Name: preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents
Uploaded: 2020-01-31T12:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH-R01DK106964 og P20DK123971 tilskudd til Georgi V. Petkov. Forfatterne takker Dr. Viktor Yarotskyy og Ms. Sarah Maxwell for kritisk evaluering av manuskriptet. Vi er også takknemlige til urologi ansatte kirurger ved MUSC og UTHSC: Drs. Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter, og Anthony Patterson samt MUSC og UTHSC Urology beboere: Drs. Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O'Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata for deres hjelp med menneskelig vevsamling.

Alle metoder beskrevet her har blitt godkjent av Institutional Review Board Committees ved University of Tennessee Health Science Center (Memphis, TN, IRB # 17-05714-XP), og Medical University of South Carolina (Charleston, SC, IRB # 00045232). De godkjente prosedyrene tillater hele tykkelse urinblæreprøver (> 1 cm med > 1 cm) - som inneholder alle lag, inkludert slimhinne, detrusor glatt muskel og serosa også er festet blodkar og fettvev) - som skal samles inn fra pasienter-donorer som gjennomgår kirurgisk delvis utvinning av blæren. Pasientdonorer er voksne (aldersgruppe studert til nå: 25 til 87 år), enten mann eller kvinne, med eller uten symptomer på overaktiv blære (klassifisert av American Urological Association I-PSS score41). Kirurgiske prosedyrer innebærer en rekke medisinske tilstander, inkludert radikal cystektomi for urotelkarsinom og adenokarsinom. I slike tilfeller er den innsamlede urinblæreprøven fjernt fra tumorstedet.
1. Disseksjon av DSM vev og utarbeidelse av slimhinne DSM stykker
<ol><li>Undersøk hele tykkelsen urinblære prøve som kom i laboratoriet fra operasjonsstuen i en tett forseglet beholder fylt med kald disseksjon / fordøyelseløsning(Figur 1 og tabell 2 for sammensetning av DS). MERK: Prøven holdes vanligvis i kaldt DS fra noen timer til over natten før ankomst i laboratoriet. For lengre lagring suppleres DS (tabell 2) med 1 mM CaCl2.</li>
	<li>Fjern og skyll den menneskelige hele tykkelsen DSM prøve (som inneholder alle lag, inkludert slimhinne, DSM, og serosa) med iskalde DS å vaske ut festet rusk og blod.</li>
	<li>Fest urinblæreprøven, slimhinnen vendt oppover og serosa ned, på en silikonenantiomerbelagt (Materialtabell) 150 mm diameter rund rett fylt med iskald DS (Figur 1B).</li>
	<li>Fjern det tilstøtende fettvevet, blodårene, epitelet (urotelet) og muskulær slimhinnen fra prøven ved skarp disseksjon ved hjelp av mikrosaks og tang.</li>
	<li>Klipp ut flere slimhinne DSM stykker (~ 2-3 mm lang og 4-6 mm bred) (Figur 1C).</li>
</ol>2. Enzymatisk dissosiasjon av DSM-stykker som gir nyisolerte enkelt DSM-celler
<ol><li>Plasser 3 til 6 DSM stykker i et rør som inneholder 1 til 2 ml pre-oppvarmet (~ 37 ° C) DS som inneholder papain og dithiothreitol (DS-P, Tabell 2) og inkubere DSM stykker i DS-P for 30-45 min ved ~ 37 ° C forsiktig risting røret av og til (en gang hver 10-15 min). MERK: For å optimalt kontrollere temperaturen for enzymatisk behandling plasseres rør med vevsstykker og enzymløsninger i enten et glassvevskammer fylt med vann koblet til et sirkulerende oppvarmet vannbad (figur 1D) eller et temperaturkontrollert bløtvannsbad med høy presisjon (figur 1E).</li>
	<li>Fjern DS-P fra røret, vask dsmstykker med iskald DS, kast kald DS fra røret og la DSM-stykker sitte nederst på røret.</li>
	<li>Tilsett 1 til 2 ml DS-inneholdende kollagenase type II (DS-C, tabell 2)til røret med DSM-stykker, bland forsiktig; og inkuber i 25-40 min ved ~ 37 ° C forsiktig risting røret av og til (hver 10-15 min).</li>
	<li>Kast DS-C og vask enzymbehandlet DSM stykker 5-10 ganger med iskald DS.</li>
	<li>Etter den siste vasken, la DS-løsningen være inne i røret; trituratmed en brannpolert Pasteur pipette flere ganger for å frigjøre enkelt DSM-celler.</li>
	<li>Plasser noen dråper DS-oppløsning som inneholder dsmceller i dsm-celler i et glassbunnkammer eller en dekkslip og inspiser visuelt for kvaliteten under et mikroskop (ved hjelp av et 20x- eller 40x-mål) etter minst 5 minutter etter søknaden for å la cellene følge bunnen.</li>
	<li>Bruk umiddelbart nyisolerte DSM-celler for elektrofysiologiske eksperimenter eller lagre cellene i et rør som inneholder DS ved ~ 4 °C enten på is eller i kjøleskap til bruk (vanligvis for opptil 8 h forberedelse). MERK: Innenfor samme preparat varierer kvaliteten på cellene fra svært levedyktig til overfordøyd, døde DSM-celler (figur 2). Når sekvensiell papain-kollagen-kollagenasemetoden gir et svært høyt antall ulevedyktige celler, kastes preparatet, og en ny fordøyelse av DSM-stykker utføres, men med reduserte inkubasjonsintervaller. Hvis prosedyren resulterer i for få DSM-celler, øker inkubasjonsintervallene. Positiv immunreaktivitet til α-glatt muskel actin bekrefter identiteten til DSM-celler (Figur 3).</li>
</ol>3. Opptak av spenningstrinn induserte kationstrømmer fra DSM-celler ved hjelp av amfotericin-B perforert helcellespenningpatch-klemmeteknikk
<ol><li>Pipette 0,25-1 ml cellesuspensjon på et bunnkammer i glass som sitter på et stadium av et omvendt mikroskop og lar cellene holde seg til glassbunnen.</li>
	<li>Etter inkubasjon i minst 45 min, fjern DS fra badekaret og erstatt med E-løsningen (Tabell 2) ved superfusjon der løsningsstrømmen hjulpet av tyngdekraften via innløpsrørsombremser erstatter DS med den nye løsningen mens utløpsrør som er koblet til et vakuumavfallsfartøy, fjerner kammerløsningen og forhindrer overløp. Vær oppmerksom på at E-løsningen inneholder tetraethylammonium (TEA+) og cesium (Cs+) ioner for å hemme K+ strømmer.</li>
	<li>Forbered en arbeidslagerløsning av amfotericin-B i dimetylsulfoksid (DMSO) (1 mg per 10 μL DMSO). For å oppløse amfotericinpulver fullt ut, sonikere (minst 15 min) og vortex løsningen godt. MERK: Dette trinnet tar vanligvis mindre enn 10 min. Oppløsning av 3-4 mg amfotericin-B i 30-40 μL DSMO i et 1,5 ml mikrocentrifugerør fungerer bra. Høyere mengder amfotericin-B krever mer DSMO-løsningsmiddel som vanligvis resulterer i et lengre intervall for blanding og ufullstendig løsering av amfotericin-B faste partikler som finnes i røret.</li>
	<li>Oppløs lageroppløsningen av amfotericin-B i pipetteoppløsningen (oppløsning P, tabell 2) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 200-500 μg/ml. Dette trinnet krever omfattende sonikering og virvlende med høy hastighetinnstilling (8-10/10) for ~ 30 til 60 min per trinn for å sikre optimal blanding og forebygging av amfotericin-B-utfellingsdannelse i pipetteoppløsningen. MERK: Amfotericin-B vil utløse overtid og er lysfølsom. Arbeidspipetteoppløsningen som inneholder Amphotericin-B kontrolleres for løselighet, håndblandet før pipettfylling og oppbevares i mørket.</li>
	<li>Trekk flere patch elektroder, brann-polsk elektrode tips, og (om nødvendig) belegge tipsene med tannvoks.</li>
	<li>Fyll spissen av en patchelektrode med pipetteoppløsningen (løsning P, tabell 2) uten amfotericin-B ved å dyppe elektroden i oppløsningen en kort stund.</li>
	<li>Fyll elektroden med samme pipetteoppløsning som inneholder amfotericin-B.</li>
	<li>Monter elektroden på en holder som er koblet til et lappeklemmeforsterkere hodetrinn.</li>
	<li>Bruk en mikromanipulator til å plassere elektroden like under overflaten av den ekstracellulære løsningen slik at elektrodens spiss bare er nedsenket.</li>
	<li>I spenningsklemmemodus setter du inneerpotensialet til 0 mV og justerer strømmen til 0 pA med pipetteforskyvningsskiven på den kommersielle forsterkeren (Materialtabell).</li>
	<li>Bestem elektrodemotstanden ved hjelp av membrantestvinduet/funksjonen til den kommersielle oppkjøpsprogramvaren (Materialtabell). For å aktivere klikk Verktøy> Membrantest> Spill av eller et snarveisikon i programvaren. Den bestemte elektrodemotstanden bør være i området 2 til 5 MΩ. MERK: Membrantestfunksjon i den kommersielle oppkjøpsprogramvaren eller Seal Test-alternativet på forsterkeren kan brukes til å overvåke elektrodebestandighet ved å bruke spenningstrinn gjentatte ganger.</li>
	<li>Fortsett å overvåke elektrodemotstand en gang mot en valgt DSM-celle med mikromanipulator (figur 4A). MERK: For å bli betraktet som en levedyktig DSM-celle, må cellen vise spindelformet langstrakt morfologi, en veldefinert glorie rundt cellen, skarpe kanter og semi-kontraktile (slange) utseende.</li>
