 min per stap bevatten. Na wasbeurten met DS die enzymvrij runderserum en trituratie met een brandgepolijste pipet bevatten, geven de stukken enkele DSM-cellen af. Vers geïsoleerde DSM-cellen zijn bij uitstek geschikt voor fragment-klem elektrofysiologische en farmacologische karakteriseringen van ionenkanalen. Concreet laten we zien dat de TRPM4-kanaalblokker 9-fenanthrol de spanningsstap-ontluchtingsstromen vermindert die zijn geregistreerd met de geperforeerde patchklembenadering van amphotericin-B. DSM-cellen kunnen ook worden bestudeerd door andere technieken zoals eencellige RT-PCR, microarray analyse, immunocytochemie, in situ nabijheid sjaer, en Ca2 + beeldvorming. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van enkele DSM-cellen is dat de gemaakte waarnemingen rechtstreeks betrekking hebben op enkele celkenmerken die aan het licht kwamen. Studies van vers geïsoleerde menselijke DSM-cellen hebben belangrijke inzichten opgeleverd die de eigenschappen van verschillende ionenkanalen karakteriseren, waaronder kation-doorlaatbaar in de urineblaas en zullen doorgaan als een gouden standaard bij het verduidelijken van dsm cellulaire eigenschappen en regelgevende mechanismen.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

We beschrijven een methode voor de voorbereiding van de enkele vers geïsoleerde detrusor gladde spiercellen van menselijke urineblaas monsters gebruik maken van een twee-stap enzymatische procedure. De verkregen levensvatbare DSM-cellen kunnen worden bestudeerd door verschillende eencellige technieken, waaronder de beschreven amphotericine-B patch-clamp elektrofysiologie om fysiologische en farmacologische eigenschappen te onthullen.

Bereiding en gebruik van vers geïsoleerde menselijke detrusor gladde spiercellen voor karakterisering van 9-Phenanthrol-Gevoelige Kationstromen

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...

