Name: preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents
Uploaded: 2020-01-31T12:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Bu çalışma NIH-R01DK106964 ve P20DK123971 tarafından Georgi V. Petkov'a hibeler ile desteklenmiştir. Yazarlar makalenin eleştirel değerlendirmesi için Dr Viktor Yarotskyy ve Bayan Sarah Maxwell teşekkür ederiz. Biz de MUSC ve UTHSC üroloji personeli cerrahlar için müteşekkiriz: Dr Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter ve Anthony Patterson yanı sıra MUSC ve UTHSC Üroloji sakinleri: Dr Taylor Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O'Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata insan doku toplama ile yardım için.

Burada açıklanan tüm yöntemler Tennessee Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulu Komiteleri (Memphis, TN, IRB # 17-05714-XP) ve Güney Carolina Tıp Üniversitesi (Charleston, SC, IRB # 00045232) tarafından onaylanmıştır. Onaylanan prosedürler tüm kalınlıkta idrar kesesi örnekleri (>1 cm by >1 cm) - mukoza, detrusor düz kas ve serosa gibi tüm katmanları içeren kan damarları ve yağ dokusu bağlı) - mesane cerrahi kısmi çıkarma geçiren hasta-donörlerden toplanacak. Hasta-donörler yetişkin (şimdiye kadar çalışılan yaş aralığı: 25-87 yaşında), ya erkek ya da kadın, aşırı aktif mesane belirtileri olan veya olmayan (Amerikan Üroloji Derneği I-PSS skoru41ile sınıflandırılır). Cerrahi işlemler ürotelyal karsinom için radikal sistektomi ve adenokarsinom dahil olmak üzere çeşitli tıbbi koşulları içerir. Bu gibi durumlarda, toplanan idrar kesesi örneği tümör bölgesinden uzaktır.
1. DSM dokularının diseksiyonu ve mukozasız DSM parçalarının hazırlanması
<ol><li>Ameliyathaneden laboratuvara gelen idrar kesesi numunesinin tamamını soğuk diseksiyonu/sindirim çözeltisi ile dolu sıkıca kapatılmış bir kapta inceleyin (DS bileşimi içinŞekil 1 ve Tablo 2). NOT: Numune genellikle laboratuvara gelmeden önce birkaç saatten geceye kadar soğuk DS'de saklanır. Daha uzun depolama için, DS (Tablo 2) 1 mM CaCl2ile desteklenir.</li>
	<li>İnsanın tüm kalınlığı DSM örneğini (mukoza, DSM ve serosa dahil tüm katmanları içeren) buz gibi ds ile durulayarak ekteki enkaz ve kanı temizle.</li>
	<li>İdrar kesesi örneğini, mukozayı yukarı bakacak şekilde ve serosa aşağı, silikon enantiomer kaplı(Malzeme Tablosu)150 mm çapında buz gibi DS ile doldurulmuş yuvarlak tabağa sabitler (Şekil 1B).</li>
	<li>Mikrosksörler ve forceps kullanarak keskin diseksiyonu ile komşu yağ dokusu, kan damarları, epitel (urothelium) ve kas mukozasını numuneden çıkarın.</li>
	<li>Birkaç mukozaiçermeyen DSM parçasını (~2-3 mm uzunluğunda ve 4-6 mm genişliğinde) kesin (Şekil 1C).</li>
</ol>2. Taze izole edilmiş tek DSM hücreleri veren DSM parçalarının enzimatik ayrışması
<ol><li>3 ila 6 DSM parçalarını önceden ısıtılmış (~37 °C) DS içeren bir tüpe papain ve dithiothreitol (DS-P, Tablo 2) içeren bir tüp içine yerleştirin ve DS-P'de 30-45 dakika ~37 °C'de dsm parçalarını yavaşça tlayarak tüpü (her 10-15 dakika) yerleştirin. NOT: Enzimtedavisi için sıcaklığı en iyi şekilde kontrol etmek için, doku parçaları ve enzim solüsyonlu tüpler, sirkülasyonlu ısıtılmış su banyosuna bağlı su yla dolu bir cam doku haznesine(Şekil 1D)veya yüksek hassasiyetli sıcaklık kontrollü sallayarak su banyosuna(Şekil 1E)yerleştirilir.</li>
	<li>DS-P'yi tüpten çıkarın, DSM parçalarını kısaca buz gibi DS ile yıkayın, tüpün alt kısmında oturan DSM parçalarını bırakarak tüpten soğuk DS atın.</li>
	<li>DSM parçaları ile tüpe DS içeren kollajenaz tip II (DS-C, Tablo 2)1 ila 2 mL ekleyin, hafifçe karıştırın; ve ~37 °C'de 25-40 dk kuluçkaya yayılarak tüpü ara sıra sallayarak (her 10-15 dk).</li>
	<li>DS-C'yi atın ve enzimle işlenmiş DSM parçalarını buz gibi DS ile 5-10 kez yıkayın.</li>
