Name: preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents
Uploaded: 2020-01-31T12:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH-R01DK106964 och P20DK123971 bidrag till Georgi V. Petkov. Författarna tackar Dr Viktor Yarotskyy och Ms Sarah Maxwell för kritisk utvärdering av manuskriptet. Vi är också tacksamma för urologi personal kirurger på MUSC och UTHSC: Drs Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter, och Anthony Patterson samt MUSC och UTHSC Urology invånare: Drs. Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O'Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata för deras hjälp med mänsklig vävnad samling.

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutionella Review Board kommittéer vid University of Tennessee Health Science Center (Memphis, TN, IRB # 17-05714-XP), och Medical University of South Carolina (Charleston, SC, IRB # 00045232). De godkända förfarandena gör det möjligt att urinblåsan i hela tjockleken (>1 cm x >1 cm) - som innehåller alla lager, inklusive slemhinnor, detrusor glatt muskulatur, och serosa också är fästa blodkärl och fettvävnad) - som skall samlas in från patienter-givare som genomgår kirurgisk partiell extraktion av urinblåsan. Patientgivare är vuxna (åldersintervall som studerats hittills: 25 till 87 år), antingen manliga eller kvinnliga, med eller utan symtom på överaktiv blåsa (enligt American Urological Association I-PSS poäng41). Kirurgiska ingrepp innebär en mängd olika medicinska tillstånd inklusive radikala cystectomy för urothelial carcinom, och adenocarcinom. I sådana fall är det insamlade urinblåsan exemplaret långt från tumörstället.
1. Dissekering av DSM-vävnader och beredning av slemhinnorfria DSM-bitar
<ol><li>Undersök hela tjockleken urinblåsan exemplar som kom i labbet från operationssalen i en tätt förseglad behållare fylld med den kalla dissekering / matsmältningslösning(figur 1 och tabell 2 för sammansättning av DS). OBS: Preparatet hålls vanligtvis i kallt DS från några timmar till natten före ankomsten till laboratoriet. För längre lagring kompletteras DS (tabell 2) med 1 mM CaCl2.</li>
	<li>Ta bort och skölj den mänskliga hela tjockleken DSM exemplar (som innehåller alla lager inklusive slemhinnor, DSM och serosa) med iskall DS för att tvätta bort fäst skräp och blod.</li>
	<li>Fäst urinblåsan, slemhinnan uppåt och serosa nedåt, på en silikonenantiomerbelagd (Materialformmaterial) 150 mm i diameter rund skål fylld med iskallt DS (figur 1B).</li>
	<li>Ta bort den intilliggande fettvävnaden, blodkärlen, epitelet (urotelet) och muscularisslemhinnan från exemplaret genom skarp dissekering med mikrosax och pincett.</li>
	<li>Klipp ut flera slemhinnans fria DSM-bitar (~2-3 mm lång och 4-6 mm bred) (figur 1C).</li>
</ol>2. Enzymatisk dissociation av DSM bitar som ger nyligen isolerade enstaka DSM celler
<ol><li>Placera 3 till 6 DSM bitar i ett rör som innehåller 1 till 2 ml förvärmd (~ 37 °C) DS innehållande papain och ditiotioreitol (DS-P, tabell 2) och inkubera DSM bitar i DS-P för 30-45 min på ~ 37 °C försiktigt skaka ibland röret (en gång var 10-15 min). OBS: För att optimalt kontrollera temperaturen för enzymatisk behandling placeras rör med vävnadsbitar och enzymlösningar i antingen en glasvävnadskammare fylld med vatten som är anslutet till ett cirkulerande varmt vattenbad (figur 1D) eller ett högprecisionstemperaturstyrt skakvattenbad (figur 1E).</li>
	<li>Ta bort DS-P från röret, tvätta kort DSM bitar med iskall DS, kasta kallt DS från röret lämnar DSM bitar sitter längst ner på röret.</li>
	<li>Tillsätt 1 till 2 ml DS-innehållande kollagentyp II (DS-C, tabell 2) i röret med DSM-bitar, blanda försiktigt; och inkubera i 25-40 min vid ~37 °C skaka försiktigt röret ibland (var 10-15 min).</li>
	<li>Kassera DS-C och tvätta enzymbehandlade DSM-bitar 5-10 gånger med iskall DS.</li>
	<li>Efter den sista tvätten, lämna DS-lösning inuti röret; försiktigt triturate med en brandpolerad Pasteur pipett flera gånger för att släppa enstaka DSM celler.</li>
	<li>Placera några droppar DS-lösning som innehåller dispergerade DSM-celler på en glasbottenskammare eller ett täckglas och inspektera visuellt för kvaliteten under ett mikroskop (med ett mål på 20 x eller 40 x) efter minst 5 minuter efter appliceringen så att cellerna kan följa botten.</li>
	<li>Använd omedelbart nyligen isolerade DSM-celler för elektrofysiologiska experiment eller förvara cellerna i ett rör som innehåller DS vid ~4 °C antingen på is eller i kylskåp tills de används (vanligtvis för upp till 8 timmar beredning). Obs! Inom samma beredning varierar cellernas kvalitet från mycket livskraftiga till översmälta, döda DSM-celler(figur 2). När sekventiell papain-kollagen metod ger ett mycket stort antal ovibla celler, preparatet kasseras, och en ny matsmältning av DSM bitar utförs men med minskade inkubationsintervall. Om proceduren resulterar i för få DSM-celler sedan för efterföljande nedbrytning av DSM bitar, inkubationsintervallen ökas. Positiv immunreaktivitet för α-smooth muscle actin bekräftar identiteten på DSM-celler(figur 3).</li>
</ol>3. Registrering av spänningssteginducerade katjonströmmar från DSM-celler med amphotericin-B perforerad helcellsspänningsklämmateknik
<ol><li>Pipette 0,25-1 ml cellupphängning på en glasbottenkammare som sitter på ett stadium av ett inverterat mikroskop och låter cellerna hålla sig till glasbotten.</li>
	<li>Efter inkubation i minst 45 min, ta bort DS från badet och byt ut med E-lösningen(tabell 2) genom superfusion där lösningsflödet med hjälp av gravitationgenom inloppsslanger ersätter DS med den nya lösningen medan utloppsslangen ansluten till ett vakuumavfallskärl avlägsnar kammarlösningen och förhindrar spill. Observera att E-lösningen innehåller tetraetylammonium (TEA+) och cesium (Cs+) joner för att hämma K+ strömmar.</li>