Detrusor gladde spiercellen vormen de wand van de urineblaas die uiteindelijk vergemakkelijkt de urine leegte en opslag. Ons protocol biedt een gevalideerde en betrouwbare methode voor vers isolatie van enkele gladde spiercellen. Vers geïsoleerde menselijke detrusor gladde spiercellen biedt een kans voor elektrofysiologische en moleculaire onderzoeken op eencellig niveau.Door het bestuderen van enkele detrusor gladde spiercellen uit controle, normale, en zieke menselijke urineblazen, hebben we de mogelijkheid om farmacologische doelen zoals ionkanalen te valideren. Enkele menselijke detrusor gladde spiercellen zijn ideaal voor elektrofysiologische experimenten zoals patch-clamp elektrofysiologie. Hier zullen we een voorbeeld van het bestuderen van een enkel ionenkanaal genaamd TRPM4, voorbijgaande receptor potentieel melastatine vier kanaal, dat is een niet-selectieve kation kanaal.Beginners kunnen worstelen met dissectie en enzymatische behandeling stappen die efficiëntie en vertrouwdheid vereisen, waaronder het herkennen van kritische belangrijke stappen voor het verkrijgen van verse geïsoleerde DSM-cellen. Het is belangrijk om vertrouwd te zijn met menselijke blaas histologie, protocol stappen voor het isoleren van enkele cellen blijven veerkrachtig, en in eerste instantie verwachten om suboptimale cellen met behulp van dit protocol te krijgen. Begin met het onderzoeken van de hele dikte urineblaas monster.Speld het monster, slijmvlies naar boven gericht en serosa neer op een siliconen enantiomer-gecoate 150 mm ronde schotel gevuld met ijskoude DS en verwijder zorgvuldig al het slijmvlies door scherpe dissectie. Knip verschillende slijmvliesvrije detrusor gladde spier of DSM stukken. Plaats drie tot zes DSM-stukken in een buis met één tot twee milliliter voorverwarmde DS met papaïne en dithiothreitol, of DS-P.Broed ze 37 tot 45 minuten op 37 graden Celsius, zodat je de buis elke 10 tot 15 minuten schudt. Na de incubatie haal je de DS-P uit de buis en was je de DSM-stukken kort met ijskoude DS. Breng de DS met DSM-stukken over naar een nieuwe buis en verwijder de DS, waardoor de DSM-stukken aan de onderkant van de buis achterblijven. Voeg een tot twee milliliter DS met collagenase type II, of DS-C, aan de buis.En het uitbroeden bij 37 graden Celsius met af en toe schudden. Gooi de DS-C weg en was de enzymbehandelde DSM-stukken vijf tot 10 keer met ijskoude DS. Na de laatste wasbeurt laat de DS in de buis, en voorzichtig triturate de stukken met een vuurgepolijste Pasteur pipet om enkele DSM cellen vrij te geven. Pipet 0,25 tot een milliliter celsuspensie op een glazen bodemkamer die op het podium van een omgekeerde microscoop zit en deze gedurende ten minste 45 minuten uitbroedt om de cellen te kunnen hechten.Verwijder vervolgens de DS uit het bad en vervang deze door E-oplossing via superfusie. Trek meerdere patch elektroden, brand-polijsten de elektrode tips, en jas de tips in tandheelkundige wax indien nodig. Vul de punt van een patch elektrode met de pipetoplossing zonder amphotericine-B door de elektrode kort in de oplossing te dompelen.Het succes van patchklem elektrofysiologie hangt af van DSM celkwaliteit en amphotericine-B oplosing. Vul de elektrode op met dezelfde pipetoplossing die amphotericin-B bevat en monteer de elektrode op een houder die is aangesloten op een koptrap van een patchklemversterker. Gebruik een micromanipulator om de elektrode net onder het oppervlak van de extracellulaire oplossing te plaatsen, zodat de punt van de elektrode net onder water staat.Bepaal vervolgens de elektrodeweerstand met behulp van de membraantestvensterfunctie van de commerciële acquisitiesoftware en ontwikkel de elektrode naar de cel van belang. Bij het aanraken van het celoppervlak met de elektrode, vorm een giga-afdichting door het toepassen van zachte snelle negatieve druk op de elektrode via buizen. Dit resulteert in een negatieve druk op het puntje van de elektrode wat resulteert in een succesvolle giga-afdichting zoals bevestigd door de membraantest.Laat 30 tot 60 minuten voor de amphotericine-B te verspreiden langs de pipet en worden ingevoegd in het plasmamembraan, de vorming van poriën in de eerste plaats selectief tot monovalente caties. Blijf de giga-afdichting monitoren met de membraantestfunctie. Wanneer de patchperforatie optimaal is, annuleert u de condensatietransiënten door de wijzerplaten aan te passen voor celcapaciteit en serieweerstand op de versterker.Zodra de stabiele spanningsstappen worden waargenomen, registreert u stromen met het routing voltage-step protocol zoals beschreven in het manuscript. Breng een verbinding of een fysiologische testconditie aan om per superfusie te testen en de reacties voor de controle- en testomstandigheden en het washout vast te leggen. Dit protocol kan worden gebruikt om gezonde, verse DSM-cellen te isoleren voor functionele en moleculaire studies.Gezonde enkele DSM-cellen worden gekenmerkt door spindelvormige morfologie, scherpe goed gedefinieerde randen, een goed gedefinieerde halo rond de cel en semi-contractiele verschijning wanneer deze onder de microscoop wordt bekeken. Bovendien reageren de vers geïsoleerde DSM-cellen op mechanische stimulatie en op carbachol. Celfragmenten en niet-levensvatbare of oververt verteerde cellen moeten worden vermeden in latere patch-clamp experimenten.De geïsoleerde cellen zijn gebruikt in amphotericine-B geperforeerde patch-klem experimenten waar hele cel stromen werden gemeten met ofwel een spanning-stap geïnduceerde of ramp protocol in drie verschillende menselijke DSM cellen. Experimenten toonden aan dat 9-fenanthrol, een TRPM4 kanaalremmer, effectief en omkeerbaar menselijke DSM kationstromen remde. De 9-fenanthrolgevoelige stroomcomponent illustreert een sterkere remming bij positieve spanningen en uiterlijke rectificatie.Toestand van enzymatische behandelingsstappen, stappen 2.2 en 2.3, inclusief temperatuur, duur van enzymbehandelingen, enzympartijbronnen en kwaliteit van DSM-cellen, zijn belangrijke determinanten voor het verkrijgen van menselijke DSM-cellen van hoge kwaliteit. Menselijke DSM-cellen zijn ook bij uitstek geschikt voor het evalueren van intracellulaire tweede messenger niveaus, waaronder calcium en cyclische AMP, het detecteren van eiwitexpressies door immunocytochemie, en co-expressie door in situ proximale geschillen test, en mRNA expressie door RT-PCR, qRT-PCR, microarrays, en de volgende generatie sequencing. Menselijke DSM cellen hebben ons begrip van de rol van BK, calcium, TRPM4 kanalen in de urineblaas ontwikkeld.Toekomstige ontwikkelingen zullen het mogelijk maken om specifiek elektrofysiologische of farmacologische eigenschappen te koppelen aan de transcriptoom- of proteoomprofielen.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focus Ca 2 + Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolatie van de Mens Umbilical arteriële gladde spiercellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolatie van longslagader gladde spiercel van Neonatale Muizen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Meting van de gladde spieren Functie in het Geïsoleerde Tissue Bath-applicaties om Farmacologie Onderzoek

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolatie van muizen coronaire vasculaire gladde spiercellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption: overbrengen geïsoleerde menselijke MSC Mitochondriën aan glioblastoma Stamcellen

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...