Name: preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents
Uploaded: 2020-01-31T12:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIH-R01DK106964 ו P20DK123971 מענקים לגאורגי V. פטקוב. המחברים מודים לד ר ויקטור יאררוצצקי ו גברת שרה מקסוול על הערכה קריטית של כתב היד. אנחנו גם אסירי תודה על מנתחים הצוות של אורולוגיה ב MUSC ו UTHSC: ד"ר תומס קין, הארי קלארק, סטיבן סאבאג ', רוס Rames, Sandip סאד, ג'ונתן פיקארד, כריסטופר Ledbetter יותר, אנתוני פטרסון, כמו גם התושבים MUSC ו UTHSC אורולוגיה: ד"ר. טיילור ווהן, סמואל ווקר Nickles, מתיו יאנג, ארין ברנס, ג'סטין אללט, ריאן לייני, אוסטין יאנגר, מארק קורי, נימה ברדראן, מקוי מק, טרייסי טיפטון, ברייס וויאט, אליסה גריימן, שרה Starosta, אהרון בלוך, כריסטין קאלדרך, לוסיל קוקס, כריסטיאן Dewan, ארין הטמן, בראדלי יוסטון, סטיבן לג, רוברט ס. ליבי, קול לוקליר, קריסטן מארלי, מוניקה או'נלון, פטריק פרובסט, סינתיה שרעדין, אליזבת Tourville, דניאל זפאטה עבור עזרתם עם אוסף רקמות האדם.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדות מוסדי הדירקטוריון של אוניברסיטת טנסי מדעי הבריאות מרכז (ממפיס, TN, IRB 17-05714-XP), ואת האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה (צ'רלסטון, SC, IRB 00045232). ההליכים שאושרו מאפשרים שלמות עובי שלפוחית השתן דגימות (> 1 ס"מ על ידי > 1 ס מ)-המכיל את כל השכבות כולל רירית, שריר השרירים החלק, ו serosa כמו גם המצורפת כלי הדם ורקמת האדיפוז)-כדי לאסוף מהחולים-תורמים שעברו החילוץ חלקי כירורגי של השלפוחית. המטופל-תורמים הם מבוגרים (טווח גיל למד עד עכשיו: 25 עד 87 שנים), או זכר או נקבה, עם או בלי תסמינים של שלפוחית השתן הפרוע (כפי שסווגו על ידי האגודה האמריקנית אורולוגית I-PSS ציון41). הליכים כירורגיים כוללים מגוון רחב של מצבים רפואיים כולל כריתת ציסטליה רדיקלית עבור קרצינומה של אורוטאליאל, ו אדנוקרצינומה. במקרים כאלה, הדגימה של שלפוחית השתן שנאספו הוא מרוחק מהאתר של הגידול.
1. חיתוך רקמות ה-DSM והכנת מטבעות ה-DSM ללא שימוש ברירית
<ol><li>בדוק את כל עובי שלפוחית השתן הדגימה שהגיעה למעבדה מחדר הניתוח במיכל אטום היטב מילא את הפתרון לניתוח/עיכול קר (איור 1 ושולחן 2 עבור הרכב של DS). הערה: הדגימה נשמרת בדרך כלל ב-DS קר מספר שעות ללילה לפני ההגעה למעבדה. עבור אחסון ארוך יותר, DS (טבלה 2) הוא שיושלם עם 1 מ"מ cacl2.</li>
	<li>הסר ושטוף את הדגימה השלמה של ה-DSM האנושי (המכיל את כל השכבות כולל רירית, DSM ו-serosa) עם DS קר הקרח כדי לשטוף את הפסולת המצורפת דם.</li>
	<li>הצמד את הדגימה של שלפוחית השתן, רירית פונה כלפי מעלה, serosa למטה, אל הסיליקון enantiomer מצופה (טבלה של חומרים) 150 mm קוטר עגול מלאה בקרח קר DS (איור 1B).</li>
	<li>הסר את רקמת האדיפוז הסמוכה, כלי הדם, האפיתל (אורואלינום) ורירית מוסקולריס מהדגימה באמצעות ניתוח חד באמצעות מיקרו מספריים ומלקחיים.</li>
	<li>גזור מספר חתיכות DSM נטול רירית (~ 2-3 מ"מ ארוכים ו 4-6 מ"מ רחב) (איור 1ג).</li>
</ol>2. דיסוציאציה אנזימטית של מיכלי DSM המניבים מבודדים בודדים מתאי DSM בודדים
<ol><li>מקום 3 כדי 6 החלקים DSM לתוך צינור המכיל 1 עד 2 מ ל של טרום מחומם (~ 37 ° c) DS המכיל פפאין ו dithioטרטיםol (DS-p, שולחן 2) ו הדגירה החלקים DSM ב DS-P עבור 30-45 דקות ב ~ 37 ° c לרעוד בעדינות את הצינור מדי פעם (פעם 10-15 אחת הערה: כדי לשלוט באופן אופטימלי בטמפרטורה לטיפול אנזימטי, צינורות בעלי רקמה ופתרונות אנזימים ממוקמים בחדר רקמת זכוכית מלא במים המחוברים לאמבט מים מחוממים (איור 1ד) או מרחץ מהיר בטמפרטורה גבוהה הנשלט על-ידי מים (איור 1E).</li>
	<li>הסירו את DS-P מהצינור, רוחצים בקצרה את חתיכות ה-DSM עם הקרח הקר DS, מסירים את הקור DS מהצינור ועוזבים את חתיכות ה-DSM שיושבות בתחתית הצינורית.</li>
	<li>הוסף 1 ל 2 מ ל של מכיל DS המכילים הקולגן סוג II (DS-C, שולחן 2) לצינור עם חתיכות DSM, לערבב בעדינות; ו-דגירה עבור 25-40 דקות ב ~ 37 ° צ' מטלטל בעדינות את הצינור מדי פעם (כל 10-15 דקות).</li>
	<li>התעלם DS-C ושטוף שטופלו באנזימים מטופלים 5-10 פעמים עם DS קר קרח.</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה, השאר את פתרון DS בתוך השפופרת; בעדינות קצוצות עם מלוטש אש הצינורות פסטר מספר פעמים כדי לשחרר תאים DSM יחיד.</li>
	<li>מניחים כמה טיפות של הפתרון DS המכיל תאי DSM מפוזרים על חדר זכוכית תחתון או שמיכות ולבדוק חזותית עבור איכות תחת מיקרוסקופ (באמצעות מטרה 20x או 40x) לאחר 5 דקות לפחות בעקבות היישום כדי לאפשר לתאים לדבוק התחתון.</li>
	<li>השתמש מיד בתאי DSM מבודדים באופן טרי עבור ניסויים אלקטרולוגיים או לאחסן את התאים בצינור המכיל DS ב ~ 4 ° c או על הקרח או במקרר עד השימוש (בדרך כלל עד 8 h ההכנה). הערה: במסגרת אותה הכנה איכות התאים משתנה מאוד לתאי ה-DSM המתים, שאינם מתעכלים (איור 2). כאשר השיטה הרציפה papain-קולגן מניב מספר גבוה מאוד של תאים לא קיימא, ההכנה מושלך, ואת העיכול החדש של חתיכות DSM מבוצעת אבל עם מרווחי דגירה מופחתת. אם ההליך מביא מעט מדי תאי DSM לאחר מכן לעיכול הבאים של חתיכות DSM, מרווחי הדגירה מוגברת. החיסונית חיובית הפעילות כדי α-השריר החלקה אקטין מאשרת את זהותו של תאי DSM (איור 3).</li>