	<li>Förbered en arbetsbeståndslösning av amphotericin-B i dimetylsulfoxid (DMSO) (1 mg per 10 μL dmso). För att helt lösa upp amfotericin pulver, sonicate (minst 15 min) och virvel lösningen väl. OBS: Detta steg tar vanligtvis mindre än 10 min. Upplösning 3-4 mg amphotericin-B i 30-40 μL DSMO i en 1,5 ml mikrocentrifug röret fungerar bra. Högre mängder amphotericin-B kräver mer DSMO lösningsmedel som vanligtvis resulterar i ett längre intervall för blandning och ofullständig löslighet av amphotericin-B fasta partiklar som finns i röret.</li>
	<li>Lös stamlösningen av amphotericin-B i pipettlösningen (lösning P, tabell 2) för att erhålla en slutlig koncentration på 200-500 μg/ml. Detta steg kräver omfattande ultraljudsbehandling och virvelring vid en höghastighetsinställning (8-10/10) för ~ 30 till 60 min per steg för att säkerställa optimal blandning och förebyggande av amphotericin-B fällning bildas i pipettlösningen. Amphotericin-B fälls ut över tid och är ljuskänslig. Den fungerande pipettlösningen som innehåller Amphotericin-B kontrolleras för löslighet, handblandad före pipettfyllning och hålls i mörkret.</li>
	<li>Dra flera patch elektroder, brand-polska elektrod tips, och (om det behövs) päls spetsarna med tandvax.</li>
	<li>Fyll spetsen på en patchelektrod med pipettlösningen (lösning P, tabell 2) utan amphotericin-B genom att kort doppa elektroden i lösningen.</li>
	<li>Fyll på elektroden med samma pipettlösning som innehåller amphotericin-B.</li>
	<li>Montera elektroden på en hållare som är ansluten till ett huvudsteg för plåstret.</li>
	<li>Använd en mikromanipulator, placera elektroden strax under ytan av den extracellulära lösningen så att spetsen på elektroden är bara nedsänkt.</li>
	<li>I spänningsklämläget ställer du in hållpotentialen till 0 mV och justerar strömmen till 0 pA med pipettoffsetratten på den kommersiella förstärkaren (Materialtabell).</li>
	<li>Bestäm elektrodresistansen med hjälp av membrantestfönstret/funktionen hos den kommersiella anskaffningsprogramvaran (Table of Materials). Om du vill aktivera klickar du på Verktyg>Membrantest>Spela upp eller en genvägsikon i programvaran. Det bestämda elektrodmotståndet bör ligga inom intervallet 2 till 5 MΩ. OBS: Membran Testfunktion som tillhandahålls i kommersiella förvärv programvara eller Seal Test alternativ på förstärkaren kan användas för att övervaka elektrodmotstånd genom att tillämpa spänningssteg repetitivt.</li>
	<li>Fortsätt övervaka elektrodmotståndet medan elektroden avancerar mot en vald DSM-cell med en mikromanipulator (figur 4A). Obs! För att betraktas som en livskraftig DSM-cell måste cellen visa spindelformad långsträckt morfologi, en väldefinierad gloria runt cellen, skarpa kanter och semi-contractil (serpentin) utseende.</li>
	<li>Vid beröring av cellytan med elektroden - indikerad av en snabb ökning av elektrodresistansen mätt med membrantestfunktionen - bildar en giga-tätning genom att applicera ett mjukt snabbt negativt tryck på elektrodhållaren via slangar. Detta resulterar i ett negativt tryck som skapas på elektrodens spets och som drar cellmembranet i elektrodmedhjälp i bildandet av en giga-tätning eller en mycket tät kontakt mellan elektroden och plasmamembranet (figur 4B).</li>
	<li>När giga-tätningen bildas, kompensera pipettkapacitans genom att justera snabba och långsamma rattar på den kommersiella förstärkaren och övervaka giga-seal stabilitet (läckageström) med hjälp av membrantestfunktionen.</li>
	<li>Låt tiden, vanligtvis 30-60 min, för amphotericin-B att sprida ner pipetten och föras in i plasmamembranet som bildar porer primärt selektiva till monovalenta katjoner. Under detta steg, fortsätt att övervaka giga-tätningen med membrantestfunktionen. Eftersom cellperforering ökar så gör amplituden av kapacitanstransienterna (jämför figur 4B kontra figur 4C visar ingen och effektiv cellperforering) mätt med membrantestfunktionen.</li>
	<li>När plåstretsperforering är optimal (bedömd av stabil seriemotstånd vanligtvis under 50 MΩ) avbryt du ut kapacitanstransienterna genom att justera rattarna för cellkapacitans och seriemotstånd på förstärkaren. Seriekompensation kan också utföras vid denna tidpunkt (figur 4D).</li>
	<li>När stabila spänningssteginducerade katjonströmmar som framkallas i det angivna protokollet observeras, applicera ett sammansatt eller fysiologiskt tillstånd för att testa genom superfusion och registrera svaren för kontroll-, provningstillstånd och washout (om möjligt) med programvara för kommersiellt förvärv.<ol>
<li>Rekordströmmar med ett rutinmässigt spänningsstegsprotokoll som innebär att hålla DSM-celler på -64 eller -74 mV och öka spänningen i steg om 10 mV för 400 eller 500 ms från -94 till +96 eller +106 mV och återgå till innehavspotentialen. OBS: Membranpotentialvärdena justeras för en vätskekorsningspotential på 14 mV (med P- och E-lösningar, tabell 2). Vätskekorsningens potential erhålls i den kommersiella förvärvsprogramvaran (Table of Materials) genom att klicka(Verktyg>Junction Potentials)och ange koncentrationerna av lösningsjonkomponenter. Ett rampprotokoll kan också användas för att hämta aktuella inspelningar.</li>
		<li>Kör spänningsprotokollet i kontinuerlig ~1 min intervall under ett experiment inspelningströmmar för förtilläggskontroll, testtillstånd och washout.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Dataanalys och visualisering