	<li>Når du berører celleoverflaten med elektroden - indikert av en rask økning i elektrodemotstanden målt med membrantestfunksjonen - danner du en giga-tetning ved å bruke mildt raskt negativt trykk på elektrodeholderen via rør. Dette resulterer i negativt trykk opprettet på spissen av elektroden som trekker cellemembranen inn i elektrodehjelp i dannelsen av en giga-forsegling eller en svært tett kontakt mellom elektroden og plasmamembranen (Figur 4B).</li>
	<li>Når giga-tetningen dannes, må du kompensere pipettekapasitansen ved å justere raske og langsomme ringer på den kommersielle forsterkeren og overvåke giga-tetningsstabiliteten (lekkasjestrøm) ved hjelp av membrantestfunksjonen.</li>
	<li>Tillat tid, vanligvis 30-60 min, for amfotericin-B å spre ned pipette og settes inn i plasmamembranen danner porer primært selektivtil monovalente kationer. I løpet av dette trinnet fortsetter du å overvåke giga-tetningen med membrantestfunksjonen. Som celleperforering øker så gjør amplituden av kapasitanstransienter (sammenlign figur 4B versus figur 4C som viser ingen og effektiv celleperforering, henholdsvis) målt med membrantestfunksjonen.</li>
	<li>Når patchperforeringen er optimal (dømt av stabil seriemotstand vanligvis under 50 MΩ), avbryte ut kapasitanstransienter ved å justere ringer for cellekapasitans og seriemotstand på forsterkeren. Seriemotstandskompensasjon kan også utføres på dette tidspunktet (figur 4D).</li>
	<li>Når stabile spenningstrinn induserte kationstrømmer fremkalt av den angitte protokollen observeres, bruk en sammensatt eller fysiologisk tilstand for å teste ved superfusjon og registrere svarene for kontroll-, testtilstanden og utvaskingen (hvis mulig) med kommersiell oppkjøpprogramvare.<ol>
<li>Rekordstrømmer med en rutinemessig spenningstrinnprotokoll som innebærer å holde DSM-celler på -64 eller -74 mV og gå over spenningen i trinn på 10 mV for 400 eller 500 ms fra -94 til +96 eller +106 mV og gå tilbake til inneværende potensial. MERK: Membranens potensielle verdier justeres for et væskekoblingspotensial på 14 mV (ved hjelp av P- og E-løsninger, tabell 2). Væskekoblingspotensialet oppnås i den kommersielle oppkjøpsprogramvaren (Materialtabell) ved å klikke (Verktøy> Junction Potentials) og angi konsentrasjonene av løsningskomponenter. En rampeprotokoll kan også brukes til å skaffe gjeldende opptak.</li>
		<li>Kjør spenningsprotokollen i kontinuerlig ~ 1 min intervall under et eksperiment opptaksstrømmer for pre-addisjonskontroll, testtilstand og utvasking.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Dataanalyse og visualisering
<ol><li>Åpne innspilte filer i den kommersielle dataanalyseprogramvaren (Materialoversikt) for kontroll, testtilstand og utvasking ved å klikke File>Åpne data og velge filer av interesse for åpning. MERK: For analyse åpnes og analyseres vanligvis tre filer (hver som inneholder ett enkelt sett med spor til en enkelt protokollkjøring) for hver betingelse åpnes og analyseres. Svarene er senere gjennomsnittlig for å få et gjennomsnittlig svar for hver tilstand. Programvaren som brukes til datainnsamling inneholder et alternativ for å automatisk samle inn brukerspesifiserte flere testkjøringer og gjennomsnittlig dem for enkeltutdatafil som kan brukes som et alternativ.</li>
	<li>Få gjennomsnittlig respons i løpet av de siste 200 ms for gjeldende spor målt ved hver spenning; varighetsintervallet som er valgt, gjenspeiler et steady-state nivå av spenningstrinn strømaktivering. For å gjøre dette, følg trinnene nedenfor.<ol>
<li>Velg en fil av interesse for analyse i den kommersielle analyseprogramvaren (Table of Materials). MERK: Programvaren plasserer den sist importerte filen i det aktive visningsvinduet. Den åpne filen viser en rekke overlappende spor oppnådd med en spenningstrinnprotokoll. Som standard vises fire markører i det aktive vinduet (som viser x- og y-verdier for den uthevede sporingen).</li>
		<li>Velg området for analyse ved å plassere markør 2 på slutten av 400 eller 500 ms spenningstrinn og markør 1 i intervallet på 200 ms før det slik at analyseområdet er 200 ms.</li>
		<li>Få svar for hver spenning ved å klikke på Analyser> Hurtiggraf> IV (eller IV-snarveisikonet) (i ledetekstvinduet før du genererer data bekrefter at for y-akse (gjeldende) signal regionalternativer "Markører 1..2" og "Mean" er valgt). Klikk OK for å generere I-V-diagrammet og plassere dataene i et resultatkolonneark som kan vises ved å få tilgang til Windows>Resultater.</li>
		<li>Analyser flere filer ved å gjenta trinn 4.2.1 - 4.2.3. Klikk Analyser>Hurtigdiagram>IV eller snarveien til IV-ikonet, velg Tilføy i stedet for Erstatt for å legge til flere data i Resultat-arket når du behandler sporene.</li>
		<li>Kopier data til et regneark ved å merke kolonnene for interesse og trykke CTRL+C for å kopiere og CTRL+V for å lime inn. Lagre resultatregnearket i det kommersielle analyseprogrammet (Materialoversikt) i (*.rlt)-format ved å klikke Fil>Lagre som.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For hver celle normaliseres svarene for alle tre betingelsene til verdien av maksimumsspenningstrinnet for pre-add-kontrollen (i henhold til formelen: Respons/Responskontroll-Max) og graf svarene som gjeldende (eller gjeldende tetthet) verdier versus spenningsrelasjoner (Figur 6).<ol>
<li>I en regnearkprosessor bestemmer du gjennomsnittlige svar som enten strømmer (pA) eller gjeldende tettheter (pA/pF) for kontroll, testtilstand (i dette eksemplet 9-fenantropl) og utvasking ved hvert spenningstrinn.</li>
		<li>Del verdier for hver spenning i hver tilstand (kontroll, 9-fenantrol og utvasking) med maksimal kontrollrespons oppnådd ved høyeste spenning (+96 mV i figur 6) for pre-addisjonskontrollen etter formelen: Normalisert respons for tilstand(x) = Respons(x)/Responskontroll-Max for (x).</li>
	</ol>
</li>
	<li>For sammendragsanalyse ordner du dataene i et format som enkelt kan kopieres til et grafisk program (f.eks. GraphPad Prism) for visualisering.</li>
</ol>

Prosedyrene som er beskrevet her forklarer trinnene som er involvert i utarbeidelsen av levedyktige, nyisolerte DSM-celler fra hele tykkelsen menneskelige urinblæreprøver ved hjelp av enzymatisk fordøyelse og i registrering av helcellekationstrømmer som er følsomme for TRPM4-kanalhemmeren 9-fenantrol som bruker amfotericin-B perforert patch-clamp tilnærming. Den enzymatiske prosedyren er avhengig av en to-trinns sekvensiell eksponering referert til heri som sekvensiell papain-kollagen-kollagennase fordøyelsesmetode. DSM vev behandles først med papain og dithiothreitol (et enzymstabiliserende middel) under en nominell Ca2 +-fri tilstand, etterfulgt i andre trinn av kollagenavtype II i nærvær av lav Ca2 +. Begrunnelsen for å utføre papain fordøyelse under lave Ca2 + forhold i glatte muskelceller dateres tilbake til slutten av 1980-tallet. Nyisolert halspulsåren glatt muskelceller utarbeidet med papain viste en langstrakt form, viste levedyktighet (motstand mot Trypan Blue opptak) og svarte på kontraktile stimuli (høyere Ca2 + og histamin)65. År senere ble denne metoden brukt i utarbeidelsen av DSM-celler (se tabell 1). Valget av kollagenase type II i stedet for andre typer er knyttet til sin relativt høye proteolytiske aktivitet ideelt egnet for glatt muskelvev inkludert DSM. Faktisk kan kollagenbehandling alene gi enkelt DSM-celler som krever omfattende enzymeksponering (≥60 min)53,54. Siden kollagenslikaktivitet avhenger av Ca2+ og enzymet er inaktivt under Ca2 +-frie forhold, krever optimal enzymatisk fordøyelse av DSM-stykker tilstedeværelsen av Ca2 + 66. I vårt tilfelle inneholder DS-C 100-200 μM [Ca2 +] (Tabell 2). Etter enzymatisk behandling vaskes fordøyd DSM-stykker forsiktig en rekke ganger med kald DS uten enzymer eller Ca2+ for å fjerne ethvert enzym som er bundet til vev. Den iskalde DS bidrar til å bevare DSM celle integritet og å begrense enzymatisk aktivitet av eventuelle gjenværende papain eller kollagen. I siste trinn frigjør tredning av enzymbehandlede DSM-stykker med en brannpolert Pasteur pipette enkelt DSM-celle. DSM-celler plasseres enten umiddelbart på et opptakskammer for patch-clamp studier eller andre typer eksperimentering eller lagret på is i DS for bruk senere på samme dag (vanligvis innen 8 timer etter forberedelse, men cellene forblir levedyktige i opptil 24 timer).