</ol>3. הקלטת ומתח המושרה זרמי הקטיון מתאי ה-DSM באמצעות אמפוריטיצין-B מחורר-תא שלם-מהדק תיקון טכניקת
<ol><li>פיפטה 0.25-1 מ ל של השעיה לתא על תא זכוכית תחתון יושב על הבמה של מיקרוסקופ הפוך ולאפשר לתאים לדבוק בתחתית הזכוכית.</li>
	<li>לאחר דגירה עבור לפחות 45 דקות, להסיר DS מהאמבטיה ולהחליף עם הפתרון E (טבלה 2) על ידי superfusion שבו זרימת הפתרון בסיוע על ידי כוח הכבידה באמצעות אבובים כניסת האטה מחליף DS עם הפתרון החדש בעוד אבובים לשקע מחובר כלי פסולת ואקום מסיר את הפתרון קאמרית מונע גלישה. שימו לב: התמיסה האלקטרונית מכילה את הטאטיוליאמילמוניום (תה+) ו צסיום (Cs+) כדי לעכב את K+ זרמים.</li>
	<li>הכנת פתרון מלאי עבודה של אמפוריטיצין-B בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) (1 מ"ג לכל 10 μL של DMSO). כדי לפזר במלואו אמפוריטיצין אבקה, sonicate (לפחות 15 דקות) ומערבולת הפתרון היטב. הערה: שלב זה אורך בדרך כלל פחות מ-10 דקות. המסת 3-4 mg של אמפוריטיצין-B ב 30-40 μL של DSMO בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL היטב. כמויות גבוהות יותר של אמפוריטיצין-B דורשים הממס DSMO יותר בדרך כלל וכתוצאה מכך מרווח ארוך יותר עבור ערבוב ופתרונות לא שלמים של חלקיקים מוצק אמפוריטיצין-B הנמצאים בתוך הצינור.</li>
	<li>התמוססות פתרון מלאי של אמפוריטיצין-B בפתרון הפיפטה (פתרון P, שולחן 2) כדי לקבל ריכוז סופי של 200-500 μg/mL. שלב זה דורש sonication והורטקנג נרחבים בהגדרה במהירות גבוהה (8-10/10) עבור ~ 30 עד 60 דקות לשלב כדי להבטיח ערבוב אופטימלי ומניעה של היווצרות אמפוריטיצין-B מזרז בפתרון הפיפטה. הערה: אמפוריטיצין-B יזרז את הזמן והוא רגיש לאור. פתרון הפיפטה הפועל המכיל אמפוריטיצין-B נבדק מסיסות, מעורב ביד לפני מילוי הפיפטה ונשמר בחשכה.</li>
	<li>משוך אלקטרודות מרובות, האלקטרודות אש-פולנית, ו (במידת הצורך) לחלוק את הטיפים עם שעווה שיניים.</li>
	<li>למלא את קצה האלקטרודה תיקון עם פתרון הפיפטה (פתרון P, שולחן 2) ללא אמפוריטיצין-B על ידי שטבילה קצרה האלקטרודה בפתרון.</li>
	<li>ממלאים את האלקטרודה עם פתרון הפיפטה זהה המכיל אמפוריטיצין-B.</li>
	<li>הבהר את האלקטרודה על מחזיק המחובר לשלב הכותרת של מגבר מהדק.</li>
	<li>באמצעות מיקרומניפולציה, מניחים את האלקטרודה ממש מתחת לפני השטח של הפתרון לחילוץ כך קצה האלקטרודה הוא פשוט שקוע.</li>
	<li>במצב מהדק מתח, להגדיר את הפוטנציאל המחזיק 0 mV ולהתאים את הנוכחי ל -0 הרשות עם חיוג הקיזוז הצינורות על המגבר המסחרי (לוח חומרים).</li>
	<li>לקבוע את ההתנגדות אלקטרודה באמצעות החלון בדיקת קרום/תפקוד של תוכנת הרכישה המסחרית (טבלת חומרים). כדי להפעיל את כלי לחץ > מבחן ממברנה &Gt; Play או סמל קיצור בתוכנה. התנגדות האלקטרודה נחוש צריך להיות בטווח של 2 כדי 5 MΩ. הערה: מבחן ממברנה פונקציה המסופקת בתוכנת הרכישה המסחרית או חותם בדיקה האפשרות על המגבר ניתן להשתמש כדי לפקח על עמידות האלקטרודה על ידי הפעלת צעדי מתח באופן חוזר.</li>
	<li>המשך לעקוב אחר התנגדות האלקטרודה תוך קידום האלקטרודה לעבר תא DSM שנבחר עם מיקרומניפולציה (איור 4א). הערה: כדי להיחשב כתא DSM בר קיימא, על התא להציג מורפולוגיה מוארך בצורת ציר, הילה מוגדרת היטב סביב התא, קצוות חדים ומראה למחצה (הסרפנטיין).</li>
	<li>כאשר נוגעים משטח התא עם האלקטרודה-מצוין על ידי עלייה מהירה התנגדות אלקטרודה נמדד עם הפונקציה מבחן קרום-טופס giga-חותם על ידי החלת לחץ שלילי עדין מהירה על מחזיק האלקטרודה דרך אבובים. התוצאה היא לחץ שלילי שנוצר בקצה של האלקטרודה כי מושך קרום התא לתוך האלקטרודה לסייע היווצרות של giga-חותם או קשר הדוק מאוד בין האלקטרודה ואת קרום פלזמה (איור 4B).</li>
	<li>פעם אחת את הטפסים giga-חותם, לפצות על הקיבוליות באמצעות כוונון מהיר ואיטי מחייג על מגבר מסחרי ניטור giga-חותם יציבות (דליפה הנוכחי) באמצעות הפונקציה מבחן קרום.</li>
	<li>לאפשר זמן, בדרך כלל 30-60 דקות, עבור אמפוריטיצין-B לפזר את הפיפטה ולהיות מוכנס לתוך קרום הפלזמה להרכיב נקבוביות בעיקר סלקטיבי להנשות מונוטוני. במהלך שלב זה, להמשיך לעקוב אחר החותם giga עם הפונקציה מבחן קרום. כמו מחורר תא מגדילה כך משרעת של הקיבוליות הקיבול (להשוות את הדמות 4B לעומת איור 4C הצגת מחורר תא לא יעיל, בהתאמה) נמדד עם הפונקציה בדיקת קרום.</li>
	<li>כאשר ניקוב התיקון הוא אופטימלי (נשפט על-ידי התנגדות סדרה יציבה בדרך כלל מתחת 50 MΩ), לבטל את ארעיות הקיבול על ידי התאמת מחייג לקיבוליות תא התנגדות סדרה על המגבר. פיצוי התנגדות סדרה יכול להתבצע גם בשלב זה (איור 4D).</li>
	<li>ברגע שאחד מהזרמים התקפים של זרמי הקטיון המושרה על ידי הפרוטוקול שצוין, מוחלים על תנאי מורכב או פיזיולוגי כדי לבדוק את התגובות לפקד-, מצב בדיקה וכשלון (אם אפשר) עם ה תוכנה לרכישת מסחר.<ol>
<li>זרמים מקליטים עם פרוטוקול שגרתי בשלב המתח הכרוך בהחזקת תאי DSM ב-64 או-74 mV ומעבר למתח במרווחים של 10 mV עבור 400 או 500 ms מ-94 + 96 או + 106 mV וחוזר לפוטנציאל המחזיק. הערה: ערכי הממברנה הפוטנציאליים מותאמים לפוטנציאל הצומת הנוזלי של 14 mV (באמצעות פתרונות P ו-E, שולחן 2). הפוטנציאל הגלום בצומת הנוזלי מתקבל בתוכנת הרכישה המסחרית (לוח חומרים) על ידי לחיצה (כלים > הפוטנציאל של ההסתעפויות) וכניסה לריכוזים של רכיבי יון פתרונות. ניתן להשתמש בפרוטוקול רמפה גם לקבלת הקלטות נוכחיות.</li>