<ol><li>Öppna inspelade filer i den kommersiella dataanalysprogramvaran (Table of Materials) för kontroll, testtillstånd och diskning genom att klicka på Arkiv>Öppna data och välja filer av intresse för öppning. OBS: För analys öppnas och analyseras vanligtvis tre filer (var och en innehållande en enda uppsättning spårningar till en enda protokollkörning) för varje villkor. Svaren är därefter i genomsnitt för att få ett genomsnittligt svar för varje villkor. Den programvara som används för datainsamling innehåller en möjlighet att automatiskt samla in användarspecificerade flera testkörningar och genomsnitt dem för enstaka utdatafil som kan användas som ett alternativ.</li>
	<li>Få det genomsnittliga svaret under de senaste 200 ms för den aktuella spår som mäts vid varje spänning; det valda varaktighetsintervallet återspeglar en strömaktivering av strömsteg sett mellan stöd. För att göra det följ stegen nedan.<ol>
<li>Välj en fil av intresse för analys i den kommersiella analysprogramvaran (Table of Materials). Programvaran placerar den senast importerade filen i sitt aktiva visningsfönster. Den öppna filen visar en serie överlappande spår som erhållits med ett spänningsstegsprotokoll. Som standard visas fyra markörer i det aktiva fönstret (som visar x- och y-värden för den markerade spårningen).</li>
		<li>Välj analysområde genom att placera markören 2 i slutet av spänningssteget 400 eller 500 ms och markör1 med intervallet 200 ms innan dess så att analysområdet är 200 ms.</li>
		<li>Få svar för varje spänning genom att klicka på Analysera>Snabbdiagram>IV (eller IV-genvägsikonen) (i snabbfönstret innan du genererar data bekräftar att för y-axelns (aktuella) signalregionalternativ "Markörer na 1..2" och "Mean" är markerade). Klicka på OK om du vill generera I-V-diagrammet och placera data i ett resultatkolumnblad som kan visas genom att komma åt Windows>Resultat.</li>
		<li>Analysera ytterligare filer genom att upprepa steg 4.2.1 - 4.2.3. Klicka på Analysera> Snabbdiagram> IV eller IV-ikonen genväg, välj Lägg till i stället för Ersätt för att lägga till ytterligare data i resultatbladet när du bearbetar spåren.</li>
		<li>Kopiera data till ett kalkylblad genom att markera kolumner av intresse och trycka på CTRL +C för att kopiera och CTRL+V för att klistra in. Lagra kalkylbladet Resultat i det kommersiella analysprogrammet(Table of Materials) i (*.rlt) -format genom att klicka på Arkiv>Spara som.</li>
	</ol>
</li>
	<li>För varje cell normaliserar du svaren för alla tre förhållandena till värdet av det maximala spänningssteget för förtilläggskontrollen (enligt formeln: Respons-/responskontroll-Max ) och diagram svaren som aktuella (eller aktuelldensitet) värden jämfört med spänningsförhållanden(figur 6).<ol>
<li>I ett kalkylblad svar, bestämma de genomsnittliga svaren som antingen strömmar (pA) eller aktuella tätheter (pA / pF) för kontroll, testtillstånd (i detta exempel, 9-fenanthrol) och washout vid varje spänningsteg.</li>
		<li>Dividera värden för varje spänning för varje tillstånd (kontroll, 9-feantrop, och washout) med maximal kontrollrespons som erhålls vid den högsta spänningen (+96 mV i figur 6) för förtilläggskontrollen enligt formeln: Normaliserat svar för tillstånd(x) = Respons(x)/Responskontroll-Max för (x).</li>
	</ol>
</li>
	<li>För sammanfattningsanalys ordnar du data i ett format som enkelt kan kopieras till ett grafiskt program (t.ex.</li>
</ol>

De förfaranden som beskrivs här förklarar de steg som är inblandade i beredningen av livskraftiga, nyligen isolerade DSM-celler från hela tjockleken mänskliga urinblåsan exemplar med enzymatisk matsmältning och i inspelningen av hela cellen kation strömmar känsliga för TRPM4 kanalinhibitor 9-feantropi använder amphotericin-B perforerade patch-clamp strategi. Det enzymatiska förfarandet bygger på en tvåstegs sekventiell exponering som häri kallas sekventiell papain-collagenase matsmältningsmetod. DSM vävnader behandlas först med papain och ditiotiotelitol (ett enzym stabiliserande medel) under en nominell Ca2 +-fritt tillstånd, följt i det andra steget av kollagen typ II i närvaro av låg Ca2 +. Motiveringen för att utföra papain matsmältning under låga Ca2 + villkor i glatta muskelceller går tillbaka till slutet av 1980-talet. Nyligen isolerade halspulsådern glatt muskelceller beredda med papain visas en långsträckt form, visade livskraft (motstånd mot trypan blå upptag) och svarade på kontraktil stimuli (högre Ca2 + och histamin)65. År senare tillämpades denna metod vid beredning av DSM-celler (se tabell 1). Valet av kollagen typ II snarare än andra typer avser dess relativt höga proteolytiska aktivitet idealiskför glatt muskelvävnader inklusive DSM. I själva verket kan kollagenbehandling ensam ge enstaka DSM celler om än kräver omfattande enzymexponering (≥60 min)53,54. Eftersom kollagenaktivitet beror på Ca2+ och enzymet är inaktivt under Ca2+-fria förhållanden, kräver optimal enzymatisk matsmältning av DSM-bitar förekomsten av Ca2+ 66. I vårt fall innehåller DS-C 100-200 μM [Ca2+] (tabell 2). Efter enzymatisk behandling tvättas smält DSM bitar försiktigt ett antal gånger med kallt DS utan enzymer eller Ca2+ för att avlägsna alla enzymer bundna till vävnader. Den iskalla DS hjälper till att bevara DSM cell integritet och att begränsa enzymatisk aktivitet av eventuella kvarvarande papain eller kollagen. I det sista steget släpper trituration av enzymbehandlade DSM-bitar med en brandpolerad Pasteur pipette singel-DSM-cell. DSM-celler placeras antingen omedelbart på en inspelningskammare för patch-clamp studier eller andra typer av experiment eller lagras på is i DS för användning senare samma dag (vanligtvis inom 8 timmar efter beredning, men cellerna förblir livskraftiga i upp till 24 timmar).