Vi identifiserte flere viktige hensyn for vellykket å skaffe enkelt DSM-celler. Den første gjelder den menneskelige DSM prøvekildekvalitet. For å optimalt bevare vevsintegritet, er DSM-prøver hentet fra åpne blæreoperasjoner plassert i iskalde DS så snart som mulig og opprettholdes i et kaldt miljø. Spesielt ved kirurgisk ekstraksjon fra pasienten, plasseres blæreprøven umiddelbart på et fullt forberedt sidebord i operasjonssalen. Grov undersøkelse av hele prøven (vanligvis oppnådd under radikal eller enkel cystektomi) og åpningen følger. Etter visuell inspeksjon fjernes et stykke hele tykkelse urinstigeprøve fra et avsidesliggende område av prøven grovt uinvolvert med svulst og umiddelbart plassert i en kopp (enten 50 eller 100 ml) som inneholder kald (~ 4 °C) disseksjonsløsning (DS) (tabell 2) og deretter tett lukket med lokk. På grunn av den planlagte karakteren av høsting av vevet, blir operasjonspersonalet og hjelpepersonalet som gjør høstingen varslet ved starten av det kirurgiske tilfellet for å ha materialene tilgjengelig i operasjonssalen på tidspunktet for vevsekstraksjon. Disse forholdsreglene sammen med den rutinemessige, repeterende karakteren av behandlingstrinnene holder den varme iskemitiden for vevet - fra ekstraksjon til plassering i den kjølte beholderen med DS-oppløsning - til mindre enn 5 min. Beholderen plasseres deretter i kjøleskap eller på is i en kjøler for å opprettholde det kalde miljøet og transporteres (iskald) til laboratoriet. Når prøven kommer til laboratoriet, starter disseksjon stoiogeringstrinn. Det er svært vanskelig å forutsi om en gitt DSM-prøve vil gi DSM-celler av høy kvalitet etter enzymatisk dissosiasjon, så vi fortsetter med de enzymatiske dissosiasjonstrinnene. I mange tilfeller, parallelt med elektrofysiologiske eksperimenter, utfører gruppen vår isometriske spenningsopptak på DSM-strimler utarbeidet fra de samme DSM-prøvene. Vi har funnet ut at vi vanligvis kan få dsmceller av høy kvalitet fra preparater som også med hell gir levedyktige strimler for isometriske sammentrekningsstudier (vår upubliserte observasjon).
Den andre faktoren er knyttet til ulike enzympartivariabilities. Vi observerte at for både papain og kollagen type II, hver gang en ny mengde enzym kommer fra en leverandør, kan enzymaktiviteten i DS for vevsfordøyelse variere. Vi optimaliserer derfor rutinemessig enzymkonsentrasjonen og inkubasjonsintervallene for hver nye tomt. For å minimere mye variasjon bidrag, bestiller vi større mengder av samme mye og lage en stor batch av lagerløsninger i 2 ml aliquots av enzymer og lagre dem på ~ -20 ° C til bruk. Over tid kan imidlertid frosne aksjer (lagret opptil 2 uker) miste sin enzymatiske aktivitet. Den tredje variabelen er knyttet til temperaturen på enzym fordøyelsebehandlinger. Enzymatiske aktiviteter av både papain og kollagenviser viser temperaturavhengighet. Papain og kollagenase type II viser aktivitet i temperaturområdene som omfatter normal kroppsfysiologi67,68. Derfor tar vi sikte på å opprettholde enzymbehandlingene stabile ved ~ 37 °C for å unngå høyere temperaturer for å bevare DSM celleintegritet. Den fjerde vurderingen gjelder variasjonen av kvaliteten på DSM-celler tilstede i hvert preparat som spenner fra svært levedyktige (viser gode klassiske glatte muskelegenskaper) til ikke-sunne, overfordøyde celler. Et langvarig enzyminkubasjonsintervall er en av hovedårsakene til å få et høyt antall skadede celler. Overdreven enzymbehandlinger svekker også proteinstrukturer av ionkanaler, reseptorer og transportører, som påvirker funksjonaliteten negativt. Tolkning av resultater hentet fra enzymatically innhentet, nyisolerte celler bør huske på denne vurderingen. Optimalisering av enzymfordøyelsesforhold tar sikte på å øke prosentandelen av svært levedyktige celler. Eksperimentelle tilnærminger som er avhengige av et høyere antall levedyktige celler som mikroarrayanalyser krever mer robuste optimaliseringer enn de som utføres på færre celler som encellede elektrofysiologi eller Ca2+ bildebehandling. Vurdering av de nevnte faktorene har veiledet vår forskningsinnsats det siste tiåret i å oppnå høy kvalitet enkelt DSM celler.