		<li>הפעל את פרוטוקול המתח במרווח זמן של ~ 1 דקות רציף במהלך זרמים של הקלטת ניסוי עבור בקרה טרום-הוספה, תנאי בדיקה וכשלון.</li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוח נתונים והדמיה
<ol><li>פתח קבצים מוקלטים בתוכנה לניתוח נתונים מסחריים (טבלת חומרים) עבור הפקד, תנאי הבדיקה וכשלון על-ידי לחיצה על קובץ > פתח נתונים ובחירת קבצים מעניינים לפתיחה. הערה: לניתוח בדרך כלל שלושה קבצים (כל אחד מהם מכיל ערכה יחידה של עקבות להפעלת פרוטוקול יחיד) עבור כל תנאי נפתח ומנותח. התגובות מממוצע לאחר מכן כדי לקבל תגובה מרושעת עבור כל תנאי. התוכנה המשמשת לרכישת נתונים מכילה אפשרות לאסוף באופן אוטומטי הפעלת בדיקות מרובות שצוינו על-ידי המשתמש וממוצעי אותם עבור קובץ פלט יחיד שניתן להשתמש בו כחלופה.</li>
	<li>השג את התגובה הממוצעת ב200 האחרונות עבור המעקב הנוכחי הנמדד בכל מתח; מרווח הזמן שנבחר משקף רמת מצב קבוע של הפעלה נוכחית של שלב המתח. כדי לעשות זאת בצע את השלבים הבאים.<ol>
<li>בחר קובץ מעניין לניתוח בתוכנת הניתוח המסחרי (טבלת חומרים). הערה: התוכנה ממקמת את הקובץ האחרון שיובא לחלון התצוגה הפעיל שלה. הקובץ הפתוח מציג סדרה של עקבות חופפים שהושגו עם פרוטוקול של שלב מתח. כברירת מחדל, בחלון הפעיל ארבעה סמנים (הצגת ערכי x ו-y עבור הסימן המסומן) מוצגים.</li>
		<li>בחר את טווח ניתוח על ידי מיקום הסמן 2 בסוף 400 או 500 ms בצעד מתח הסמן 1 במרווח של 200 ms לפני זה, כך טווח ניתוח הוא 200 ms.</li>
		<li>השג תגובות עבור כל מתח על-ידי לחיצה על ניתוח &Gt; גרף מהיר &GT; IV (או סמל קיצור הדרך של IV) (בחלון הבקשה לפני יצירת אישור נתונים המהווה את האפשרות 'סמניםלציר y (נוכחי) '. לחץ על אישור כדי ליצור את גרף ה-I-V ולמקם את הנתונים בגליון עמודות תוצאות שניתן להציג על-ידי גישה ל-Windows > תוצאות.</li>
		<li>ניתוח קבצים נוספים על-ידי שלבים חוזרים 4.2.1-4.2.3. לחץ על נתח &Gt; גרף מהיר &GT; IV או את קיצור הדרך של סמל iv , בחר באפשרות צרף במקום להוסיף נתונים נוספים לגליון התוצאות בעת עיבוד העקבות.</li>
		<li>העתק נתונים לגיליון אלקטרוני על-ידי בחירת עמודות הריבית והקשה על ctrl + C כדי להעתיק ו- ctrl + V כדי להדביק. אחסן את גליון העבודה תוצאות בתוכנת הניתוח המסחרי (טבלת חומרים) בתבנית (*. rlt) על-ידי לחיצה על קובץ > שמירה בשם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור כל תא, התאם את התגובות עבור כל שלושת התנאים לערך של שלב המתח המקסימלי עבור הפקד מראש בתוספת (בהתאם לנוסחה: בקרת תגובה/תגובה-Max) וגרף התגובות כערכים נוכחיים (או דחיסות נוכחית) לעומת קשרי מתח (איור 6).<ol>
<li>במעבד גליון עבודה, קבע את התגובות הממוצעות כזרמים (pA) או הצפיפויות הנוכחיות (pA/pF) עבור בקרה, תנאי הבדיקה (בדוגמה זו, 9-פניל) וכשלון בכל צעד מתח.</li>
		<li>לחלק ערכים עבור כל מתח של כל תנאי (שליטה, 9-פניל, וכשלון) על ידי תגובת הבקרה המקסימלית שהתקבל במתח הגבוה ביותר (+ 96 mV באיור 6) עבור שליטה מראש בתוספת בעקבות הנוסחה: תגובה מנורמלת עבור מצב (x) = תגובה (x)/בקרת תגובה-Max עבור (x</li>
	</ol>
</li>
	<li>לניתוח סיכום, סדר את הנתונים בתבנית שניתן להעתיק בקלות לתוכנית גרפית (לדוגמה, מנסרה) עבור פריט חזותי.</li>
</ol>

ההליכים המתוארים כאן להסביר את השלבים המעורבים בהכנת התאים הקיימא, מבודדים בתאי DSM מעובי שלמות האדם דגימות שלפוחית השתן באמצעות העיכול אנזימטי ובהקלטה של זרמים שלמים תא היון רגיש לTRPM4 channel מעכב 9-פנילl העסקת אמפוריטיצין-B מחורר תיקון מהדק הגישה. ההליך האנזימטי מסתמך על חשיפה דו-שיטית בעלת שני שלבים המכונה בזאת כשיטת העיכול הרציפה. הרקמות DSM מטופלים לראשונה עם פפאין ו dithioitol (מייצב החומר האנזים) תחת Ca הנומינלי2 +-מצב חופשי, ואחריו בשלב השני על ידי הקולגן סוג II בנוכחות נמוכה Ca2 +. הרציונל לביצוע עיכול פפאין תחת נמוך Ca2 + התנאים בתאי שריר חלקה תאריכים בחזרה לסוף שנות השמונים. מבודד העורק הראשי מבודדים התאים השריר חלקה הכינה עם פפאין מוצג צורה מוארך, הראה הכדאיות (התנגדות ספיגת כחול טריטן) והגיבו גירויים הקונקטילה (Ca גבוהה יותר2 + ו היסטמין)65. שנים מאוחר יותר, שיטה זו הוחלה בהכנת תאי DSM (ראה טבלה 1). הבחירה של מסוג הספר השני במקום סוגים אחרים מתייחס הפעילות הפרוטחרדה שלה גבוה יחסית מתאים באופן אידיאלי רקמות שרירים חלקות כולל DSM. אכן, הטיפול בקולגן בלבד יכול להניב תאים DSM יחיד, אם כי דורש חשיפה אנזים נרחב (≥ 60 min)53,54. מאז הפעילות הקולגנאז תלויה ב-Ca2 + והאנזים אינו פעיל בתנאים של ca2 +-free, העיכול האנזימטי האופטימלי של חתיכות DSM דורש את הנוכחות של Ca2 + 66. במקרה שלנו, DS-C מכיל 100-200 μM [Ca2 +] (טבלה 2). לאחר טיפול אנזימטי, חתיכות DSM מתעכל שוטפים בעדינות מספר פעמים עם DS קר ללא אנזימים או Ca2 + כדי להסיר את כל האנזים המאוגד רקמות. התקררות הקרח מסייעת לשמר את שלמות התא של DSM ולהגביל את הפעילות האנזימטית של כל פפאין או הקולגן שנותרו. בשלב האחרון, נשחקו של חתיכות DSM שטופלו באנזימים עם אש מלוטשת מבריק פסטר משחרר תא DSM יחיד. תאי DSM ממוקמים מיד על תא הקלטה עבור לימודי תיקון או סוגים אחרים של ניסויים או מאוחסנים על קרח ב-DS לשימוש מאוחר יותר באותו יום (בדרך כלל בתוך 8 שעות של הכנה, אבל התאים נשארים קיימא עד 24 h).
