Name: preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents
Uploaded: 2020-01-31T12:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами NIH-R01DK106964 и P20DK123971 Георгию В. Петкову. Авторы благодарят доктора Виктора Яроцкого и сару Максвелл за критическую оценку рукописи. Мы также признательны хирургам урологии в MUSC и UTHSC: докторам Томасу Кину, Гарри Кларку, Стивену Сэвиджу, Россу Реймсу, Сандипу Прасаду, Джонатану Пикарду, Кристоферу Ледбеттеру и Энтони Паттерсону, а также жителям URology MUSC и UTHSC: д-р Тейлор Тейлор Воган, Сэмюэл Уокер Никлз, Мэтью Янг, Эрин Бернс, Джастин Эллетт, Райан Леви, Остин Янгер, Марк Каррин, Нима Барадаран, Олугбемисола Маккой, Трейси Типтон, Брайс Уайатт, Алиса Грейман, Сара Староста, Аарон Блох, Кристин Каллауэй, Люсиль Кокс, Люсин Кокс, Кристиан Деван, Эрин Хейтман, Брэдли Хьюстон, Стивен Легг, Роберт С. Либби, Коул Локлир, Кристен Марли, Моника О'Хэнлон, Патрик Пробст, Синтия Шарадин, Элизабет Турвилл, Даниэль Сапата за помощь в сборе тканей человека.

Ни один.