Den perforerte patch-clamp teknikken har vært en bærebjelke elektrofysiologisk tilnærming i over et kvart århundre. Flere publikasjoner gir detaljer om de tekniske hensyn69,70,71,72,73. Celleperforering kan oppnås med amfotericin-B, nystatin, gramicidin eller β-escin (se referanse32for oversikt over hver). Den største fordelen med perforerte patch-clamp opptak over andre elektrofysiologiske tilnærminger er at det opprinnelige intracellulære miljøet - inkludert intracellulær Ca2+ 2+og signalmolekyler (f.eks. cAMP, PKA, fosfater og fosfodiesteraser) - bevares. Denne teknikken er derfor ideelt egnet for å undersøke hele celle ion kanal strømmer og deres regulatoriske mekanismer under nær fysiologiske forhold. En viktig påminnelse er at intracellulær cellesammensetning ikke kan kontrolleres nøyaktig i motsetning til andre elektrofysiologiske metoder som konvensjonelle helecelle- og enkanals utskårne patcher (innvendig- og utadvendt) opptak. Etter vår erfaring bidrar tre faktorer rutinemessig til vellykkede eksperimentelle resultater av amfotericin-B-perforerte patch-clamp eksperimenter. Den første er kvaliteten på DSM-cellen som er valgt til å prøve et opptak. Når DSM-celler er svært levedyktige som viser en semi-kontraktile (serpentin-lignende), høy kontrast skinnende utseende med en veldefinert glorie rundt celleoverflaten og feste tett til glassbunnen av opptakskammeret deretter giga-tetning dannelse og celle perforering forekommer relativt enkelt. De andre og tredje faktorene for suksess, henholdsvis, er knyttet til kvalitet på kilde og løsering av amfotericin-B (i dimetylsulfoksid / DMSO og intracellulær pipetteløsning). Vi observerte avvik blant ulike leverandører når det gjelder kilde- og partivariasjoner. Hver dag forbereder vi en frisk løsning av amfotericin-B lagerløsning fra pulver etterfulgt av fortynningen i intracellulær pipetteløsning. Disse trinnene krever omfattende sonikering og virvlende. Med nylaget amfotericin-B-holdig pipetteløsning, vellykket celleperforering (<50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K mω)="" following="" giga-seal="" formation="" can="" be="" usually="" obtained="" within="" 30="" min.="" the="" concentration="" of="" amphotericin-b="" in="" the="" pipette="" solution="" also="" requires="" optimization="" dependent="" on="" the="" amphotericin-b="" lot="" and="" source.="" under="" our="" experimental="" conditions,="" the="" final="" amphotericin-b="" concentrations="" in="" the="" pipette="" range="" from="" 200="" to="" 500="" µg/ml.="" since="" amphotericin-b="" exhibits="" light="" sensitivity,="" its="" solutions="" need="" to="" be="" kept="" in="" the="" dark.="" using="" the="" amphotericin-b="" perforated="" patch-clamp="" technique,="" our="" group="" recorded="" voltage-step="" induced=""></50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K>+, Ca2+ 2+, og ikke-selektive kationstrømmer fra humane, marsvin, mus og/eller rotte-DSM-celler17,21,22,23,29,30,31,35,60. Her beskriver vi forhold for registrering av ikke-selektive kationstrømmer i humane DSM-celler. 9-Phenanthrol, en blokkering av TRPM4-kanaler, attenuated spenningstrinn indusertstrømmer som støtter rollen til disse kanalene i kontroll av DSM excitability. Som et notat krever det vanligvis minst 45 minutter etter å ha fått en giga-tetning og initiering av perforering for å registrere optimale stabile spenningstrinn indusert ikke-selektive kationstrømmer. Spenningsramper kan også brukes som et alternativ til spenningstrinnprotokoller30,64. Her ble en spenningstrinnprotokoll fra et hyperpolarisert holdingmembranpotensial foretrukket i stedet for en rampeprotokoll siden den tidligere tilnærmingen minimerer effekten av spenningsavhengig inaktivering og gir mulighet for å utnytte fremkalt strøm over en varighet av et spenningstrinn der rampen gir et enkelt datapunkt per spenning. Det siste punktet gjelder spesielt for humane DSM-celler, da strømmene viser variabel aktivitet under spenningstrinn (Figur 5OgFigur 6). Den amhotericin-B perforert patch-clamp teknikken har vært avgjørende for å identifisere egenskapene til DSM celler og andre celletyper, og vil fortsette å hjelpe i å gi nye funn i fremtiden. Videre kan nyisolerte enkelt DSM-celler brukes til å måle hele celle K+Cl-og Ca2+ 2+strømmer med den konvensjonelle modusen for patch-clamp-teknikken, membranpotensiell opptak med gjeldende klemme og enkeltkanalopptak som eksemplifisert av våre tidligere rapporter23,29,35,64.
I tillegg til enkeltcellepatch-clamp metoder, kan nyisolerte DSM-celler studeres med andre tekniske tilnærminger, inkludert Ca2 + bildebehandling, RT-PCR / q-RT-PCR, immuncytokjemi, i situ nærhet ligation analyse, og genomiske tilnærminger (f.eks mikroarray, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Etter hvert som enkeltcelletranskripsjonsmetoder fortsetter å utvikle seg og blir svært følsomme, ser vi for oss i en fremtidig evne til rutinemessig og spesifikt å knytte elektriske eller farmakologiske egenskaper til individuelle DSM-celler med sine transkripsjons-/proteomeprofiler. Dette vil oppnås ved første opptak fra en DSM-celle og deretter trekke ut mRNA eller protein etterfulgt av transkripsjonomiske / proteomiske analyser. Selv om slike metoder allerede er testet i ikke-DSM-celler, er de i dag teknisk utfordrende, mangler følsomhet for å bli vurdert rutine, og begrenset til vellykket påvisning av noen utvalgte genprodukter74. Funksjon-molekylær profil uttrykk linking studier når gjort på DSM celler hentet fra urinblærer avledet fra kontroll og syke pasient-donorer vil gi innsikt i fysiologiske prosesser avgjørende for å kjøre normale DSM funksjoner, patogenesen, og i å identifisere effektive nye terapeutiske tilnærminger.

Detrusor glatte muskelceller (DSM) utgjør den mest tallrike celletypen i urinblæren og til slutt kontrollere urinlagring og annullere gjennom avslapning og sammentrekning, henholdsvis. DSM-celler danner glatte muskelbunter som henger sammen med tilstøtende bindevev, nerveprosesser, interstitielle celler og andre celletyper1. Den nåværende forståelsen av rollen som DSM-celler i urinblærefunksjonen er oppnådd gjennom en multi-level integrert tilnærming. Hver eksperimentell metode - enten basert på isolerte enkeltceller in vitro, vevstrimler som inneholder glatte muskelbunter in vitro/ ex vivo, eller in vivo bestemmelser (som cytometri og annullering funksjonsvurderinger) - gir viktig og spesifikk innsikt i fysiologiske og farmakologiske egenskaper av DSM (se vurderinger1,2,3,4,5,6 for detaljer). Tolkning av resultater hentet fra isolerte enkeltceller gjør det imidlertid mulig å tilskrive konklusjoner spesifikt til skrevet av selve enkeltcelletypen. Denne erkjennelsen har vært drivkraften for å etablere en pålitelig og reproduserbar metode for å skaffe nyisolerte DSM-celler fra hele tykkelsen urinblæreprøver. I motsetning til mange andre celletyper, glatt muskelceller kan ikke være pålitelig kultivert på grunn av tap av deres innfødte fenotype inkludert spesifikke endringer i deres elektrofysiologiske og kontraktile egenskaper7,8. Dette faktum forsterker ytterligere betydningen av studier utført på fysiologisk aktive nyisolerte DSM-celler.
På slutten av 1980-tallet og tidlig på 1990-tallet publiserte Isenbergs gruppe (Tyskland) en rekke elektrofysiologiske studier på nyisolerte DSM-celler hentet fra marsvinurinblære9,10,11,12,13 ( Tabell1). Metoden fremhevet to viktige observasjoner som hjalp til med å skaffe vitale celler og fungerte som en innledende retningslinje for andre å følge. De var 1) pre-behandling isolerte DSM stykker med Ca2 +-fri løsning / medium før enzymatisk behandling og 2) vev fordøyelse med en løsning som inneholder kollagen. Disse to kritiske trinnene er innlemmet i alle de påfølgende variantene av DSM-celledissosiasjonsprosedyrer (tabell 1). For tiden benytter vår gruppe en to-trinns sekvensiell papain-collagenase dissosiasjon tilnærming. DSM-stykker behandles først med en enzymløsning som inneholder papain og deretter med kollagentype II solubilisert i samme løsning (DS, disseksjons-/fordøyelsesløsning). Denne tilnærmingen gir enkelt DSM-celler fra ulike arter, inkludert marsvin, gris, rotte, mus og viktigst menneskelig (Tabell 1).