זיהינו מספר שיקולים חשובים להשגת בהצלחה תאי DSM בודדים. הראשון מתייחס לאיכות המקור. של הדגימה האנושית של ה-DSM כדי לשמר בצורה אופטימלית את שלמות הרקמה, דגימות DSM שהתקבלו מניתוחי שלפוחית השתן הפתוחה ממוקמים DS קר קרח בהקדם האפשרי ומתוחזק בסביבה קרה. באופן ספציפי, על החילוץ כירורגי של המטופל, הדגימה שלפוחית השתן ממוקם מיד על שולחן צדדי מוכן בחדר הניתוח. בדיקה ברוטו של הדגימה כולה (מושגת בדרך כלל במהלך כריתת cystectomy קיצונית או פשוטה) והפתיחה שלה. לאחר בדיקה חזותית, פיסת עובי שלמות סולם השתן מוסר מאזור מרוחק של הדגימה מאוד לא מעורב עם הגידול ממוקם מיד לתוך ספל (או 50 או 100 mL) המכילים קר (~ 4 ° c) פתרון חיתוך (DS) (טבלה 2) ולאחר מכן סגור היטב עם מכסה. בשל האופי המתוכנן של קצירת הרקמה, אנשי חדר הניתוח וצוות העזר שעושים את הקציר מוזהרים בתחילת המקרה הכירורגי על מנת לקבל את החומרים הזמינים בחדר הניתוח בזמן הפקת הרקמה. אמצעי זהירות אלה יחד עם האופי השגרתי והחוזר של שלבי העיבוד לשמור על הזמן החמים איסכמיה עבור הרקמה-מן החילוץ למיקום במיכל מקורר עם פתרון DS-כדי פחות מ 5 דקות. המיכל ממוקם לאחר מכן במקרר או בקרח בצידנית כדי לשמור על הסביבה הקרה ומועבר (קר בקרח) למעבדה. ברגע שהוא מגיע למעבדה, מתחילים לבצע את צעדי הדיסוציאציה. קשה מאוד לנבא אם מדגם DSM מסוים יניב תאי DSM באיכות גבוהה בעקבות דיסוציאציה אנזימטית, ולכן נמשיך בצעדי הדיסוציאציה האנזימטיים. במקרים רבים, במקביל לניסויים אלקטרולוגיים, הקבוצה שלנו מבצעת הקלטות מתח שונות על רצועות DSM המוכנות מאותם דגימות DSM. גילינו כי בדרך כלל אנו יכולים להשיג תאים DSM באיכות גבוהה מן ההכנות כי גם לספק בהצלחה רצועות קיימא עבור לימודי התכווצות איזומטרי (ההתבוננות שלא פורסמה שלנו).
הגורם השני מתייחס ליכולות שונות של אנזימים. הבחנו כי עבור שניהם פפאין ו כולקולאז סוג II, בכל פעם הרבה חדש של אנזים מגיע הספק, פעילות האנזים DS עבור העיכול רקמות יכול להשתנות. אנו, לפיכך, לייעל באופן שגרתי את ריכוז האנזים ואת מרווחי דגירה עבור כל הרבה חדש. כדי למזער את התרומה הרבה להשתנות, אנו מסודרים כמויות גדולות יותר של אותו הרבה ולעשות אצווה גדולה של פתרונות מניות ב 2 mL הבליטים של אנזימים ולאחסן אותם ב ~-20 ° צ' עד השימוש. לאורך זמן, עם זאת, מניות קפוא (מאוחסן עד 2 שבועות) יכול לאבד פעילות אנזימטית שלהם. המשתנה השלישי מתייחס לטמפרטורה של טיפולי עיכול אנזימים. פעילויות אנזימטיות של פפאין ו הקולגנאז להציג תלות טמפרטורה. Papain ו-קולגן סוג II פעילות התערוכה בטווחים טמפרטורה המקיף פיזיולוגיה הגוף הרגיל67,68. לכן, אנו שואפים לשמור על טיפולי האנזים יציבים ב-~ 37 ° c הימנעות טמפרטורות גבוהות יותר כדי לשמור על שלמות התא DSM. השיקול הרביעי מדאיג את השונות של איכות תאי ה-DSM הנמצאים בתוך כל הכנה החל מאוד קיימא (מציג מצוין מאפייני שריר חלקה קלאסית) לתאים לא בריאים, מתעכל יותר. מרווח הדגירה האנזים ממושך היא אחת הסיבות העיקריות להשגת מספר גבוה של תאים פגומים. טיפולים אנזימים מוגזמת פוגעים גם במבני חלבונים של ערוצי יונים, קולטנים ושנאים, להשפיע לרעה על הפונקציונליות שלהם. פרשנות של תוצאות שהתקבלו מתוך אנזימטי, תאים מבודדים טרי צריך לשאת את השיקול הזה בראש. אופטימיזציה של התנאים לעיכול אנזימים שואפת להגדיל את אחוז התאים הקיימא ביותר. גישות ניסיוני להסתמך על מספר גבוה יותר של תאים קיימא כגון ניתוחים microarray דורשים מיטוב חזקים יותר מאשר אלה ביצעו בהצלחה על פחות תאים כגון תיקון תא בודד-מלחציים אלקטרופיזיולוגיה או Ca2 + הדמיה. התחשבות בגורמים הנ ל הנחה את מאמצי המחקר שלנו בעשור האחרון בהשגת תאים בעלי איכות גבוהה בודדת DSM.