Клетки демрузорной гладкой мышцы (DSM) представляют собой наиболее распространенный тип клеток мочевого пузыря и в конечном итоге контролируют хранение мочи и аннулирование через релаксацию и сжатие, соответственно. DSM клетки образуют гладкие мышечные пучки, которые переплетаются с прилегающей соединительной ткани, нервных процессов, интерстициальных клеток и других типов клеток1. Текущее понимание роли Клеток DSM в функции мочевого пузыря было достигнуто благодаря многоуровневому комплексному подходу. Каждый экспериментальный метод - будь то на основе изолированных одиночных клеток in vitro, тканевые полоски, содержащие гладкие мышечные пучки in vitro/ex vivo, или in vivo (такие как цитометрия и оценки функций аннулирования) - обеспечивает важное и конкретное понимание физиологических и фармакологических свойств DSM (см. обзоры1,2,3,4,5,6 для деталей). Однако интерпретация результатов, полученных из изолированных одиночных ячеек, позволяет делать выводы, специально приписываемые самому типу одной ячейки. Это осознание было движущей силой для создания надежного и воспроизводимого метода для получения свежеизолированных клеток DSM от всей толщины образцов мочевого пузыря. В отличие от многих других типов клеток, гладкие мышечные клетки не могут быть надежно культивированы из-за потери родного фенотипа, включая конкретные изменения в их электрофизиологических и сократительных свойств7,8. Этот факт еще больше подчеркивает важность исследований, проводимых на физиологически активных свежеизолированных клетках DSM.
В конце 1980-х и начале 1990-х годов группа Изенберга (Германия) опубликовала серию электрофизиологических исследований на свежеизолированных клетках DSM, полученных из мочевых пузырей морской свинки9,10,11,12,13 (Таблица 1). Метод выделил два важных замечания, которые помогли в получении жизненно важных клеток и служил в качестве первоначального ориентира для других следовать. Они были 1) предварительно лечения изолированных частей DSM с Ca2 "бесплатноерешение / средний до ферментативного лечения и 2) пищеварения ткани с раствором, содержащим коллагеназы. Эти два критических шага были включены во все последующие варианты процедур диссоциации клеток DSM(таблица 1). В настоящее время наша группа использует двухступенчатый последовательный подход к диссоциации папано-коллагенеза. Части DSM сначала обрабатываются ферментным раствором, содержащим папаин, а затем коллагеназой типа II растворяются в том же растворе (DS, раствор рассечения/пищеварения). Этот подход дает одиночные клетки DSM от различных видов включая морскую свинку, свинку, крысу, мышь, и важно людейшед(таблица 1).
Одиночные клетки DSM обеспечивают источник для множественных молекулярной биологии и физиологических экспериментов. До сих пор протеиновые и мРНК экспрессии изучались с помощью иммуноцитохимии, или RT-PCR/qRT-PCR определения показали высокий уровень обнаружения для различных ионных каналов, включая большое напряжение провода- и Ca2 "активирован(BK), небольшой проводимости Ca2 "-активированныйKи тип 3 (SK3), напряжение-gated K(K v), L-тип напряжения-gated Ca2 "(Ca v),и переходный рецептор потенциал апремносциона типа 4 (TRPM4) каналов, а также Na / Ca2 "обменник 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Все они, как полагают, контролировать возбудимость DSM, внутриклеточные уровни Ca2 "и контрактности. Патч-зажим электрофизиологических подходов, выполняемых непосредственно на морских свинках, мыши, крысы, или человека DSM клеток, при условии прямой демонстрации биофизических и фармакологических свойств L-типа Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK, и TRPM4 каналов17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. Подходы включали в себя обычные цельноклеточные зажим напряжения, перфорированное напряжение-зажим, и одноканальные записи (ячейка прилагается, наизнанку и за пределами конфигураций). Кроме того, мембранная потенциальная запись DSM с использованием тока-зажима предоставила доказательства того, что целевые фармакологические агенты изменяют возбудимость клеток. Например, ингибитор TRPM4 9-фенантрол индуцированной гиперполяризации в клетках DSM, полученных от людей, морских свинок, и крыс мочевого пузыря19,20,22,31. Среди различных электрофизиологических методов, амфотерицин-В (и нистатин, грамицидин, и к-эсцин) перфорированные патч-зажим записи обеспечивают ключевое преимущество, сохраняя внутриклеточные молекулы сигнализации и пути. Только низкий молекулярный вес катионов и в меньшей степени, Cl- но не белки или сигнальные молекулы, включая Ca2 " - проницаемы через плазменные мембраны поры, образованные амфотерицин-B или нистатин32. Успешный результат перфорированных патч-зажим экспериментов зависит от нескольких общих переменных, уникальных для этой техники. Здесь мы описываем детали процедуры использования амфотерицина-B, что наша группа успешно использовала на протяжениимногихлет,22,33,34,35,36,37,38,39.