Enkelt DSM-celler gir en kilde til multippel molekylærbiologi og fysiologiske eksperimenter. Så langt har protein- og mRNA-uttrykk studert med immuncytokjemi, eller RT-PCR/qRT-PCR-bestemmelser viste høye nivåer av deteksjon for ulike ionkanaler, inkludert den store ledningsspenningen- og Ca2+-aktivert (BK), liten ledning Ca2 +-aktivert K+ type 3 (SK3), spenningsgated K+ (Kv),L-type spenningsgated Ca2 + (Cav),og forbigående reseptor potensielle melastatin type 4 (TRPM4) kanaler, samt en Na / Ca2 + veksler 14,15,16,17,18,19,20,21,22. De er alle antatt å kontrollere DSM spenning, intracellulær Ca2 + nivåer og kontraktilitet. Patch-clamp elektrofysiologiske tilnærminger, utført direkte på marsvin, mus, rotte, eller humant DSM celler, gitt direkte demonstrasjon av biofysiske og farmakologiske egenskaper av L-type Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK, og TRPM4 kanaler17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. Tilnærmingene inkluderte en konvensjonell spenningsklemme i hele cellen, en perforert spenningsklemme og enkeltkanalsopptak (cellefestet, innvendig og utvendig e-konfigurasjoner). I tillegg ga membranpotensiell registrering av DSM ved hjelp av en strømklemme bevis på at målrettede farmakologiske midler endrer cellespenning. For eksempel, TRPM4 hemmeren 9-fenanthrol indusert hyperpolarisering i DSM celler hentet fra mennesker, marsvin, og rotte urinblærer19,20,22,31. Blant de ulike elektrofysiologiske metodene gir amfotericin-B (og nystatin, gramicidin og β-escin) perforerte patch-clamp-opptak en viktig fordel ved å bevare iboende intracellulære signalmolekyler og veier. Bare lav molekylærvekt og i mindre grad, Cl- - men ikke proteiner eller signalmolekyler inkludert Ca2 + - er gjennomtrengeliggjennom plasmamembranporene dannet av amfotericin-B eller nystatin32. Det vellykkede resultatet av perforerte patch-clamp eksperimenter avhenger av flere generelle variabler som er unike for denne teknikken. Her beskriver vi detaljene i prosedyren ved hjelp av amfotericin-B som vår gruppe har brukt med hell gjennom årene15,22,33,34,35,36,37,38,39.
Uten tvil forblir ikke-selektive kationkanaler en av de minst forståtte kanaltypene i DSM-celler. Den første rapporten om en ikke-selektiv kationlignende kanal dateres tilbake til 1993. Papiret av Wellner og Isenberg11 beskrev en 33 pS stretch-aktivert enkeltkanal som viser følgende rangeringsrekkefølge av ion permeabilitet: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+, og hemming av kanalaktivitet av Gd3 +, en generell hemmer av ikke-selektive kationkanaler. Nesten et tiår senere beskrev Thorneloe og Nelson40 Na+ gjennomtrengelige kationstrømmer i mus DSM-celler, hemmet av Gd3+, ved hjelp av helcelleopptak. Siden molekylære identiteter av ikke-selektive kationkanaler og deres biofysiske karakteriseringer gjenstår å bli bestemt, er fremtidige undersøkelser i dette forskningsområdet berettiget. Protokollen som er beskrevet her for opptak av ikke-selektive kasjonskanalstrømmer - ved hjelp av ekstracellulære og pipette intracellulære løsninger som inneholder Cs+, TEA+og nifedipine (Tabell 2) som fysiologisk og farmakologisk redusere Kv og Cav strømmer - har vært og vil fortsette å være nyttig i elektrofysiologiske undersøkelser av ikke-selektive kationkanaler. Vi har benyttet denne spesifikke protokollen for å bestemme omfanget av hemming av hele celle kationstrømmer av TRPM4 kanalblocker 9-fenantrop i marsvin, rotte og menneskelige DSM celler19,20,22.
Samlet sett gir metoden som er beskrevet her for å skaffe nyisolerte enkelt DSM-celler fra human urinblære levedyktige celler som er svært egnet for elektrofysiologiske undersøkelser ved hjelp av ulike konfigurasjoner av patch-clamp-teknikken, Ca2 +-imaging, immunocytochemistry, in situ proximal litigation assay, og single cell RT-PCR/qRT-PCR samt avanserte molekylærbiologiteknikker, inkludert mikroarrayanalyse, RNA-seq og CHIP-seq. Bruken av amfotericin-B perforert patch-clamp metoden bevarer det opprinnelige cellemiljøet i motsetning til andre konfigurasjoner. Når utført ved hjelp av de spesifikke forholdene som er skissert her, designet for å bidrag av K+ og Ca2 + strømmer i DSM-celler, viser spenningstrinn induserte strømmer egenskapene til ikke-selektive kationstrømmer egnet for biofysiske og farmakologiske karakteriseringer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td>Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-Phenanthrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>211281</td>
			<td>TRPM4 channel inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP928-250</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>European Pharmacopoeia Reference Standards</td>
			<td>5</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-100MG</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9006</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Extracellular solution and DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-7.5</td>
			<td>Capillary for preparation of pulled patch electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8518</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>pCLAMP-10</td>
			<td>Commerical software and part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004177</td>
			<td>DS-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203025</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Miltex Dental Wax Technologies, Inc.</td>
			<td>18058351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer with Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-077-32</td>
			<td>Placed in tissue bath to monitor temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DDT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Reducing agents used together with Papain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Required to pull electrodes with very fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating foam tube rack/holder</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82017-634</td>
			<td>Used for holding tubes with enzymes for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid (Na salt)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>pH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Data Acquisition System</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-442-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroForge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Used for fire-polishing electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7634</td>
			<td>L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of Patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-metalic syringe needle, MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF-34G-5</td>
			<td>Filling of intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>DS-P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Axon Axopatch 200B</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC computer</td>
			<td>DELL</td>
			<td>Custom configuration</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Aspera Instruments</td>
			<td>PH700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427-436</td>
			<td>Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue bath, 100 mL</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>1583-101</td>
			<td>Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl tubing</td>
			<td>ColePalmer</td>
			<td>06405-3</td>
			<td>Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulator bath, Haake D1 L</td>
			<td>Haake</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Connected to tissue bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents

Detrusor glatte muskelceller (DSM) som finnes i urinblæreveggen, letter til slutt urinlagring og annullering. Utarbeidelse av levedyktige, friske og isolerte DSM-celler presenterer en viktig teknisk utfordring hvis prestasjon gir optimale celler for påfølgende funksjonelle og molekylære studier. Metoden utviklet og utarbeidet heri, vellykket brukt av vår gruppe i over et tiår, beskriver disseksjon av menneskelige urinblæreprøver hentet fra åpne blæreoperasjoner etterfulgt av en enzymatisk to-trinns behandling av DSM-stykker og mekanisk triturasjon for å oppnå nyisolerte DSM-celler. Det første trinnet innebærer disseksjon for å skille DSM-laget (også kjent som muscularis propria) fra slimhinnen (urothelium, lamina propria og muscularis mucosa) og tilstøtende binde, vaskulære og fettvev til stede. DSM kuttes deretter i biter (2-3 mm x 4-6 mm) i nominell Ca2+-holdig disseksjon/fordøyelsesløsning (DS). DSM stykker overføres neste til og sekvensielt behandlet separat med DS som inneholder papain og kollagenase ved ~ 37 ° C i 30-45 min per trinn. Etter vask med DS som inneholder enzymfritt storfeserum og tredning med en brannpolert pipette, frigjør bitene enkelt DSM-celler. Nyisolerte DSM-celler er ideelt egnet for elektrofysiologiske og farmakologiske karakteriseringer av ionekanaler. Spesielt viser vi at TRPM4 kanalblokkering 9-feentropi reduserer spenningstrinn fremkalt kation strømmer registrert med amfotericin-B perforert patch-klemme tilnærming. DSM-celler kan også studeres av andre teknikker som encellet RT-PCR, mikroarrayanalyse, immuncytokjemi, in situ nærhetsanalyse og Ca2 + bildebehandling. Den største fordelen med å utnytte enkelt DSM-celler er at observasjonene som er gjort, er direkte relatert til enkeltcelleegenskaper avslørt. Studier av nyisolerte humane DSM-celler har gitt viktig innsikt som karakteriserer egenskapene til ulike ionekanaler, inkludert kation-permeable i urinblæren og vil fortsette som en gullstandard i å belyse DSM cellulære egenskaper og regulatoriske mekanismer.

Enzymatisk dissosiasjon av DSM-stykker gir sunne nyisolerte DSM-celler som rutinemessig brukes i funksjonelle og molekylære studier som: patch-clamp elektrofysiologi og immuncytokjemi. Figur 1 oppsummerer disseksjonstrinnene og visualiserer oppsettene som er brukt for temperaturkontroll av enzymatiske behandlingstrinn. Figur 2 illustrerer lyse feltbilder av DSM-celler hentet fra tre humane urinblæreprøver hver fra en annen pasientdonor. Friske enkelt DSM-celler er preget av spindelformet morfologi, skarpe veldefinerte kanter, en veldefinert glorie rundt cellen, og semi-kontraktile (serpentinlignende) utseende når de vises under mikroskopet (se DSM-celler merket av hvite piler i figur 2). De reagerer også på sammentrekningstimulerende midler som muskarin agonist carbachol eller høy K+ (60 mM) applikasjoner. DSM-celler viser positiv immunreaktivitet for α-glatt muskelhandling som bekrefter deres identitet (Figur 3).