	<li>Son yıkamadan sonra, tüp içinde DS çözeltisi bırakın; tek DSM hücrelerini serbest bırakmak için ateşte cilalanmış Pasteur pipetiyle hafifçe triturate.</li>
	<li>Dağınık DSM hücrelerini içeren birkaç damla DSM çözeltisini bir cam alt haznesine veya bir kapak altına yerleştirin ve hücrelerin yapışmasını sağlamak için uygulamayı takip eden en az 5 dakika sonra mikroskop altında (20x veya 40x hedefi kullanarak) kaliteyi görsel olarak inceleyin alt.</li>
	<li>Elektrofizyolojik deneyler için hemen taze izole edilmiş DSM hücrelerini kullanın veya hücreleri ~4 °C'de ~4 °C'de veya buzdolabında kullanıma kadar (genellikle 8 saate kadar hazırlık için) içeren bir tüpte saklayın. NOT: Aynı hazırlık içinde hücrelerin kalitesi son derece canlı dan aşırı sindirilmiş, ölü DSM hücreleri(Şekil 2)değişir. Sıralı papain-kollajenaz yöntemi çok yüksek sayıda unviable hücre verdiğinde, hazırlık atılır ve DSM parçalarının yeni bir sindirim icra edilir ama azaltılmış kuluçka aralıkları ile. Eğer işlem DSM parçalarının sonraki sindirimi için çok az DSM hücresi yle sonuçlanırsa, kuluçka aralıkları artar. Α-düz kas aktinine pozitif immünoreaktivite DSM hücrelerinin kimliğini doğrular(Şekil 3).</li>
</ol>3. Amphotericin-B delikli tam hücre gerilimi yama-kelepçe tekniği kullanılarak DSM hücrelerinden gerilim adımlı katyon akımlarının kaydedilmesi
<ol><li>Pipet 0.25-1 mL hücre süspansiyonu ters bir mikroskop un sahne üzerinde oturan bir cam alt hazneüzerine ve hücrelerin cam alt yapışmasını sağlar.</li>
	<li>En az 45 dakika kuluçkadan sonra, Banyodan DS'yi çıkarınve giriş tüpü ile yerçekimi yardımıyla çözelti akışının ds'nin yerini yeni solüsyonla değiştirdiği süperfüzyon ile DS'yi vakumlu atık kabına bağlı çıkış borusu oda çözeltisini kaldırır ve taşmasını önler. E çözeltisi K+ akımları inhibe etmek için tetraethylammonium (TEA+) ve sezyum (Cs+) iyonları içerdiğini unutmayın.</li>
	<li>Dimetil sülfoksitte (DMSO) (DMSO'nun 10 μL'si 1 mg) amphotericin-B'nin çalışan bir stok çözeltisi hazırlayın. Tam amphotericin tozu eritmek için, sonicate (en az 15 dk) ve girdap çözeltiiyi. NOT: Bu adım genellikle 10 dakikadan az sürer. Amphotericin-B yüksek miktarlarda genellikle tüp mevcut amphotericin-B katı parçacıkların karıştırma ve eksik çözünürlük için daha uzun bir aralıkla sonuçlanan daha fazla DSMO çözücü gerektirir.</li>
	<li>200-500 μg/mL'lik son konsantrasyonu elde etmek için pipet çözeltisindeki (P, Tablo 2)amphotericin-B stok çözeltisini çözün. Bu adım, pipet çözeltisinde amphotericin-B çökeltisi oluşumunun optimum şekilde karıştırılmasını ve önlenmesini sağlamak için adım başına ~30 ila 60 dk'lık yüksek hızlı bir ayarda (8-10/10) geniş sonication ve girdap lama gerektirir. NOT: Amphotericin-B zamanla çökelecektir ve ışığa duyarlıdır. Amphotericin-B içeren çalışan pipet çözeltisi çözünürlüğü kontrol edilir, pipet dolumu öncesinde elle karıştırılır ve karanlıkta tutulur.</li>
	<li>Birden fazla yama elektrotlar, yangın cilalı elektrot ipuçları çekin ve (gerekirse) diş balmumu ile ipuçları kat.</li>
	<li>Bir yama elektrotunun ucunu pipet çözeltisi (çözelti P, Tablo 2)ile amphotericin-B olmadan çözeltiye kısaca dalarak doldurun.</li>
	<li>Elektrot, amphotericin-B içeren aynı pipet çözeltisi ile doldurun.</li>
	<li>Elektrot, yama kelepçeli amplifikatör başlığına bağlı bir tutucuya monte edin.</li>
	<li>Bir mikromanipülatör kullanarak, elektrotun hücre dışı çözeltinin yüzeyinin hemen altına yerleştirin, böylece elektrotun ucu sadece batırılır.</li>
	<li>Voltaj-kelepçe modunda, tutma potansiyelini 0 mV olarak ayarlayın ve ticari amplifikatör üzerindeki pipet ofset kadranı(Malzeme Tablosu)ile akımı 0 pA olarak ayarlayın.</li>