Vi identifierade flera viktiga överväganden för att framgångsrikt få enstaka DSM-celler. Den första gäller den mänskliga DSM-preparatets källkvalitet. För att optimalt bevara vävnadsintegriteten placeras DSM-prover som erhålls från öppna urinblåsanoperationer i iskalla DS så snart som möjligt och upprätthålls i en kall miljö. Specifikt, vid kirurgisk extraktion från patienten, urinblåsan exemplaret placeras omedelbart på ett helt förberett sidobord i operationssalen. Bruttoundersökning av hela exemplaret (vanligen erhålls under radikaleller enkel cystectomy) och dess öppning följa. Efter visuell inspektion avlägsnas ett helt tjockleksurinstegeexemplar från ett avlägset område av preparatet grovt oinvolverat med tumör och placeras omedelbart i en kopp (antingen 50 eller 100 ml) som innehåller kall (~4 °C) Dissektionslösning (DS) (tabell 2) och sedan tätt stängd med lock. På grund av den planerade karaktären av skördav vävnaden, operationsrummet personal och extra personal gör skörden varnas i början av det kirurgiska fallet för att få material tillgängliga i operationssalen vid tidpunkten för vävnadutvinning. Dessa försiktighetsåtgärder tillsammans med den rutinmässiga, repetitiva karaktären av bearbetningsstegen håller den varma ischemitiden för vävnaden - från extraktion till placering i kyld behållare med DS-lösning - till mindre än 5 min. Behållaren placeras sedan i kylskåp eller på is i en kylare för att upprätthålla den kalla miljön och transporteras (iskall) till laboratoriet. När exemplaret anländer i laboratoriet, dissekering och enzymatisk dissociation steg påbörjas. Det är mycket svårt att förutsäga om ett visst DSM-prov kommer att ge högkvalitativa DSM-celler efter enzymatisk dissociation, så vi fortsätter med enzymatiska dissociation steg. I många fall, parallellt med elektrofysiologiska experiment, genomför vår grupp isometriska spänningsinspelningar på DSM-remsor som utarbetats av samma DSM-prover. Vi har funnit att vi vanligtvis kan få högkvalitativa DSM-celler från preparat som också framgångsrikt ger livskraftiga remsor för isometristudier (vår opublicerade observation).
Den andra faktorn avser olika enzym parti variabilities. Vi observerade att för både papain och kollagen typ II, varje gång ett nytt parti enzym kommer från en leverantör, enzymaktiviteten i DS för vävnadsmatsmältning en variera. Vi optimerar därför rutinmässigt enzymkoncentrationen och inkubationsintervallen för varje nytt parti. För att minimera partiets variabilitet bidrag, beställer vi större mängder av samma parti och göra en stor sats av lager lösningar i 2 mL alikvoter av enzymer och lagra dem på ~ -20 ° C tills de används. Med tiden kan dock frysta lager (lagrade upp till 2 veckor) förlora sin enzymatiska verksamhet. Den tredje variabeln avser temperaturen hos enzymmatsmältningsbehandlingar. Enzymatiska aktiviteter av både papain och kollagen display temperaturberoende. Papain och kollagen typ II uppvisar aktivitet i temperaturområden som omfattar normal kroppsfysiologi67,68. Därför strävar vi efter att hålla enzymbehandlingarna stabila vid ~37 °C för att undvika högre temperaturer för att bevara DSM-cellintegriteten. Det fjärde övervägandet gäller variationen i kvaliteten på DSM-celler som finns inom varje beredning som sträcker sig från mycket livskraftiga (uppvisar utmärkta klassiska glatta muskelegenskaper) till icke-friska, översmälta celler. Ett långvarigt enzyminkubationsintervall är en av de främsta orsakerna till att få ett stort antal skadade celler. Överdriven enzymbehandlingar försämrar också proteinstrukturer av jonkanaler, receptorer och transportörer, vilket påverkar deras funktionalitet negativt. Tolkning av resultat från enzymatiskt erhållna, nyligen isolerade celler bör bära denna hänsyn i åtanke. Optimering av enzymmatsmältningsförhållanden syftar till att öka andelen mycket livskraftiga celler. Experimentella metoder som förlitar sig på ett högre antal livskraftiga celler såsom mikroarrayanalyser kräver mer robusta optimeringar än de som framgångsrikt utförs på färre celler som encellig patch-clamp elektrofysiologi eller Ca2 + imaging. Hänsyn till de ovannämnda faktorerna har väglett våra forskningsinsatser under det senaste decenniet för att få högkvalitativa enda DSM-celler.