DSM-celler er ideelt egnet for patch-clamp elektrofysiologiske undersøkelser av ion kanal egenskaper. Her beskriver vi den perforerte opptaksmetoden for patchclamp ved hjelp av pipette og ekstracellulære løsninger (tabell 2) for å optimalt registrere spenningstrinninduserte kationkanaler. Under de spesifikke forholdene som er brukt, sikret blokade av Kv og L-type Ca2+ strømmer med henholdsvis Cs+/TEA+ og nifedipine eliminering av bidrag fra disse ioniske komponentene til hele cellespenningsfremkallede strømmer. Figur 4 og figur 5 viser henholdsvis de eksperimentelle trinnene i amfotericin-B perforert patch-clamp-metoden og representative helcellestrømmer målt enten med et spenningstrinn indusert eller en rampeprotokoll i tre forskjellige menneskelige DSM-celler, hver fra en annen pasientdonor. Vær oppmerksom på at opptakene viser en viss grad av variasjon når det gjelder gjeldende amplituder og utadvendt utbedring. Ytterligere eksperimenter viste at 9-feenantrol, en TRPM4 kanalhemmer, effektivt og reversibel hemmet humant DSM kationstrømmer ved negative og positive spenninger (Figur 6). Den 9-fenantropfølsomme strømkomponenten illustrerer en sterkere hemming ved positive spenninger og utadvendt utbedring (figur 6C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig01.jpg"> Figur 1: Sammendrag av disseksjonstrinn som resulterer i utarbeidelse av detrusor glatte muskelstykker (DSM) og oppsett som brukes til enzymatisk dissosiasjon. Vist er bilder av: (A) en hel tykkelse menneskelig urinblære prøve gitt fra en åpen blærekirurgi som fremmede kirurgisk materiale i iskalde DS, (B) samme forberedelse etter festing med et delvis dissekert DSM-lag, (C) DSM-stykker av variable dimensjoner kuttet ut fra DSM-laget klar for enzymatisk fordøyelse (mindre stykker) eller andre eksperimentelle undersøkelser (større stykker), (D, E) alternative oppsett som brukes til enzymatisk fordøyelse av DSM-stykker bestående av enten (1) et temperaturkontrollert sirkulerende vannbad koblet via rør til et stort glassvevskammer fylt med vann, gummiholder for rør, plastrør som inneholder DSM-stykker og enzymløsninger utarbeidet i disseksjons-/fordøyelsesoppløsning (DS, enten DS-P eller DS-C, tabell 2)og en temperatursonde knyttet til en skjerm som tillater kontinuerlig overvåking (D), eller (2) et stort vannfylt temperaturkontrollert bad som inneholder en holder og rør med DSM-stykker og enzymløsninger (E ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig02.jpg"> Figur 2: Representative lyse feltbilder av humane nyisolerte DSM-celler oppnådd ved hjelp av sekvensiell papain-kollagen-kollagenase fordøyelsesmetode. - Jeg har ikke noe åsi. Vises er bilder av levedyktige, fysiologisk aktive DSM-celler som anses som egnede kandidater for å forsøke perforerte patch-clamp opptak. - Jeg har ikke noe åsi. Bilder av ikke-levedyktige eller overfordøyde celler; slike celler ble unngått for patch-clamp eksperimenter. Hvite og svarte piler i paneler (A-H) peker på DSM-celler som anses levedyktige og ikke levedyktige, for å forsøke patch-clamp-opptak. Legg merke til at de svarte pilene i paneler (A, C og G) peker på cellefragmenter (sirkulære stykker) eller små celler som mangler DSM morfologi og i (H) cellene vises blek og utvidet. Bilder er fra tre forskjellige urinblæreprøver (A og B : pasientdonorkilde en, C og D : pasientdonorkilde to, og E-H : pasientdonorkilde tre). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig03.jpg"> Figur 3: Uttrykk for forbigående reseptorpotensialmelastatin type 4 (TRPM4) kanal og α-glatt muskelspesifikk aktin immunreaktiviteter i enkelthumane DSM-celler ved immuncytokjemianalyse. (A) Vist er konfokale bilder som viser immunocytokjemisk påvisning av TRPM4-kanalproteinuttrykk i en human DSM-celle. Rød farging (nederst til venstre) indikerer TRPM4-kanalproteiner; blå (DAPI) farging oppdager cellekjerner (øverst til venstre); grønn farging indikerer α-glatt muskel aktin (α-SMA, øverst til høyre); det sammenslåtte bildet (nederst til høyre) illustrerer overlappingen av alle tre bildene. (B) Konfokale bilder som illustrerer demper for immuncytokjemisk påvisning av TRPM4-kanalproteinuttrykk i nærvær av et TRPM4-spesifikt konkurrerende peptid (CP) i isolerte humane DSM-celler. Blå (DAPI) farging indikerer cellekjerner (øverst til venstre); grønn farging er for α-glatt muskel actin (α-SMA, øverst til høyre); det sammenslåtte bildet (nederst til høyre) illustrerer overlappingen av alle tre bildene. Resultatene ble verifisert i fire separate eksperimenter ved hjelp av DSM hele vev eller flere DSM-celler isolert fra fire pasienter. Bilder er fra Hristov et al. (2016)22 og brukes med tillatelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig04.jpg"> Figur 4: Skjematisk illustrasjon av trinn involvert i giga-tetningsdannelse og amfotericin-B perforering av humane DSM-celler. Illustrert er romlige posisjoner av en amfotericin-B som inneholder pipette og en DSM-celle sammen med tilhørende svar for membrantester oppnådd i den kommersielle oppkjøpsprogramvaren (Materialtabell) ved å endre spenningstrinn (enten -10 eller -20 mV i dette eksemplet) bestemme motstand. Konfigurasjoner er: (A) før celletilnærmingen med en elektrode, (B) etter giga-tetningdannelse oppnådd ved å plassere amfotericin-B som inneholder pipette (amfotericin-B representert av røde prikker) på celleoverflaten og påføring av negativt trykk, (C) on-cell konfigurasjonen vist ~ 45 min etter giga-tetningformasjon, på dette tidspunktet amfotericin-B har spredt ned pipette og molekylene har satt inn i plasmamembranen på spissen av elektrodekasjonen permeable porer, og (D) samme konfigurasjon som i (C), men med kapasitanstransienter avbrutt ved hjelp av ringer for hele cellekapasitans og seriemotstand på forsterkeren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig05.jpg"> Figur 5: Hele cellekation strømmer registrert med amfotericin-B perforert patch-clamp metode i menneskelige DSM celler. (A) Et diagram over spenningstrinnprotokollen illustrerer et holdingpotensial på -74 mV og spenningstrinn på 400 ms varighet fra -94 til +96 mV utført i trinn på 10 mV og deretter returnert til -74 mV. - Jeg har ikke noe åsi. Representative strømspor sammen med gjeldende tetthetsspenningsplott fra to forskjellige menneskelige DSM-celler, hver fra en annen urinblæreprøve/ pasientdonor oppnådd med spenningstrinnprotokollen beskrevet i (A). (D) Et eksempel på et strømspor innhentet med en rampeprotokoll (grafisk representert i toppinnfelt som spenningsendring fra -94 til +116 mV over en 1 s varighet på 0,21 mV/ms, holder potensial var -94 mV). Til høyre i paneler (B-D)viser grafene gjeldende tetthetsspenningsforhold for hver DSM-celle som er registrert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig06.jpg"> Figur 6: TRPM4 kanalblokkering 9-fenantrolmediert hemming av spenningstrinn indusert ekation strømmer i menneskelige DSM celler. (A) Vist er representative strømmer målt med spenningstrinnprotokollen som er beskrevet i fig. 5A for kontroll, 9-fenantropog utvasking. (B) Sammendrag av normaliserte responser versus spenning for kontroll, 9-fenantrop, og utvasking i syv DSM-celler (fra syv forskjellige pasientdonorer). (C) Differansestrøm for 9-fenantro-følsom komponent oppnådd ved å trekke verdiene i nærvær av 9-fenantropi (30 μM) fra de av kontrollen som vises i (B). Data i (B) og (C) vises som midler med feilfelt for SEM, * viser betydning (p<0.05, paret Student test) for sammenligning av kontroll vs 9-fenotropon ved hver spenning. Paneler (A) og (B) er gjengitt fra Hristov et al. (2016)22 og brukt med tillatelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig06large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>Arter</td>