הטכניקה מחורר הטלאי הפטנט כבר הגישה האלקטרולוגית החשמלית במשך רבע מאה. מספר פרסומים מספקים פירוט של השיקולים הטכניים69,70,71,72,73. ניקוב תאים ניתן להשיג עם אמפוריטיצין-B, nystatin, מגרסידין, או β-escin (ראה הפניה32למבט כולל על כל אחד מהם). היתרון העיקרי של הקלטות מחורר הדבקה הצמד על פני גישות אלקטרופיזיולוגיות אחרות היא כי הסביבה תאיים הילידים-כולל Ca תאיים2 +ואיתות מולקולות (למשל, מחנה, PKA, פוספטים, ו זרחן)-נשמר. טכניקה זו, מכאן, מתאימה באופן אידיאלי לחקירת זרמים של ערוצי יונים שלמים ומנגנוני הרגולציה שלהם בתנאים פיזיולוגיים. האזהרה מפתח היא כי הרכב התא תאיים לא יכול להיות נשלט בדיוק בניגוד שיטות אלקטרופיזיולוגיות אחרות כגון רגיל-תא כולו ו-הערוץ יחיד-טלאי (בפנים ומחוץ לבית) הקלטות. בניסיון שלנו, שלושה גורמים לתרום באופן שגרתי התוצאות הנסיוניות מוצלחת של אמפוריטיצין-B-מחורר ניסויים מלחציים טלאי. הראשונה היא האיכות של תא ה-DSM שנבחרה לנסות הקלטה. כאשר תאי DSM הם מאוד קיימא הצגת למחצה הקונקטילה (דמוי סרפנטיין), מראה מבריק בחדות גבוהה עם הילה מוגדרת היטב סביב משטח התא ולהצמיד היטב לתחתית הזכוכית של חדר ההקלטה ולאחר מכן giga-חותם היווצרות תא ניקוב מתרחשים יחסית קל. הגורמים השני והשלישי להצלחה, בהתאמה, להתייחס לאיכות של מקור ומסיסות של אמפוריטיצין-B (בתוך diמתיל סולפוקסיד/DMSO ופתרון הצינורות התאיים). הבחנו בסתירות בין ספקים שונים במונחים של מקור ושונות הרבה יכולות. בכל יום אנו מכינים פתרון טרי של אמפוריטיצין-B פתרון מניות מאבקה ואחריו דילול התמיסה התאיים. שלבים אלה דורשים sonication נרחב ומורטקסנג. עם האמפוריטיצין-B המכיל פתרון פיפטה טרי, ניקוב תאים מוצלח (<50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K mω)="" following="" giga-seal="" formation="" can="" be="" usually="" obtained="" within="" 30="" min.="" the="" concentration="" of="" amphotericin-b="" in="" the="" pipette="" solution="" also="" requires="" optimization="" dependent="" on="" the="" amphotericin-b="" lot="" and="" source.="" under="" our="" experimental="" conditions,="" the="" final="" amphotericin-b="" concentrations="" in="" the="" pipette="" range="" from="" 200="" to="" 500="" µg/ml.="" since="" amphotericin-b="" exhibits="" light="" sensitivity,="" its="" solutions="" need="" to="" be="" kept="" in="" the="" dark.="" using="" the="" amphotericin-b="" perforated="" patch-clamp="" technique,="" our="" group="" recorded="" voltage-step="" induced=""></50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K>+, קליפורניה2 +, וזרמים לא סלקטיבית מתאי ה-DSM האנושיים, השפן, העכבר, ו/או העכברים17,21,22,23,29,30,31,35,60. כאן, אנו מתארים תנאים להקלטת זרמים לא סלקטיבית של הקטיון בתאי ה-DSM האנושיים. 9-פניל, חוסם של ערוצים TRPM4, זרמים מחליש בשלב המתח המושרה לתמוך בתפקיד של ערוצים אלה בשליטה של היכולת של ה-DSM. כהערה, זה בדרך כלל דורש לפחות 45 דקות לאחר קבלת החותם giga וחניכה של ניקוב כדי להקליט את המתח האופטימלי של הזרם הגבוה המושרה זרמים היון לא סלקטיבי. רמפות מתח יכול לשמש גם כחלופה לפרוטוקולים שלב מתח30,64. כאן, פרוטוקול של צעד מתח מן הפוטנציאל המחזיק מקוטב השפעה היה מועדף ולא פרוטוקול רמפה מאז הגישה לשעבר ממזער את ההשפעה של הפעלה תלויה מתח ומאפשר בממוצע של זרם מעורר על משך זמן של מתח-שלב שבו השיפוע מספק נקודת נתונים אחת לכל מתח. הנקודה האחרונה מתייחסת במיוחד לתאי ה-DSM האנושיים כאשר הזרמים מציגים פעילות משתנה במהלך צעדי מתח (איור 5ואיור 6). הטכניקה האמפוריטיצין-B מחורר לתיקון, הכרחית בזיהוי המאפיינים של תאי DSM וסוגי תאים אחרים, וימשיכו לספק מספר תגליות בעתיד. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בהצלחה בתאים מבודדים של DSM בודד עבור מדידת תא שלם K+, קלרנית-, ו-Ca2 +זרמים עם המצב המקובל של טכניקת המדבקה, ההקלטה הפוטנציאלית עם המלחציים הנוכחיים, והקלטות ערוץ יחיד כפי שאנו מדגיבים את הדיווחים הקודמים שלנו23,29,35,64.
בנוסף לתיקון תאים בודדים-קלאמפ שיטות, תאים בודדים DSM מבודדים ניתן ללמוד עם גישות טכניות אחרות כולל Ca2 + הדמיה, RT-pcr/q-RT-PCR, אימונוציטוטוכימיה, בסמיכות באתרו בקירבה, וגישות גנומית (g., microarray, RNA-seq, שבב-seq)15,18,303433, כמו תא יחיד ההמרה שיטות ההגדרה להמשיך להתפתח ולהיות רגיש מאוד, אנו לדמיין את היכולת העתידית לקשר באופן שגרתי ובמיוחד הקישור תכונות החשמל או תרופתי של תאים DSM בודדים עם ההמרה שלהם פרופילים. זה יהיה מושגת על ידי ההקלטה הראשונה מתא DSM ולאחר מכן חילוץ mRNA או חלבון ואחריו הטרנססקריפט/פרוטאנדומית ניתוח. למרות ששיטות כאלה נבדקו כבר בתאים שאינם-DSM, הם נמצאים כרגע מאתגרת טכנית, חוסר רגישות להיחשב שגרתי, ומוגבל לגילוי מוצלח של כמה מוצרים גנים נבחרים74. פונקציה-ביטוי הפרופיל המולקולרי המקשר מחקרים כאשר נעשה על התאים DSM שהתקבלו שלפוחיות שתן שנגזר שליטה וחולים חולים-תורמים תספק תובנות לתהליכים פיזיולוגיים חיוניים לנהיגה פונקציות DSM רגיל, פתוגנזה, ובזיהוי גישות אפקטיביות הרומן הרפואי.