Den perforerade patch-clamp tekniken har varit en stöttepelare elektrofysiologisk strategi i över ett kvarts sekel. Flera publikationer innehåller närmare uppgifter om de tekniska övervägandena69,70,71,72,73. Cellperforering kan erhållas med amphotericin-B, nystatin, gramicidin eller β-escin (se referens32för översikt över varje). Den största fördelen med perforerade patch-clamp inspelningar över andra elektrofysiologiska metoder är att den inhemska intracellulära miljön - inklusive intracellulära Ca2+ 2+ 2+ 2+och signalmolekyler (t.ex. cAMP, PKA, fosfater och fosfodiesteras) - bevaras. Denna teknik är därför idealisk för att undersöka hela celljonkanalströmmarna och deras regleringsmekanismer under nära fysiologiska förhållanden. En viktig varning är att intracellulär cellsammansättning inte kan styras exakt till skillnad från andra elektrofysiologiska metoder som konventionella hela cellen och enkanals struket-patch (inside- och outside-out) inspelningar. Enligt vår erfarenhet bidrar tre faktorer rutinmässigt till framgångsrika experimentella resultat av amphotericin-B-perforerade patch-clamp experiment. Den första är kvaliteten på dsm-cellen som valts för att försöka spela in. När DSM-celler är mycket livskraftiga visar en semi-contractil (serpentin-liknande), hög kontrast glänsande utseende med en väldefinierad gloria runt cellytan och fäst tätt på glasbotten av inspelningskammaren sedan giga-tätning formation och cell perforering inträffar relativt lätt. Den andra och tredje faktorerför framgång, respektive, avser kvalitet källa och löslighet av amphotericin-B (i dimetylsulfoxid/DMSO och intracellulär pipettlösning). Vi observerade avvikelser mellan olika leverantörer när det gäller källa och partivariationer. Varje dag förbereder vi en ny lösning av amphotericin-B-stamlösning från pulver följt av dess utspädning i intracellulär pipettlösning. Dessa steg kräver omfattande ultraljudsbehandling och virvelring. Med nytillverkad amphotericin-B-innehållande pipettlösning, framgångsrik cellperforering (<50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K mω)="" following="" giga-seal="" formation="" can="" be="" usually="" obtained="" within="" 30="" min.="" the="" concentration="" of="" amphotericin-b="" in="" the="" pipette="" solution="" also="" requires="" optimization="" dependent="" on="" the="" amphotericin-b="" lot="" and="" source.="" under="" our="" experimental="" conditions,="" the="" final="" amphotericin-b="" concentrations="" in="" the="" pipette="" range="" from="" 200="" to="" 500="" µg/ml.="" since="" amphotericin-b="" exhibits="" light="" sensitivity,="" its="" solutions="" need="" to="" be="" kept="" in="" the="" dark.="" using="" the="" amphotericin-b="" perforated="" patch-clamp="" technique,="" our="" group="" recorded="" voltage-step="" induced=""></50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K>+, Ca2+ 2+ 2+ 2+, och icke-selektiva katjonströmmar från celler med människa, marsvin, mus och/eller råtta DSM17,21,22,23,29,30,31,35,60. Här beskriver vi villkoren för registrering av icke-selektiva katjonströmmar i mänskliga DSM-celler. 9-Phenanthrol, en blockerare av TRPM4-kanaler, försvagade spänningssteg inducerade strömmar som stöder dessa kanalers roll i kontrollen av DSM:s retbarhet. Som en anmärkning kräver det vanligtvis minst 45 min efter att ha fått en giga-tätning och inledande av perforering för att registrera optimala stabila spänningssteg inducerade icke-selektiva katjonströmmar. Spänningsramper kan också användas som ett alternativ till spänningsstegsprotokoll30,64. Här var ett spänningsstegprotokoll från en hyperpolariserad membranpotential att föredra snarare än en rampprotokoll eftersom den tidigare metoden minimerar effekten av spänningsberoende inaktivering och möjliggör i genomsnitt av framkallad ström under en varaktighet spänningssteg där rampen ger en enda datapunkt per spänning. Den senare punkten gäller särskilt mänskliga DSM-celler eftersom strömmarna visar variabel aktivitet under spänningssteg (Figur 5OchFigur 6). Den amphotericin-B perforerade patch-clamp teknik har varit avgörande för att identifiera egenskaperna hos DSM celler och andra celltyper och kommer att fortsätta att medhjälpare i att ge nya upptäckter i framtiden. Dessutom kan nyligen isolerade enstaka DSM-celler framgångsrikt användas för att mäta hela cell En+Cl-och Ca2+ 2+ 2+ 2+strömmar med det konventionella läget för patch-clamp teknik, membran potentiell inspelning med den aktuella klämman, och enstaka kanal inspelningar som exemplifieras av våra tidigare rapporter23,29,35,64.
Förutom encelliga patch-clamp metoder kan nyligen isolerade DSM-celler studeras med andra tekniska metoder, inklusive Ca2+ imaging, RT-PCR/q-RT-PCR, immunocytokemi, in situ närhetligationsanalys och genomiska metoder (t.ex. mikroarray, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Som enda cell transkriptom bestämningsmetoder fortsätter att utvecklas och bli mycket känsliga, föreställer vi oss i en framtida förmåga att rutinmässigt och specifikt länka elektriska eller farmakologiska egenskaper hos enskilda DSM celler med deras transkriptom / proteom profiler. Detta kommer att uppnås genom första inspelning från en DSM-cell och sedan extrahera mRNA eller protein följt av transkriptomiska/ proteomiska analyser. Även om sådana metoder redan har testats i icke-DSM-celler, är de för närvarande tekniskt utmanande, saknar känslighet som skall betraktas som rutin och begränsas till framgångsrik upptäckt av några utvalda genprodukter74. Funktionsmolekylära profiluttryck som kopplar samman studier när de görs på DSM-celler som erhålls från urinblåsor som härrör från kontroll och sjuka patientgivare kommer att ge insikter i fysiologiska processer som är nödvändiga för att driva normala DSM-funktioner, patogenes och identifiera effektiva nya terapeutiska metoder.

Detrusor glatt muskulatur (DSM) celler utgör den mest rikliga celltypen i urinblåsan och slutligen kontrollera urinlagring och tomning genom avslappning och sammandragning, respektive. DSM-celler bildar glatta muskelbuntar som sammanflätas med intilliggande bindväv, nervprocesser, interstitiella celler och andra celltyper1. Den nuvarande förståelsen av dsm-cellernas roll i urinblåsans funktion har uppnåtts genom en multi-level integrerad strategi. Varje experimentell metod - oavsett om den baseras på isolerade enstaka celler in vitro, vävnadsremsor som innehåller glatta muskelbuntar in vitro/ex vivo, eller in vivo-bestämningar (t.ex. cytometri- och voidingfunktionbedömningar) - ger viktiga och specifika insikter om fysiologiska och farmakologiska egenskaper hos DSM (se recensioner1,2,3,4,5,6 för detaljer). Tolkning av resultat från isolerade enstaka celler gör det dock möjligt att särskilt tillskriva slutsatser till själva celltypen. Denna insikt har varit drivkraften för att etablera en tillförlitlig och reproducerbar metod för att få nyligen isolerade DSM-celler från hela tjockleken urinblåsan exemplar. Till skillnad från många andra celltyper kan glatta muskelceller inte tillförlitligt odlas på grund av förlusten av deras inhemska fenotyp inklusive specifika förändringar i deras elektrofysiologiska och kontraktila egenskaper7,8. Detta faktum förstärker ytterligare vikten av studier som utförts på fysiologiskt aktiva nyisolerade DSM-celler.