			<td colspan="2">Detaljer om prosedyren</td>
			<td>Referanser</td>
		</tr><tr><td>Marsvin</td>
			<td colspan="2">DSM stykker skyllet med Ca2 +-free medium (i mM: 100 NaCl, 10 KCl, 1.2 KH2PO4,5 MgCl2, 20 glukose, 50 taurin, målt pCa = 6 (eller 1 mM) og deretter kuttet i stykker og behandlet vanligvis 90-120 min (4 perioder på 30 min) med enzymmedium (i mM: 130 KOH, 20 taurin, 5 pyruvat, 5 kreatin, 10 mM HEPES, justert med metatylsyre til pH 7,4, 1 mg/ml kollagase, 0,2 mg/ml pronase E, 1 mg/ml fettsyrefri albumin, pCa= 4,2 (63 mM) eller 3,7 (200 mM). Enkelt DSM-celler ble lagret i Kraft-Bruhe (KB)-medium (i mM: 85 KCl, 30 K2PO4,5 MgSO4, 5 Na2ATP, 5 K-pyruvate, 5 kreatin, 20 taurin, 5 beta-OH-butyrat, 1 mg/ml fettsyrefri albumin, justert med KOH til pH 7,2). Alternativ metode: DSM stykker skylles i 10 min i en Ca2 +-fri medium (i mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgCl2,10 glukose, 20 taurin, 5 HEPES, justert med NaOH til pH 7.4). Deretter DSM stykker, inkubert i samme Ca2 +-fri medium supplert med 5 mg% kollagen, 2 mg% pronase og 100 μM CaCl2 for 2x20 min omrøring.</td>
			<td>Klockner & Isenberg (1985)13,34 Klockner & Isenberg (1986)35 Schneider et al. (1991)10 Bonev & Isenberg (1992)9 Weidelt & Isenberg (2000)36 Moore et al. (2004)14
</td>
		</tr><tr><td>Marsvin, Landrace gris, og menneske</td>
			<td colspan="2">DSM stykker pre-inkubert i 5 min i Ca2 +-fri Krebs oppløsning deretter skåret i stykker og enzymatically fordøyd i Ca2 +-fri Krebs oppløsning som inneholder 0,5-2 mg/ml kollagen, type I og 0,1-0,5 mg/ml pronase ved 36 °C for 20-30 min stadig rørt. I noen tilfeller ble fordøyd stykker ytterligere opphisset av en stump tippet pipette eller ved å spinne til de ga celler. Isolerte celler ble lagret i modifisert Krebs-oppløsning (beskrevet i Klockner & Isenberg13) og ble normalt brukt innen 3 timer. Sammensetningen av Krebs-løsningen var (mM): 140 Na+, 6 K+, 2 Ca2 +, 1,2 Mg2 +, 152,4 Cl-, 10 glukose, 10 HEPES, pH 7.35-7.4 med Tris. For Ca2+-free solution ble Ca2+ og Mg2+ utelatt fra Krebs-løsningen.</td>
			<td>Inoue & Brading (1990)37 Inoue & Brading (1991)38 Nakayama & Brading (1995)39,40</td>
		</tr><tr><td>Menneskelige</td>
			<td colspan="2">DSM stykker plassert i Ca2 +-fri HEPES Tyrode oppløsning (i mM: 105.4 NaCl, 20.0 eller 22.3 NaHCO3, 3.6 KCl, 0.9 MgCl2, 0.4 NaH2PO4,19.5 eller 4.9 HEPES, 5.4 eller 5.5 glukose, 4,5 eller 5,5 Na-pyruvate) og kuttet i DSM stykker. DSM stykker gjennomvåt i en enzymløsning (Ca2 + gratis HEPES oppløsning med 0,7 mg /ml kollagen, type I, 0,7 mg/ml papain, 1 mg/ml albumin) over natten ved 4 °C. Stripene ble deretter oppvarmet ved 36,5 ° C i 15 til 30 min, vasket og forsiktig triturated i frisk oppløsning. Isolerte celler som ble lagret i Ca2+ som inneholder HEPES Tyrodes løsning eller brukes umiddelbart til eksperimenter.</td>
			<td>Montgomery & Fry (1992)24 Gallegos og Fry (1994)41 Fry et al. (1994)42 Sui et al. (2001)43 Wu et al. (2002)44
</td>
		</tr><tr><td>Marsvin</td>
			<td colspan="2">DSM skåret i stykker i PSS (i mM: 137 NaCl, 5.4 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2, 0.42 KH2P04, 4.17 NaHCO3, 10 glukose, 10 HEPES, pH 7.4 med NaOH). DSM stykker plassert i 10 min i følgende fordøyelsesløsning (i mM: 80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glukose, 2 MgCl2, og 0,2 CaCl2) og deretter overført til et hetteglass som inneholder samme oppløsning, men med 1 mg/ml kollagase 2, 1 mg/ml trypsinhemmer (noen ganger utelatt), 1 mg/ml fettfri storfealbumin, for ~ 70 min ved 35 °C eller ~60 min ved 37 °C. Enkelt DSM-celler ble oppnådd ved triturasjon gjennom en Pasteur pipette i samme løsning uten kalsium og enzymer. Etter triturasjon ble Ca2+ (1 mM) tilsatt og cellene ble lagret ved 4 °C. Cellene ble alltid brukt samme dag.</td>
			<td>Bonev & Nelson (1993)53,54 Heppner et al. (1997)26 Petkov et al. (2001)47 Shieh et al. (2001, 2007)48,49
</td>
		</tr><tr><td>Marsvin, mus, rotte og menneske</td>
			<td colspan="2">Protokollen benytter en to-trinns enzymatisk dissosiasjonsbehandling etter skarp disseksjon i Ca2 +-fri fordøyelsesløsning (i mM: 80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glukose og 2 MgCl2). Først ble DSM-stykker behandlet i 25-45 min ved 37 °C med 1-2 mg/ml papain, 1 mg/ml dithioerythreitol og 1 mg/ml storfeserumalbumin i dissosiasjonsoppløsning (i mM: 80 mononatriumglutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 2 MgCl2,10 HEPES og 10 glukose, justert til pH 7.3 med NaOH) og deretter DSM stykker overført til fordøyelsesoppløsning som inneholder 1-5 mg/ml kollagase XI (Sigma) eller kollagentype 2, 1 mg/ml storfe serum albumin, 0 eller 1 mg/ml trypsinhemmer og 100 μM Ca2 +, for 6-30 min. Etter inkubasjon ble det fordøyde vevet vasket flere ganger i fordøyelsesløsningen uten enzymer og Ca2+ og deretter forsiktig triturated for å gi enkelt glatte muskelceller.</td>
			<td>Petkov et al. (2001)50 Thorneloe & Nelson (2003)51 Thorneloe & Nelson (2004)33 Petkov & Nelson (2005)27 Hristov et al. (2008)52 Layne et al. (2010)53 Hristov et al. (2011)15 Xin et al. (2012)54 Parajuli et al. (2012)25 Malysz et al. (2013)29 Parajuli et al. (2013)31 Lee et al. (2013)55 Malysz et al. (2014)23 Smith et al. (2013)19, 20 Hristov et al. (2016)22 Lee et al. (2017)56 Yarotskyy et al. (2018)57
</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Sammendrag av enzymatiske tilnærminger som brukes til å isolere enkelt DSM-celler fra urinblærer av ulike arter.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Løsningstype</td>
			<td>Sammensetning (i mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS (disseksjon/ fordøyelsesløsning)</td>
			<td>80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2, og 11 glukose, pH justert til 7,4 (med 10 M NaOH)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-P (Papain-inneholdende DS)</td>
			<td>DS som inneholder 1-2 mg/ml papain, 1 mg/ml dithiothreitol og 1 mg/ml storfe serumalbumin</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-C (Kollagenaseholdig ES)</td>
			<td>DS-oppløsning som inneholder 1-2 mg/ml kollagenase type II, 1 mg/ml storfeserumalbumin, 0 eller 1 mg/ml trypsinhemmer og 100-200 μM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>P (Pipette)</td>
			<td>110 CsOH, 110 aspartic acid, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0.05 EGTA, og 30 CsCl,pH justert til 7.2 med CsOH, og supplert med amhotericin-B (300-500 μg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E (Ekstracellulær)</td>
			<td>10 tetraethylammoniumklorid (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES og 10 glukose, pH justert til 7.3-7.4 med NaOH eller CsOH, og 0,002-3 (2-3 mM) nifedipin</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Sammensetninger av disseksjons-/fordøyelsesoppløsning (DS) og pipette- og ekstracellulære løsninger som brukes i perforerte patch-clamp eksperimenter.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

Vi beskriver en metode for fremstilling av enkelt nyisolert detrusor glatte muskelceller fra menneskelige urinblæreprøver som bruker en to-trinns enzymatisk prosedyre. De oppnådde levedyktige DSM-cellene kan studeres av ulike enkeltcelleteknikker, inkludert den beskrevne amfotericin-B patch-clamp elektrofysiologi for å avsløre fysiologiske og farmakologiske egenskaper.