תאים השריר החלקה (DSM) מהווים את סוג התא הנפוץ ביותר בשלפוחית השתן ובסופו של דבר שליטה בשתן אחסון והשרירים דרך הרפיה והתכווצות, בהתאמה. תאים DSM טופס שריר החלקה צרורות השילוב עם רקמת חיבור סמוכים, תהליכי עצב, תאים ביניים, סוגי תאים אחרים1. ההבנה הנוכחית של התפקיד של תאי DSM בתפקוד שלפוחית השתן הושגה באמצעות גישה משולבת מרובת רמות. כל שיטה ניסיונית-בין אם מבוסס על תאים יחידים בודדים בתוך מבחנה, רצועות רקמה המכילות שריר החלקה צרורות בחוץ-גופית/ex vivo, או ב vivo דטרמיניזם (כגון cy try והערכות פונקציה ההיגוי)- מספק תובנות חשובות וספציפיות לתוך תכונות פיזיולוגיות ופרמקולוגית של DSM (ראה ביקורות1,2,3,4 עם זאת, פרשנות של תוצאות שהתקבלו תאים בודדים בודדים מאפשר מסקנות במיוחד לייחס את סוג התא בודד עצמו. הבנה זו הייתה הכוח המניע להקמת שיטה אמינה ובעלת שימוש לגילוי לקבלת תאים מבודדים של ה-DSM מפני כל דגימות שלפוחית השתן הכוללת. שלא כמו סוגים רבים של תאים אחרים, תאים שריר החלקה לא יכול להיות תרבותי באופן אמין עקב אובדן של שלהם פנוטיפ הילידים כולל שינויים ספציפיים ב-electroפיסיולוגית שלהם נכסים7,8. עובדה זו מחזקת יותר את החשיבות של מחקרים שבוצעו בתאי DSM מבודדים מבחינה פיזיולוגית.
בשלהי שנות השמונים ותחילת שנות התשעים, הקבוצה של אידנברג (גרמניה) פרסמה סדרה של מחקרים אלקטרופיסיולוגיים על תאי DSM מבודדים טריים שהתקבלו מפני שלפוחיות שתן של חזיר מגינאה9,10,11,12,13 (שולחן 1). השיטה הדגישה שני תצפיות חשובות שסייעו בהשגת תאים חיוניים ושימשה כהנחיה ראשונית לאחרים. הם היו 1) טיפול מקדים בחתיכות DSM מבודדים עם Ca2 +-פתרון חינם/בינוני לפני טיפול אנזימטי ו 2) העיכול רקמות עם פתרון המכיל את הקולגן. שני צעדים קריטיים אלה שולבו בכל הגרסאות העוקבות של הליכי דיסוציאציה של תא DSM (שולחן 1). כיום, הקבוצה שלנו מעסיקה שניים שלבים רציפים papain הגישה לדיסוציאציה. חתיכות DSM מטופלים לראשונה עם פתרון אנזים המכיל פפאין ולאחר מכן עם הקולגן סוג II מסיסות באותו פתרון (DS, ניתוח/עיכול פתרון). גישה זו מניבה תאי DSM בודדים ממינים שונים, כולל שפן ניסיונות, חזיר, חולדה, עכבר, וחשוב ביותר (שולחן 1).
תאי DSM בודדים מספקים מקור לביולוגיה מולקולרית מספר ניסויים פיזיולוגיים. עד כה, ביטויי חלבון ו-mRNA למדו באמצעות האימונוציטוכימיה, או בדיקות ה-RT-PCR/רביעיית-PCR התגלו רמות גבוהות של גילוי עבור ערוצי יונים שונים, כולל מתח מוליכות גדול-ו-Ca2 +מופעל (BK), מוליכות קטנה ca2 +-הופעל k+ סוג 3 (SK3), מגודרת מתח k+ (kv), L-סוג מגודרת מתח Ca2 + (Cav), ו קולטן ארעי הפוטנציאל מסוג 4 (TRPM4) ערוצים, כמו גם Na/Ca2 + מחליף 14,15,16,17,18,19,20,21,22. הם כולם חשבו לשלוט על היכולת של ה-DSM, התאיים על2 + רמות והקונקטיליות. תיקון-קלאמפ גישות פיסיולוגיים, שבוצעו ישירות על חזיר גינאה, עכבר, עכברוש, או תאים DSM האדם, סיפק הפגנה ישירה של תכונות ביופיזיקלי ו פרמקולוגית של L-סוג Cav, kv (kv2. x. Kv7), SK, BK, ו TRPM4 ערוצים17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. הגישות כללו מלחציים בעלי מתח פנימי רגיל, מלחציים מחוררים ומצמד מתח מחורר, והקלטות של ערוץ יחיד (מצורפות תא, הפנים-החוצה ותצורות חיצוניות). בנוסף, הקלטה פוטנציאלית הממברנה של DSM באמצעות מלחציים הנוכחי סיפק ראיות כי היעד מרתק סוכנים תרופתי לשנות את היכולת של הסלולר. לדוגמה, TRPM4 מעכב 9-פנילאני המושרה היפרפולריזציה בתאי DSM שהתקבלו בני אדם, שפן גינאה, ו עכברוש שלפוחיות שתןשככים19,20,22,31. בין שיטות אלקטרופיזיולוגיות שונות, אמפוריטיצין-B (ו nystatin, מגרסידין, ו β-escin) מחורר הקלטות תיקון-קלאמפ לספק יתרון מפתח על ידי שמירה על מולקולות איתות מהותי תאיים ומסלולים. רק משקל מולקולרי נמוך הקטרים במידה פחותה, קלרנית- -אבל לא חלבונים או מולקולות איתות כולל Ca2 + -הם חדיר דרך נקבוביות קרום הפלזמה נוצר על ידי אמפוריטיצין-B או nystatin32. התוצאה המוצלחת של ניסויים מחורר מלחציים טלאי תלוי במספר משתנים כלליים ייחודי לטכניקה זו. כאן, אנו מתארים את פרטי ההליך ניצול אמפוריטיצין-B כי הקבוצה שלנו השתמשה בהצלחה במהלך השנים15,22,33,34,35,36,37,38,39.
לטעון, ערוצי הקטיון שאינם סלקטיבית נותרים אחד מסוגי הערוצים הפחות מובנים בתאי DSM. הדוח הראשון של ערוץ היון שאינו סלקטיבי מתאריך חזרה ל1993. המאמר על ידי ולנר וישראנברג11 תיאר 33 pS ערוץ יחיד המופעל למתוח המציג את סדר הדירוג הבא של חדירות היונים: K+> Na+>Cs+> > > Ba2 +> Ca2 +, ועיכוב של פעילות ערוץ על ידי Gd3 +, מעכב כללי של ערוצי קטיון לא סלקטיבית. כמעט עשור לאחר מכן, Thorneloe ו נלסון40 תיאר Na+ לחדיר זרמים היון בתאי DSM העכבר, מעוכבים על ידי Gd3 +, באמצעות הקלטות התאים השלם. מאז הזהויות המולקולריות של ערוצי הקטיון הבלתי-סלקטיבית והמאפיינים הביופיסיים שלהם נותרים, יש לקבוע חקירות עתידיות באזור מחקר זה. הפרוטוקול המתואר בזאת להקלטה של זרמים בערוץ הקטיון לא סלקטיבי-באמצעות מסחטות ומוצרים תאיים המכילים פתרונות מבוססי Cs+, תה+, ו nifedipine (שולחן 2) כי הטיה מבחינה פיזיולוגית ופרמקולוגית Kv ו-Cav והוא ימשיך להיות שימושי בחקירות אלקטרופיזיולוגיות של ערוצי היון לא סלקטיבי יש לנו מנוצל זה פרוטוקול ספציפי כדי לקבוע את היקף העיכוב של זרמי הקטיון של תא שלם על ידי TRPM4 channel חוסם 9-פנילl בפיג שפן, עכברוש ותאי DSM האדם19,20,22.