Возможно, неселективные каналы катионов остаются одним из наименее понятных типов каналов в клетках DSM. Первый доклад о неселективном канале, похожем на катуляцию, датируется 1993 годом. В документе, в статье Веллнера и Isenberg11 описаны 33 pS стрейч-активированный одинканал, отображающий следующий ранг порядка ионной проницаемости: Kйgt;Naйgt;Csйgt; Почти десять лет спустя, Торнело и Нельсон40 описалNaи проницаемые катионные токи в клетках DSM мыши, ингибируемые Gd3 ",используя всеклеточные записи. Поскольку молекулярная идентичность неселективных каналов катации и их биофизические характеристики еще предстоит определить, будущие исследования в этой области исследований являются оправданными. Протокол, описанный в настоящем для записи неселективных катионных токов канала - с использованием внеклеточных и пипетковых внутриклеточных растворов, содержащихCs,TEAи нифедипин(Таблица 2), что физиологически и фармакологически смягчить Kv и Cav токи - был и будет продолжать быть полезным в электрофизиологических исследований неселективных каналов катуляции. Мы использовали этот конкретный протокол для определения степени ингибирования цельноклеточных катионов блокатором канала TRPM4 9-фенантрол в морских свинки, крысы и человека DSM клеток19,20,22.
Взятые вместе, метод, описанный здесь для получения свежеизолированных отдельных клеток DSM из человеческого мочевого пузыря обеспечивает жизнеспособные клетки очень подходит для электрофизиологических исследований с использованием различных конфигураций патч-зажим техники, Ca2 "-изображения,иммуноцитохимии, в situ проксимальной судебного анализа, и одноклеточных RT-PCR / qRT-PCR, а также передовые методы молекулярной биологии, включая Использование метода амфотерицина-B перфорированного патч-зажима сохраняет среду родной клетки в отличие от других конфигураций. При проведении с использованием конкретных условий, изложенных здесь, предназначенных для свести на нет вклады Kи Ca2 "токов в клетках DSM, напряжение-шаг индуцированных токов отображения свойств неселективных катионов подходит для биофизических и фармакологических характеристик.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td>Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-Phenanthrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>211281</td>
			<td>TRPM4 channel inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP928-250</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>European Pharmacopoeia Reference Standards</td>
			<td>5</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-100MG</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9006</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Extracellular solution and DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-7.5</td>
			<td>Capillary for preparation of pulled patch electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8518</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>pCLAMP-10</td>
			<td>Commerical software and part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004177</td>
			<td>DS-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203025</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Miltex Dental Wax Technologies, Inc.</td>
			<td>18058351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer with Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-077-32</td>
			<td>Placed in tissue bath to monitor temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DDT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Reducing agents used together with Papain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Required to pull electrodes with very fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating foam tube rack/holder</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82017-634</td>
			<td>Used for holding tubes with enzymes for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid (Na salt)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>pH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Data Acquisition System</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-442-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroForge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Used for fire-polishing electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7634</td>
			<td>L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of Patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-metalic syringe needle, MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF-34G-5</td>
			<td>Filling of intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>DS-P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Axon Axopatch 200B</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC computer</td>
			<td>DELL</td>
			<td>Custom configuration</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Aspera Instruments</td>
			<td>PH700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427-436</td>
			<td>Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue bath, 100 mL</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>1583-101</td>
			<td>Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl tubing</td>
			<td>ColePalmer</td>
			<td>06405-3</td>
			<td>Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulator bath, Haake D1 L</td>
			<td>Haake</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Connected to tissue bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents

Detrusor гладкой мышцы (DSM) клетки, присутствующие в мочевом пузыре стены в конечном итоге облегчить хранение мочи и аннулирования. Подготовка жизнеспособных, свежих и изолированных клеток DSM представляет собой важную техническую проблему, достижение которой обеспечивает оптимальные клетки для последующих функциональных и молекулярных исследований. Метод, разработанный и разработанный в настоящем документе, успешно используемый нашей группой на протяжении более десяти лет, описывает вскрытие образцов мочевого пузыря человека, полученных в результате открытых операций мочевого пузыря с последующим ферментативным двухступенчатым лечением частей DSM и механической трикуляцией для получения свежеизолированных клеток DSM. Первоначальный шаг включает в себя вскрытие отделить слой DSM (также известный как muscularis propria) от слизистой оболочки (уротелиум, ламиновая проприия, и мускоза muscularis) и прилегающих соединительной, сосудистой и жировой ткани настоящее время. DSM затем разрезается на куски (2-3 мм х 4-6 мм) в номинальном Ca2 ",содержащийраствор вскрытия / пищеварения (DS). DSM части затем переданы и последовательно обрабатываются отдельно с DS, содержащим папаин и коллагенеза на 37 градусов по Цельсию в течение 30-45 минут за шаг. После моетливания с DS, содержащей без ферментов сыворотки крупного рогатого скота и тритурации с огнем полированной пипетки, куски релиз одного DSM клеток. Свежеизолированные клетки DSM идеально подходят для электрофизиологических и фармакологических характеристик ионных каналов. В частности, мы показываем, что блокатор канала TRPM4 9-фенантрол уменьшает напряжение-шаг вызвал катифика токи, записанные с амфотерицин-B перфорированный патч-зажим подход. DSM клетки также могут быть изучены с помощью других методов, таких как одноклеточные RT-PCR, анализ микроаррей, иммуноцитохимия, на месте перевязки анализа, и Ca2 "изображений. Основным преимуществом использования отдельных клеток DSM является то, что сделанные наблюдения непосредственно связаны с выявленными характеристиками одной клетки. Исследования свежеизолированных клеток DSM человека предоставили важные идеи, характеризующие свойства различных ионных каналов, включая катион-проницаемые в мочевом пузыре и будет продолжаться как золотой стандарт в выяснении DSM клеточных свойств и регулирующих механизмов.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

Мы описываем метод подготовки одного свежеизолированного детрузора гладких мышечных клеток из образцов мочевого пузыря человека, использующих двухступенчатую ферментативную процедуру. Полученные жизнеспособные клетки DSM могут быть изучены с помощью различных одноклеточных методов, включая описанную амфотерицину-B патч-зажим электрофизиологии, чтобы выявить физиологические и фармакологические свойства.