I slutet av 1980-talet och början av 1990-talet publicerade Isenbergs grupp (Tyskland) en rad elektrofysiologiska studier på nyisolerade DSM-celler som erhållits från urinblåsor9,10,11,12,13 ( tabell1). Metoden belyste två viktiga observationer som hjälpte till att få vitala celler och fungerade som en första riktlinje för andra att följa. De var 1) förbehandling isolerade DSM bitar med Ca2 +-fri lösning / medium före enzymatisk behandling och 2) vävnad matsmältning med en lösning som innehåller kollagen. Dessa två kritiska steg har införlivats i alla efterföljande varianter av DSM-celldissociationsprocedurer(tabell 1). För närvarande använder vår grupp en tvåstegs sekventiell papain-collagenase dissociation strategi. DSM bitar behandlas först med en enzymlösning som innehåller papain och sedan med kollagen typ II löslig i samma lösning (DS, dissekering / matsmältningslösning). Detta tillvägagångssätt ger enstaka DSM-celler från olika arter, inklusive marsvin, gris, råtta, mus och huvudsakligen människa(tabell 1).
Enstaka DSM-celler ger en källa för flera molekylärbiologi och fysiologiska experiment. Hittills har protein- och mRNA-uttryck studerats med immunocytokemi, eller RT-PCR/qRT-PCR-bestämningar visade höga nivåer av detektion för olika jonkanaler, inklusive den stora ledningsspänningen- och Ca2+-aktiverad (BK), liten ledningsenhet Ca2+-aktiverad K+ typ 3 (SK3), spänningsinstiftade K+ (Kv),L-typ spänningsstyrd Ca2+ (Cav) och transientreceptorpotential melastatin typ 4 (TRPM4) kanaler, samt en Na/Ca2+ utbyte 14,15,16,17,18,19,20,21,22. De är alla tänkt att kontrollera DSM retbarhet, intracellulära Ca2 + nivåer och kontraktilitet. Patch-clamp elektrofysiologiska metoder, utförs direkt på marsvin, mus, råtta eller mänskliga DSM celler, tillhandahålls direkt demonstration av biofysiska och farmakologiska egenskaper av L-typ Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK och TRPM4 kanaler17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. Tillvägagångssätten inkluderade en konventionell helcellspänningsklämma, en perforerad spänningsklämma och enkanalsinspelningar (cellansluten, inifrån och ut- och utvändiga konfigurationer). Dessutom, membran potentiell inspelning av DSM med hjälp av en ström-klämma som bevis för att mål-engagerande farmakologiska medel ändra cellen retbarhet. TRPM4-hämmaren 9-feantropinducerad hyperpolarisering i DSM-celler som erhållits från människor, marsvin och råttaurinblåsar19,20,22,31. Bland de olika elektrofysiologiska metoderna ger amfotericin-B (och nystatin, gramicidin och β-escin) perforerade patch-clamp inspelningar en viktig fördel genom att bevara inneboende intracellulära signalmolekyler och vägar. Endast lågmolekylära katjoner och i mindre utsträckning, Cl- men inte proteiner eller signalmolekyler inklusive Ca2 + - kan genomföras genom plasmamembranet porer bildas av amphotericin-B eller nystatin32. Det framgångsrika resultatet av perforerade patch-clamp experiment beror på flera allmänna variabler som är unika för denna teknik. Här beskriver vi detaljerna i förfarandet med hjälp av amphotericin-B att vår grupp har använt framgångsrikt under åren15,22,33,34,35,36,37,38,39.
Förmodligen är icke-selektiva katjonkanaler fortfarande en av de minst förstådda kanaltyperna i DSM-celler. Den första rapporten från en icke-selektiv katjonliknande kanal går tillbaka till 1993. Papperet av Wellner och Isenberg11 beskrev en 33 pS stretch-aktiverad enda kanal som visar följande rang ordning jonpermeabilitet: K+> Na+>Cs+>>>Ba2+> Ca2+, och hämning av kanalaktivitet av Gd3 +, en allmän hämmare av icke-selektiva katjonkanaler. Nästan ett decennium senare beskrev Thorneloe och Nelson40 Na+ permeable katjonströmmar i mus DSM celler, hämmas av Gd3 +, med hjälp av hela cellinspelningar. Eftersom molekylära identiteter av icke-selektiva katjonkanaler och deras biofysiska karakteriseringar återstår att fastställa, är framtida undersökningar inom detta forskningsområde motiverade. Protokollet beskrivs häri för registrering av icke-selektiva kationkanalströmmar - med hjälp av extracellulära och pipette intracellulära lösningar som innehåller Cs+, TEA+och nifedipin (tabell 2) som fysiologiskt och farmakologiskt mildra Kv och Cav strömmar - har varit och kommer att fortsätta att vara användbara i elektrofysiologiska undersökningar av icke-selektiva katjonkanaler. Vi har använt detta specifika protokoll för att fastställa omfattningen av hämning av hela cellen kationströmmar av TRPM4 kanalblockerare 9-feantropi i marsvin, råtta och mänskliga DSM celler19,20,22.