ביחד, השיטה המתוארת כאן לקבלת תאים מבודדים בודד DSM מתוך שלפוחית השתן האנושית מספק תאים קיימא מתאים מאוד לחקירות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות תצורות שונות של טכניקת התיקון-קלאמפ, Ca2 +-הדמיה, אימונוציטוטוכימיה, בתוך שיטת הליטיגציה האבובית באתרו, ואת תא בודד RT-Pcr/רביעיית-PCR, כמו גם טכניקות מתקדמות בביולוגיה מולקולרית כולל ניתוח MICROARRAY, RNA-seq, ו-שבב-seq. השימוש בשיטת התיקון האמפוריטיצין-B המחריב משמר את סביבת התא המקורי בניגוד לתצורות אחרות. כאשר בוצעו באמצעות התנאים הספציפיים המפורטים כאן, נועד לשלול את התרומות של K+ ו-Ca2 + זרמים בתאי DSM, זרמים המושרה בשלב המתח להציג את המאפיינים של זרמים היון לא סלקטיבי מתאים לביופיסיים ו פרמקולוגית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td>Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-Phenanthrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>211281</td>
			<td>TRPM4 channel inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP928-250</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>European Pharmacopoeia Reference Standards</td>
			<td>5</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-100MG</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9006</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Extracellular solution and DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-7.5</td>
			<td>Capillary for preparation of pulled patch electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8518</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>pCLAMP-10</td>
			<td>Commerical software and part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004177</td>
			<td>DS-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203025</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Miltex Dental Wax Technologies, Inc.</td>
			<td>18058351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer with Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-077-32</td>
			<td>Placed in tissue bath to monitor temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DDT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Reducing agents used together with Papain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Required to pull electrodes with very fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating foam tube rack/holder</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82017-634</td>
			<td>Used for holding tubes with enzymes for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid (Na salt)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>pH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Data Acquisition System</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-442-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroForge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Used for fire-polishing electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7634</td>
			<td>L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of Patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-metalic syringe needle, MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF-34G-5</td>
			<td>Filling of intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>DS-P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Axon Axopatch 200B</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC computer</td>
			<td>DELL</td>
			<td>Custom configuration</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Aspera Instruments</td>
			<td>PH700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427-436</td>
			<td>Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue bath, 100 mL</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>1583-101</td>
			<td>Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl tubing</td>
			<td>ColePalmer</td>
			<td>06405-3</td>
			<td>Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulator bath, Haake D1 L</td>
			<td>Haake</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Connected to tissue bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents

תאים שריר החלקה (DSM) הנמצאים בתוך הקיר שלפוחית השתן בסופו של דבר להקל על אחסון שתן והווצמה. הכנת תאי ה-DSM הניתנים, הטריים והמבודדים, מציגה אתגר טכני חשוב שההישג שלהם מספק תאים אופטימליים למחקרים פונקציונליים ומולקולריים נוספים. השיטה פותחה ופירט בזאת, בהצלחה בשימוש על ידי הקבוצה שלנו למעלה מעשור, מתאר את הניתוח של דגימות השתן האנושי האדם שהתקבלו ניתוחים שלפוחית משתן לאחר מכן טיפול בשני השלבים אנזימטי של חתיכות dsm ו נשחקו מכני כדי לקבל תאים מבודדים של dsm טרי. הצעד הראשון כרוך בניתוח כדי להפריד בין שכבת ה-DSM (המוכרת גם בשם מוסקולאריס) מרירית (אורוטאלינום, לאמינה קינאה, ורירית מוסקולריס) והרקמות החיבור, כלי הדם והאדיפוז הסמוכות. ה-DSM נחתך לחתיכות (2-3 מ"מ x 4-6 מ"מ) ב-Ca הנומינלי2 +המכיל פתרון לניתוח/עיכול (DS). חתיכות DSM מועברים בשלב הבא ומטופלים באופן רציף בנפרד עם DS המכיל פפאין ו-כולגנאז ב ~ 37 ° צ' צלזיוס עבור 30-45 דקות לכל שלב. בעקבות שוטף עם DS המכיל סרום ללא אנזים ומשולש עם מצננת אש מלוטשת, החלקים משחררים תאי DSM בודדים. תאי ה-DSM הבודדים מתאימים באופן אידיאלי לגבי מהדק-מלחציים ולמאפיינים פרמקלוגיים של ערוצי יונים. באופן ספציפי, אנו מראים כי TRPM4 channel חוסם 9-פניל מפחית זרמים מתח המסלול המתעלה הקליט עם הגישה אמפוריטיצין-B מחורר טלאי להתקרב. תאים DSM יכולים להיות גם ללמוד על ידי טכניקות אחרות כגון תא יחיד RT-PCR, ניתוח microarray, אימונוציטוטוכימיה, בסמיכות באתרו הקירבה, ו-Ca2 + הדמיה. היתרון העיקרי של ניצול תאי DSM יחיד הוא שתצפיות שנעשו מתייחסות ישירות מאפייני תא בודד נחשף. מחקרים של תאי ה-DSM הבודדים הטריים סיפקו תובנות חשובות המאפיינים את המאפיינים של ערוצי יונים שונים כולל לקטבת בשלפוחית השתן ותמשיך כתקן זהב בהסבר למאפייני הסלולר של DSM ומנגנוני רגולציה.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

אנו מתארים שיטה להכנת התאים בודדים טרי שרירים מבודדים או חלקה מתוך דגימות שלפוחית השתן של האדם העסקת שני צעדים הליך אנזימטי. תאים DSM שהתקבלו קיימא ניתן ללמוד על ידי שונים שיטות תא בודד כולל המתואר אמפוריטיצין-B תיקון מלחציים אלקטרופיזיולוגיה כדי לחשוף תכונות פיזיולוגיות ופרמקולוגית.

הכנה ושימוש בתאי השריר החלקים הרגילים של האדם הבודד לאפיון של 9-פניל-זרמים רגישים לקטיון

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...