Подготовка и использование свежеизолированных человеческих детрузора гладкие мышечные клетки для характеристики 9-фенантрол чувствительных контов

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...

Detrusor гладкие мышечные клетки образуют стенку мочевого пузыря, что в конечном итоге облегчает аннулирование мочи и хранения. Наш протокол обеспечивает проверенный и надежный метод для свежеизоляции одиночных гладких мышечных клеток. Свежеиспобранные человеческие детрусорные гладкие мышечные клетки дают возможность для электрофизиологических и молекулярных исследований на уровне одной клетки.Изучая одиночные детрусорные гладкие мышечные клетки из-под контроля, нормальных и больных мочевых пузырей человека, у нас есть возможность проверить фармакологические цели, такие как ионные каналы. Одиночные человеческие детрусорные гладкие мышечные клетки идеально подходят для электрофизиологических экспериментов, таких как электрофизиология патч-зажима. Здесь мы представляем пример изучения одного ионового канала под названием TRPM4, переходного рецептора потенциального меластатина четырехканала, который является неселективным каналом катиона.Новички могут бороться с вскрытием и энзиматической лечения шаги, которые требуют эффективности и знакомства, включая признание важнейших важных шагов для получения свежих изолированных клеток DSM. Важно быть знакомым с гистологией мочевого пузыря человека, протокольные шаги для изоляции одиночных клеток остаются устойчивыми, и первоначально ожидают получить неоптимальные клетки с помощью этого протокола. Начните с изучения всей толщины мочевого пузыря образца.Прикрепите образец, слизистую оболочку лицом вверх и серозу вниз на силиконовую энантиомерную круглую тарелку диаметром 150 мм, наполненную ледяным DS, и аккуратно удалите всю слизистую оболочку острым вскрытием. Вырежьте несколько слизистой оболочки свободной детрусора гладкой мышцы или DSM штук. Поместите три-шесть частей DSM в трубку с одним-двумя миллилитров предварительно разогретых DS, содержащих папаин и дитиотрейтол, или DS-P.Инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение 30 до 45 минут, убедившись, что встряхнуть трубку каждые 10 до 15 минут. После инкубации, удалить DS-P из трубки и кратко мыть DSM штук с ледяной DS. Перенесите DS с DSM частей в новую трубку и удалить DS, оставляя DSM штук в нижней части трубки. Добавьте в трубку от одного до двух миллилитров DS, содержащих коллагеназу II типа, или DS-C.И инкубировать его при 37 градусах по Цельсию с редким встряхивания. Отбросьте DS-C и промыть фермент обработанные DSM штук пять-десять раз с ледяной DS. После последней стирки оставьте DS внутри трубки, и аккуратно тритурировать куски с огнем полированной пипетки Пастер выпустить одиночные клетки DSM. Пипетка от 0,25 до одного миллилитров клеточной подвески на стеклянную нижнюю камеру, сидящую на стадии перевернутого микроскопа, и инкубировать его в течение по крайней мере 45 минут, чтобы клетки придерживаться.Затем удалите DS из ванны и замените его раствором E с помощью суперфузии. Потяните несколько электродов патч, огонь-полировать электрод советы, и пальто советы в зубной воск, если это необходимо. Заполните кончик электрода патча раствором пипетки без амфотерицина-B, ненадолго окунув электрод в раствор.Успех электрофизиологии зажима патча зависит от качества клеток DSM и амфотерицин-B solubilization. Заполнюте электрод тем же раствором пипетки, содержащим амфотерицин-В, и смонтировать электрод на держатель, подключенный к головке усилителя патча. Используйте микроманипулятор, чтобы поместить электрод чуть ниже поверхности внеклеточного раствора так, чтобы кончик электрода просто погрузился.Затем определите сопротивление электрода с помощью функции мембранного испытательного окна программного обеспечения коммерческого приобретения и процдимите электрод к ячейке, представляющие интерес. При прикосновении к поверхности клетки с электродом, образуют гига-печать, применяя мягкое быстрое отрицательное давление на электрод через трубки. Это приводит к отрицательному давлению на кончике электрода, что приводит к успешному гига-уплотнению, что подтверждается мембранным тестом.Разрешить от 30 до 60 минут для амфотерицин-B, чтобы рассеять вниз пипетку и быть вставлены в плазменной мембране, образуя поры в первую очередь избирательно к моновалентным cations. Продолжить мониторинг гига-печать с функцией мембранного теста. Когда перфорация патча оптимальна, отмените переходные емкости, отрегулив циферблаты для емкости ячейки и сопротивления рядов на усилителе.После того, как наблюдаются стабильные катионые токи напряжения, записывают токи с протоколом напряжения-шага маршрутизации, как описано в рукописи. Применить соединение или физиологическое состояние теста, чтобы проверить с помощью суперфузии и записывать ответы на контроль и испытания условий, а также вымывания. Этот протокол может быть использован для изоляции здоровых, свежих клеток DSM для функциональных и молекулярных исследований.Здоровые одиночные клетки DSM охарактеризованы морфологией шпинделя, хрустящими наилучшим образом определенными краями, наилучшим образом определенным ореолом вокруг клетки, и semi-contractile возникновением когда осмотрено под микроскопом. Кроме того, недавно изолированные DSM-клетки реагируют на механическую стимуляцию и карбахол. Фрагменты клеток и не жизнеспособные или чрезмерно переваренные клетки следует избегать в последующих экспериментах патч-зажим.Изолированные клетки были использованы в амфотерицин-B перфорированных патч-зажим экспериментов, где цельноклеточные токи были измерены либо напряжение шаг индуцированной или рампы протокола в трех различных человеческих DSM-клеток. Эксперименты показали, что 9-фенанотр, ингибитор канала TRPM4, эффективно и обратимо ингибирует человеческие токи DSM-катиоций. 9-фенатрол чувствительных текущий компонент иллюстрирует более сильное торможение при положительном напряжении и внешнего исправления.Состояние ферментативных шагов лечения, шаги 2.2 и 2.3, включая температуру, продолжительность ферментной обработки, источники ферментного лота и качество клеток DSM, являются ключевыми детерминантами для получения высококачественных клеток DSM человека. Клетки DSM человека также идеально подходят для оценки внутриклеточного второго уровня посыльного, включая кальций и циклический AMP, обнаружение белковых выражений иммуноцитохимией и совместное выражение путем анализа проксимальных судебных процессов на месте, а также экспрессию мРНК с помощью RT-PCR, qRT-PCR, microarrays и секвенирования следующего поколения. Клетки DSM человека продвинули наше понимание роли каналов БК, кальция, TRPM4 в мочевом пузыре.Будущие разработки позволят конкретно связать электрофизиологические или фармакологические свойства с профилями транскриптома или протеома.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Фокусное Ca 2 + Переходные Обнаружение в гладкой мускулатуре

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Изоляция по правам артерии пуповины гладкомышечных клеток (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo оценке сократимости, утомляемость и аНегпапз в изолированных скелетных мышц

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Выделение легочной артерии гладкомышечных клеток у новорожденных мышей

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Измерение гладких мышцах функции в выделенную ткань баня приложений к фармакологии исследований

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Двухфотонное изображений внутриклеточного Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Погрузочно-разгрузочные работы и оксид азота производства в эндотелиальных и гладкомышечных клеток изолированной аорты крыс

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Одноканальный анализ и Кальций изображений в подоцитов в Свежевыделенные клубочков

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Измерение флуктуаций кальция в пределах саркоплазматического ретикулума культивируемых клеток гладкой мышцы с использованием FRET на основе конфокальной микроскопии

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Выделение мышиной коронарных сосудов клетках гладкой мускулатуры

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption: Передача Изолированные Человеческий MSC митохондрии глиобластомы стволовых клеток

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...