Sammantaget ger den metod som beskrivs här för att få nyligen isolerade enstaka DSM-celler från mänsklig urinblåsa nappar livskraftiga celler som är mycket lämpliga för elektrofysiologiska undersökningar med hjälp av olika konfigurationer av patch-clamp-tekniken, Ca2+-avbildning, immunocytokemi, in situ proximal rättstvister analys, och encelliga RT-PCR/qRT-PCR samt avanceradmolekylärbiologiska tekniker inklusive mikroarray analys, RNA-seq, och CHIP-seq. Användningen av den perforerade patch-clamp-metoden för amphotericin-B bevarar den inbyggda cellmiljön till skillnad från andra konfigurationer. När de utförs med hjälp av de specifika villkor som beskrivs här, utformade för att förneka bidrag av K+ och Ca2+ strömmar i DSM-celler, spänningssteg inducerad strömmar visar egenskaperna hos icke-selektiva katjonströmmar som lämpar sig för biofysiska och farmakologiska karakteriseringar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td>Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-Phenanthrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>211281</td>
			<td>TRPM4 channel inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP928-250</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>European Pharmacopoeia Reference Standards</td>
			<td>5</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-100MG</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9006</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Extracellular solution and DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-7.5</td>
			<td>Capillary for preparation of pulled patch electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8518</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>pCLAMP-10</td>
			<td>Commerical software and part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004177</td>
			<td>DS-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203025</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Miltex Dental Wax Technologies, Inc.</td>
			<td>18058351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer with Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-077-32</td>
			<td>Placed in tissue bath to monitor temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DDT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Reducing agents used together with Papain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Required to pull electrodes with very fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating foam tube rack/holder</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82017-634</td>
			<td>Used for holding tubes with enzymes for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid (Na salt)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>pH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Data Acquisition System</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-442-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroForge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Used for fire-polishing electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7634</td>
			<td>L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of Patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-metalic syringe needle, MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF-34G-5</td>
			<td>Filling of intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>DS-P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Axon Axopatch 200B</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC computer</td>
			<td>DELL</td>
			<td>Custom configuration</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Aspera Instruments</td>
			<td>PH700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427-436</td>
			<td>Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue bath, 100 mL</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>1583-101</td>
			<td>Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl tubing</td>
			<td>ColePalmer</td>
			<td>06405-3</td>
			<td>Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulator bath, Haake D1 L</td>
			<td>Haake</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Connected to tissue bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents

Detrusor glatt muskulatur (DSM) celler som finns i urinblåsan väggen underlättar i slutändan urinlagring och voiding. Beredning av livskraftiga, färska och isolerade DSM-celler utgör en viktig teknisk utmaning vars prestation ger optimala celler för efterföljande funktionella och molekylära studier. Den metod som utvecklats och utarbetats häri, framgångsrikt används av vår grupp i över ett decennium, beskriver dissekering av mänskliga urinblåsan exemplar som erhållits från öppna urinblåsan operationer följt av en enzymatisk tvåstegsbehandling av DSM bitar och mekanisk trituration för att få nyligen isolerade DSM celler. Det första steget innebär dissekering för att separera DSM-skiktet (även känd som muscularis propria) från slemhinnor (urothelium, lamina propria och muscularis slemhinna) och den intilliggande bindväv, vaskulära och fettvävnader närvarande. DSM skärs sedan i bitar (2-3 mm x 4-6 mm) i nominell Ca2+-innehållande dissektion/matsmältningslösning (DS). DSM bitar överförs nästa till och sekventiellt behandlas separat med DS innehållande papain och kollagen vid ~ 37 °C för 30-45 min per steg. Efter tvättar med DS innehållande enzymfritt bovint serum och trituration med en brandpolerad pipett, bitarna släppa enstaka DSM celler. Nyisolerade DSM-celler är idealiska för plåster-klämma elektrofysiologiska och farmakologiska karakteriseringar av jonkanaler. Närmare bestämt visar vi att TRPM4 kanalblockerare 9-feantropi minskar spänningssteg framkallade katjonströmmar registreras med amphotericin-B perforerade patch-clamp strategi. DSM celler kan också studeras av andra tekniker såsom encelliga RT-PCR, microarray analys, immunocytokemi, in situ närhet ligering analys, och Ca2 + imaging. Den största fördelen med att använda enstaka DSM-celler är att de observationer som gjorts avser direkt med visade enstaka cellegenskaper. Studier av nyligen isolerade mänskliga DSM celler har gett viktiga insikter som kännetecknar egenskaperna hos olika jonkanaler inklusive katjon-genomsläpplig i urinblåsan och kommer att fortsätta som en guldmyntfot i belysa DSM cellulära egenskaper och regleringsmekanismer.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

Vi beskriver en metod för beredning av den enda nyligen isolerade detrusor glatta muskelceller från mänskliga urinblåsan exemplar använder en tvåstegs enzymatisk procedur. De erhållna livskraftiga DSM-cellerna kan studeras av olika tekniker med en cell, inklusive den beskrivna amphotericin-B-plåster-clampelektrofysiologi för att avslöja fysiologiska och farmakologiska egenskaper.

Beredning och användning av nyligen isolerade mänskliga detrusor glatta muskelceller för karakterisering av 9-Feanthrol-Känsliga Katjonströmmar

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...