דטרוסור תאי שריר חלקים יוצרים את הקיר של שלפוחית השתן שבסופו של דבר מקל על ביטול השתן ואחסון. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה מאומתת ואמינה לבידוד טרי של תאי שריר חלקים יחידים. תאי שריר חלקים מבודדים טריים מספקים הזדמנות לבדיקות אלקטרופיזיולוגיות ומולקולריות ברמת תא יחיד.על ידי לימוד תאי שריר חלקים detrusor יחיד משליטה, נורמלי, ושלפוחיות השתן האנושיות חולה, יש לנו את ההזדמנות כדי לאמת מטרות פרמקולוגיות כגון תעלות יון. תאי שריר חלקים detrusor אנושי יחיד הם אידיאליים עבור ניסויים אלקטרופיזיולוגיים כגון אלקטרופיזיולוגיה מהדק טלאי. כאן נציג דוגמה של לימוד ערוץ יון יחיד בשם TRPM4, קולטן חולף פוטנציאל מלסטטין ארבעה ערוץ, שהוא ערוץ יון לא סלקטיבי.טירונים עשויים להיאבק עם ניתוח וצעדי טיפול אנזימטי הדורשים יעילות והיכרות כולל הכרה בצעדים חשובים קריטיים להשגת תאי DSM מבודדים טריים. חשוב להכיר את היסטולוגיה של שלפוחית השתן האנושית, שלבי הפרוטוקול לבודד תאים בודדים נשארים גמישים, ובתחילה מצפים לקבל תאים תת-אופטימליים באמצעות פרוטוקול זה. התחל על ידי בחינת כל עובי דגימת שלפוחית השתן.הצמד את הדגימה, רירית פונה כלפי מעלה serosa למטה על צלחת סיליקון מצופה 150 מ"מ עגול מלא DS קר כקרח בזהירות להסיר את כל רירית על ידי ניתוח חד. חותכים כמה חתיכות שרירים חלקים או DSM ללא רירית. מניחים שלוש עד שש חתיכות DSM לתוך צינור עם אחד עד שני מיליליטר של DS מחומם מראש המכיל פפאין dithiothreitol, או DS-P.דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 45 דקות, הקפד לנער את הצינור כל 10 עד 15 דקות. לאחר הדגירה, להסיר את DS-P מהצינור בקצרה לשטוף את חתיכות DSM עם קרח קר DS. להעביר את DS עם חתיכות DSM לצינור חדש ולהסיר את DS, משאיר את חתיכות DSM בתחתית הצינור. הוסף אחד עד שני מיליליטר של DS המכיל קולגן מסוג II, או DS-C, לצינור.ולהודגר אותו ב37 מעלות צלזיוס עם רעידות מדי פעם. השליכו את ה-DS-C ושטפו את חתיכות ה-DSM שטופלו באנזים חמש עד עשר פעמים עם DS קר כקרח. לאחר הכביסה האחרונה להשאיר את DS בתוך הצינור, בעדינות triturate את החלקים עם פיפטה פסטר מלוטש אש לשחרר תאים DSM יחיד. פיפטה 0.25 כדי מיליליטר אחד של השעיית תא על תא תחתון זכוכית יושב על הבמה של מיקרוסקופ הפוך דגירה זה לפחות 45 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק.לאחר מכן, להסיר את DS מהאמבטיה ולהחליף אותו עם פתרון E באמצעות עירוי על. משוך אלקטרודות טלאי מרובות, ללטש את קצות האלקטרודה, ולמעיל את הטיפים בשעווה דנטלית במידת הצורך. מלא את הקצה של אלקטרודה תיקון עם פתרון פיפטה ללא אמפיטריץ'ין-B על ידי טבילה קצרה של האלקטרודה בתסרון.ההצלחה של אלקטרופיזיולוגיה של מהדק תלויה באיכות תא ה-DSM ובהתבודדות אמפיטריצין-B. מלאו את האלקטרודה באותה תספורת פיפטה המכילה אמפיטריצין-B והרו את האלקטרודה על מחזיק המחובר לשלב ראש מגבר מלחציים. השתמש micromanipulator למקם את האלקטרודה ממש מתחת לפני השטח של הפתרון החוץ תאי, כך קצה האלקטרודה הוא רק שקוע.לאחר מכן, לקבוע את ההתנגדות אלקטרודה באמצעות פונקציית חלון בדיקת קרום של תוכנת הרכישה המסחרית ולקדם את האלקטרודה לכיוון התא של עניין. כאשר נוגעים בפני השטח של התא עם האלקטרודה, יוצרים חותם גיגה על ידי הפעלת לחץ שלילי מהיר ועדין על האלקטרודה באמצעות צינורות. התוצאה היא לחץ שלילי בקצה האלקטרודה וכתוצאה מכך ג'יגה-חותם מוצלח כפי שאושר על ידי בדיקת הממברנה.אפשר 30 עד 60 דקות עבור amphotericin-B לפזר את פיפטה להיות מוכנס לתוך קרום הפלזמה, יצירת נקבוביות סלקטיבי בעיקר cations monovalent. המשך לעקוב אחר חותם הגיגה עם פונקציית בדיקת הממברנה. כאשר ניקוב התיקון הוא אופטימלי, לבטל את ארעי קיבוליות על ידי התאמת המחוגים עבור קיבוליות התא ועמידות הסדרה על המגבר.לאחר שנצפו זרמי הקטיון היציבים של צעד המתח, הקליטו זרמים עם פרוטוקול צעד מתח הניתוב כמתואר בכתב היד. החל תרכובת או מצב בדיקה פיזיולוגית כדי לבדוק על ידי עירוי על ולתזמן את התגובות לתנאי הבקרה והבדיקה, כמו גם את הסחף. פרוטוקול זה יכול לשמש לבידוד תאי DSM בריאים ורעננים למחקרים פונקציונליים ומולקולריים.תאי DSM בודדים בריאים מאופיינים על ידי מורפולוגיה בצורת ציר, קצוות פריכים ומוגדרים היטב, הילה מוגדרת היטב סביב התא ומראה התכווצות למחצה כאשר הם נצפים תחת המיקרוסקופ. יתר על כן, תאי ה- DSM המבודדים טריים מגיבים לגירוי מכני ולכרבכול. שברי תאים ותאים שאינם בני קיימא או מתעכלים יתר על כן יש להימנע בניסויים הבאים של מהדק טלאי.התאים המבודדים שימשו בניסויי מהדק טלאי מחוררים אמפיטרצין-B שבהם נמדדו זרמים שלמים של תאים עם פרוטוקול צעד מתח המושרה או רמפה בשלושה תאי DSM אנושיים שונים. ניסויים גילו כי 9-phenanthrol, מעכב ערוץ TRPM4, ביעילות ובהידור מעכב זרמי חיתוך DSM אנושיים. רכיב הזרם הרגיש ל-9 פנינתול ממחיש עיכוב חזק יותר במתחים חיוביים ותיקון כלפי חוץ.מצב של שלבי טיפול אנזימטיים, שלבים 2.2 ו 2.3, כולל טמפרטורה, משך טיפולים אנזימים, מקורות הרבה אנזימים ואיכות של תאי DSM, הם דטרמיננטים מרכזיים להשגת תאי DSM אנושיים באיכות גבוהה. תאי DSM אנושיים מתאימים באופן אידיאלי גם להערכת רמות השליח השני תאי כולל סידן ו- AMP מחזורי, גילוי ביטויי חלבון על ידי אימונוציטוכימיה, וביטוי שותף על ידי בדיקה משפטית פרוקסימלית situ, וביטוי mRNA על ידי RT-PCR, qRT-PCR, microarrays, ואת רצף הדור הבא. תאי DSM אנושיים קידמו את הבנתנו את התפקידים של ערוצי BK, סידן, TRPM4 בשלפוחית השתן.התפתחויות עתידיות יאפשרו לקשר באופן ספציפי תכונות אלקטרופיזיולוגיות או פרמקולוגיות עם פרופילי התמלול או הפרוטום.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

בידוד של האדם עורקי טבורי תאים שרירים חלקים (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

ערוץ יחיד הדמיה ניתוח וסידן בPodocytes של glomeruli מבודדת טרי

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption: העברת המיטוכונדריה MSC אדם מבודד בתאי גזע Glioblastoma

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...