Forberedelse og utnyttelse av nyisolert humantdetrusor glatte muskelceller for karakterisering av 9-fenantrolfølsomme kationstrømmer

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...

Detrusor glatte muskelceller danner veggen av urinblæren som til slutt letter urinen annullering og lagring. Vår protokoll gir en validert og pålitelig metode for nyisolering av enkelt glatte muskelceller. Nyisolert menneskelig detrusor glatte muskelceller gir en mulighet for elektrofysiologiske og molekylære undersøkelser på enkeltcellenivå.Ved å studere enkeltderusor glatte muskelceller fra kontroll, normal og syke menneskelige urinblærer, har vi muligheten til å validere farmakologiske mål som ionkanaler. Enkelt menneskelig detrusor glatte muskelceller er ideelle for elektrofysiologiske eksperimenter som patch-klemme elektrofysiologi. Her vil vi presentere et eksempel på å studere en enkelt iion kanal kalt TRPM4, forbigående reseptor potensial melastatin fire kanal, som er en ikke-selektiv kation kanal.Nybegynnere kan slite med disseksjon og enzymatiske behandlingstrinn som krever effektivitet og kjennskap, inkludert å gjenkjenne kritiske viktige skritt for å oppnå friske isolerte DSM-celler. Det er viktig å være kjent med menneskelig blære histologi, protokolltrinn for å isolere enkeltceller forblir motstandsdyktige, og i utgangspunktet forventer å få suboptimale celler ved hjelp av denne protokollen. Begynn med å undersøke hele tykkelsen urinblæreprøven.Pin prøven, slimhinnen vendt oppover og serosa ned på en silikon enantiomer-belagt 150 mm rund tallerken fylt med iskald DS og forsiktig fjerne alle slimhinnen ved skarp disseksjon. Klipp ut flere slimhinner-fri detrusor glatt muskel eller DSM stykker. Legg tre til seks DSM stykker i et rør med en til to milliliter forhåndsoppvarmet DS som inneholder papain og dithiothreitol, eller DS-P.Inkuber dem ved 37 grader Celsius i 30 til 45 minutter, og sørg for å riste røret hvert 10 til 15 minutt. Etter inkubasjonen, fjern DS-P fra røret og vask kort DSM-bitene med iskald DS. Overfør DS med DSM-stykker til et nytt rør og fjern DS, slik at DSM-bitene ligger nederst på røret. Legg til en til to milliliter DS som inneholder kollagnase type II, eller DS-C, til røret.Og inkuber den ved 37 grader Celsius med sporadisk risting. Kast DS-C og vask de enzymbehandlede DSM-bitene fem til ti ganger med iskald DS. Etter den siste vasken la DS inne i røret, og forsiktig triturate bitene med en brannpolert Pasteur pipette for å frigjøre enkelt DSM celler. Pipette 0,25 til en milliliter cellefjæring på et glassbunnkammer som sitter på scenen av et omvendt mikroskop og inkuberer det i minst 45 minutter for å la cellene holde seg.Deretter fjerner du DS fra badet og erstatter den med E-løsning via superfusjon. Trekk flere patchelektroder, poler elektrodespissene og belegge spissene i tannvoks om nødvendig. Fyll spissen av en patchelektrode med pipetteløsningen uten amfotericin-B ved kort dypping av elektroden i oppløsningen.Suksessen til patch clamp elektrofysiologi avhenger av DSM cellekvalitet og amfotericin-B solubilisering. Fyll elektroden tilbake med samme pipetteløsning som inneholder amfotericin-B og monter elektroden på en holder som er koblet til et patch clamp-forsterkerhodetrinn. Bruk en mikromanipulator til å plassere elektroden like under overflaten av den ekstracellulære oppløsningen slik at spissen av elektroden bare er nedsenket.Deretter bestemmer elektrodemotstanden ved hjelp av membrantestvindusfunksjonen til den kommersielle oppkjøpsprogramvaren og avanserer elektroden mot cellen av interesse. Når du berører celleoverflaten med elektroden, danner du en giga-forsegling ved å bruke skånsomt raskt negativt trykk på elektroden via rør. Dette resulterer i negativt trykk på spissen av elektroden som resulterer i en vellykket giga-forsegling som bekreftet av membrantesten.La 30 til 60 minutter for amphotericin-B å spre ned pipetten og settes inn i plasmamembranen, og danner porer primært selektive til monovalente cations. Fortsett å overvåke giga-forseglingen med membrantestfunksjonen. Når plasterperforeringen er optimal, kan du avbryte kapasitanstransientene ved å justere skivene for cellekaasitance og seriemotstand på forsterkeren.Når de stabile spenningstrinnsmerkingsstrømmene er observert, registrerer du strøm med rutingspenningstrinnprotokollen som beskrevet i manuskriptet. Påfør en forbindelse eller en fysiologisk testtilstand for å teste ved superfusjon og registrere svarene for kontroll- og testforholdene samt utvaskingen. Denne protokollen kan brukes til å isolere friske, friske DSM-celler for funksjonelle og molekylære studier.Friske enkelt DSM-celler er preget av spindelformet morfologi, skarpe veldefinerte kanter, en veldefinert glorie rundt cellen, og semi-kontraktil utseende sett under mikroskopet. Videre reagerer de nyisolerte DSM-cellene på mekanisk stimulering og karbachol. Cellefragmenter og ikke-levedyktige eller overfordøyde celler bør unngås i påfølgende patch-clamp eksperimenter.De isolerte cellene har blitt brukt i perforerte patch-clamp-eksperimenter der hele cellestrømmene ble målt med enten en spenningstrinnindusert eller rampeprotokoll i tre forskjellige humane DSM-celler. Eksperimenter viste at 9-fenanthrol, en TRPM4 kanalhemmer, effektivt og reversibel hemmet menneskeligE DSM kation strømmer. Den 9-fenanthrol-sensitive strømkomponenten illustrerer en sterkere hemming ved positive spenninger og ytre utbedring.Tilstanden til enzymatiske behandlingstrinn, trinn 2.2 og 2.3, inkludert temperatur, varighet av enzymbehandlinger, enzym mye kilder og kvaliteten på DSM celler, er viktige determinanter for å oppnå høy kvalitet menneskelige DSM celler. Humane DSM-celler er også ideelt egnet for evaluering av intracellulære andre budbringernivåer, inkludert kalsium og syklisk AMP, oppdage proteinuttrykk ved immunocytokjemi og samuttrykk ved in situ proksimale prosedyreanalyser, og mRNA-uttrykk av RT-PCR, qRT-PCR, mikroarrayer og neste generasjons sekvensering. Humane DSM-celler har avansert vår forståelse av rollene til BK, kalsium, TRPM4-kanaler i urinblæren.Fremtidige utviklinger vil tillate å spesifikt knytte elektrofysiologiske eller farmakologiske egenskaper med transkripsjons- eller proteomprofilene.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Vurdering av kontraktilitet, trettbarhet og Alternans i isolerte skjelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolering av lungearterien glatte muskelceller fra Neonatal Mus

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Måling av Smooth muskelfunksjon i de Isolert Tissue Bath-applikasjoner til Farmakologi Forskning

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

To-foton avbildning av intracellulær Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Håndtering og nitrogenoksid produksjon i endotel og glatte muskelceller av en isolert Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Single-kanal Analyse og Kalsium Imaging i Podocytes av nyisolerte glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Måling av kalsium svingninger i løpet av sarkoplasmatisk retikulum av dyrkede glatte muskelceller Bruke FRET basert Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering av Murine Coronary vaskulære glatte muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...