Detrusor glatt muskelceller bildar väggen i urinblåsan som slutligen underlättar urinen makulering och lagring. Vårt protokoll ger en validerad och tillförlitlig metod för nyisolering av enstaka glatta muskelceller. Nyisolerade mänskliga detrusor glatta muskelceller ger en möjlighet till elektrofysiologiska och molekylära undersökningar på encellsnivå.Genom att studera enstaka detrusor glatta muskelceller från kontroll, normal, och sjuka mänskliga urinblåsor, vi har möjlighet att validera farmakologiska mål såsom jonkanaler. Enda mänskliga detrusor glatta muskelceller är idealiska för elektrofysiologiska experiment såsom patch-clamp elektrofysiologi. Här kommer vi att presentera ett exempel på att studera en enda jonkanal med namnet TRPM4, transient receptor potential melastatin fyra kanal, som är en icke-selektiv katjon kanal.Nybörjare kan kämpa med dissektion och enzymatisk behandling steg som kräver effektivitet och förtrogenhet inklusive erkänner kritiska viktiga steg för att erhålla färska isolerade DSM celler. Det är viktigt att vara bekant med mänskliga urinblåsan histologi, protokoll steg för att isolera enstaka celler förblir motståndskraftiga, och initialt förväntar sig att få suboptimala celler med hjälp av detta protokoll. Börja med att undersöka hela tjockleken urinblåsan exemplar.Nåla fast preparatet, slemhinnan uppåt och serosa ner på en silikon enantiomer-belagda 150 mm rund skålen fylld med iskall DS och försiktigt ta bort alla slemhinnan genom skarp dissekering. Klipp ut flera slemhinna-fri detrusor smidig muskel eller DSM bitar. Placera tre till sex DSM bitar i ett rör med en till två milliliter av förvuppverade DS som innehåller papain och dithiothreitol, eller DS-P.Inkubera dem i 37 grader Celsius i 30 till 45 minuter, se till att skaka röret var 10 till 15 minuter. Efter inkubationen, ta bort DS-P från röret och kort tvätta DSM-bitarna med iskall DS. Överför DS med DSM bitar till ett nytt rör och ta bort DS, lämnar DSM bitar i botten av röret. Lägg till en till två milliliter DS som innehåller kollagenas typ II, eller DS-C, till röret.Och inkubera den vid 37 grader Celsius med enstaka skakningar. Kassera DS-C och tvätta de enzymbehandlade DSM-bitarna fem till tio gånger med iskall DS. Efter den sista tvätten lämna DS inne i röret, och försiktigt triturate bitarna med en brand-polerad Pasteur pipett att släppa enda DSM celler. Pipett 0,25 till en milliliter cellupphängning på en glasbottenkammare som sitter på scenen i ett inverterat mikroskop och inkuberar den i minst 45 minuter så att cellerna kan hålla sig.Ta sedan bort DS från badet och byt ut det mot E-lösning via superfusion. Dra flera patch elektroder, brand-polish elektrodspetsar, och päls tipsen i dentalt vax om det behövs. Fyll spetsen på en plåsterelektrod med pipettlösningen utan amphotericin-B genom att kort doppa elektroden i lösningen.Framgång av patch clamp elektrofysiologi beror på DSM cellkvalitet och amphotericin-B solubilisering. Återfylla elektroden med samma pipettlösning som innehåller amphotericin-B och montera elektroden på en hållare som är ansluten till en patch clamp-förstärkares huvudsteg. Använd en mikromanipulator för att placera elektroden precis under ytan av den extracellulära lösningen så att spetsen på elektroden är bara nedsänkt.Sedan, bestämma elektrodmotståndet med hjälp av membrantestfönstrets funktion av den kommersiella förvärvsmjukvaran och för fram elektroden mot intressecellen. När du vidrör cellytan med elektroden, bilda en giga-tätning genom att applicera skonsamt snabbt undertryck på elektroden via slangar. Detta resulterar i undertryck vid spetsen av elektroden vilket resulterar i en lyckad giga-tätning som bekräftas av membrantestet.Låt 30 till 60 minuter för amphotericin-B att sprida ner pipetten och föras in i plasmamembranet, bildar porer främst selektiva till monovalenta katjoner. Fortsätt att övervaka giga-tätningen med membrantestfunktionen. När plåstrets perforering är optimal, avbryter du kapacitanstransienterna genom att justera rattarna för cellaacitans och seriemotstånd på förstärkaren.När de stabila spänningsstegsjonströmmarna observerats registrerar du strömmar med routningsspänningsstegsprotokollet enligt beskrivningen i manuskriptet. Applicera en förening eller ett fysiologiskt testtillstånd för att testa genom superfusion och registrera svaren för kontroll- och testförhållandena samt washouten. Detta protokoll kan användas för att isolera friska, färska DSM-celler för funktionella och molekylära studier.Friska enstaka DSM-celler kännetecknas av spindelformad morfologi, skarpa väldefinierade kanter, en väldefinierad gloria runt cellen och halvkontraktilt utseende när de visas under mikroskopet. Vidare svarar de nyligen isolerade DSM-cellerna på mekanisk stimulering och på carbachol. Cellfragment och icke-viabla eller översmälta celler bör undvikas i efterföljande patch-clamp experiment.De isolerade cellerna har använts i amphotericin-B perforerade patch-clamp experiment där hel-cell strömmar mättes med antingen en spänning-steg inducerad eller ramp protokoll i tre olika mänskliga DSM celler. Experiment visade att 9-phenanthrol, en TRPM4 kanal hämmare, effektivt och reversibelt hämmade mänskliga DSM katjon strömmar. Den 9-phenanthrol-känsliga nuvarande komponenten illustrerar en starkare hämning vid positiva spänningar och utåt rättelse.Tillstånd av enzymatiska behandlingssteg, steg 2.2 och 2.3, inklusive temperatur, varaktighet av enzymbehandlingar, enzym partikällor och kvalitet på DSM-celler, är avgörande bestämningsfaktorer för att erhålla mänskliga DSM-celler av hög kvalitet. Mänskliga DSM-celler är också idealiskt lämpade för utvärdering av intracellulära andra messenger nivåer inklusive kalcium och cykliska AMP, upptäcka proteinuttryck av immuncytokemi, och co-uttryck genom in situ proximala tvister assay, och mRNA uttryck av RT-PCR, qRT-PCR, microarrays, och nästa generations sekvensering. Mänskliga DSM celler har avancerat vår förståelse av rollerna för BK, kalcium, TRPM4 kanaler i urinblåsan.Framtida utvecklingar kommer att göra det möjligt att specifikt länka elektrofysiologiska eller farmakologiska egenskaper med transkriptom- eller proteomprofilerna.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca 2 + Övergående Påvisande i glatt muskulatur

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolering av mänskliga Umbilical arteriella glatta muskelceller (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex vivo Bedömning av kontraktilitet, fatigability och Alternans i isolerade skelettmuskler

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolering av lungartären glatta muskelceller från neonatala möss

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Mätning av Smooth muskelfunktion i isolerad vävnad Bath-ansökningar till farmakologi Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Två-foton Imaging av intracellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Hantering och kväveoxidproduktion i Endothelial och glatta muskelceller av en isolerad råttaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Enkanalig Analys och Kalcium Imaging i podocyter av nyisolerade Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Mätning av kalcium Fluktuationer Inom sarkoplasmatiska retiklet av odlade glatta muskelceller Använda FRET-baserade Confocal avbildning

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering av murin Coronary vaskulära glatta muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption: Överföra isolerat humant MSC Mitokondrier till Glioblastoma stamceller

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...