	<li>Ticari satın alma yazılımının Membran Test penceresi/işlevini kullanarak elektrot direncini belirleyin(Malzeme Tablosu). Araçlar>Membran Testi>Play'i veya yazılımdaki kısayol simgesini etkinleştirmek için. Belirlenen elektrot direnci 2 ila 5 MΩ aralığında olmalıdır. NOT: Ticari alım yazılımında sağlanan Membran Testi fonksiyonu veya amplifikatör üzerindeki Mühür Testi seçeneği, voltaj adımlarını tekrar tekrar uygulayarak elektrot direncini izlemek için kullanılabilir.</li>
	<li>Elektrot un mikromanipülatörle seçilmiş bir DSM hücresine doğru ilerlerken elektrot direncini izlemeye devamedin( Şekil 4A). NOT: Canlı bir DSM hücresi olarak kabul edilebilmek için hücrede mil şeklindeuza dönüşlü morfoloji, hücre etrafında iyi tanımlanmış bir hale, keskin kenarlar ve yarı kontrrak (serpantin) görünüm gösterilmelidir.</li>
	<li>Membran Testi fonksiyonu ile ölçülen elektrot direncinde hızlı bir artışla gösterilen elektrot ile hücre yüzeyine dokunduğunda, boru yoluyla elektrot tutucuya hafif hızlı negatif basınç uygulayarak giga-seal oluşturur. Bu da elektrotun ucunda oluşan negatif basınçla sonuçlanır ve hücre zarını elektrot içine çekerek giga-conta oluşumuna yardımcı olan veya elektrot ile plazma zarı arasında çok sıkı bir temas(Şekil 4B).</li>
	<li>Giga-seal formları bir kez, ticari amplifikatör üzerinde hızlı ve yavaş kadranlar ayarlayarak pipet kapasitansını telafi ve Membran Testi işlevini kullanarak giga-seal stabilitesini (sızıntı akımı) izleyin.</li>
	<li>Amphotericin-B'nin pipetten aşağı yayılabilmesi ve plazma zarına eklenmesi için genellikle 30-60 dk süre verin ve öncelikle monovalent katyonlar için seçici olan gözenekleri oluşturan plazma zarına takın. Bu adımda, Membran Testi fonksiyonu ile giga-contasını izlemeye devam edin. Hücre perforasyonu arttıkça, membran testi fonksiyonu ile ölçülen kapasitans geçicilerinin genliği (sırasıyla hiçbir ve etkili hücre perforasyonu gösteren Şekil 4B ile Şekil 4C karşılaştırın) yapar.</li>
	<li>Yama perforasyonu en uygun olduğunda (genellikle 50 MΩ'un altındaki kararlı seri direnciile değerlendirildiğinde), amplifikatördeki hücre kapasitasörü ve seri direnci için kadranları ayarlayarak kapasitans geçicilerini iptal edin. Seri direnç telafisi de şu anda yapılabilir (Şekil 4D).</li>
	<li>Belirtilen protokol tarafından uyarılmış kararlı voltaj-adım indüklenen katyon akımları gözlendikten sonra, süperfüzyon ile test etmek için bir bileşik veya fizyolojik durum uygulayın ve kontrol-, test-durum ve yıkama (mümkünse) için yanıtları kaydetmek ticari satın alma yazılımı.<ol>
<li>-64 veya -74 mV'de DSM hücrelerini tutmayı ve -94'ten +96 veya +106 mV'ye kadar 400 veya 500 ms'lik 10 mV'lik artışlarda voltajı devreye sokup tutma potansiyeline dönmeyi içeren rutin voltaj adım protokolü ile akımları kaydedin. NOT: Membran potansiyel değerleri 14 mV likit bağlantı potansiyeli için ayarlanır (P ve E çözeltileri kullanılarak, Tablo 2). Sıvı bağlantı potansiyeli ticari satın alma yazılımında(Malzeme Tablosu)(Araçlar>Kavşak Potansiyelleri)tıklayarak ve çözelti iyon bileşenlerinin konsantrasyonlarına girilerek elde edilir. Geçerli kayıtları elde etmek için rampa protokolü de kullanılabilir.</li>
		<li>Bir deneme sırasında voltaj protokolünü ön ekleme kontrolü, test koşulu ve yıkama için akımları kaydederken sürekli ~1 dk aralıkta çalıştırın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Veri analizi ve görselleştirme
<ol><li>Dosya>Verileri Aç'ı tıklatarak ve açmak için ilgi çekici dosyaları seçerek kontrol, test durumu ve yıkama için ticari veri analizi yazılımında(Malzeme Tablosu)kayıtlı dosyaları açın. NOT: Analiz için genellikle her durum için üç dosya (her biri tek bir protokol çalışmasına tek bir izleme kümesi içeren) açılır ve analiz edilir. Yanıtlar daha sonra her durum için ortalama bir yanıt elde etmek için ortalama. Veri toplama için kullanılan yazılım, kullanıcı tarafından belirtilen birden çok test çalışmasının otomatik olarak toplanmasını ve alternatif olarak kullanılabilecek tek çıktı dosyası için ortalamasını alma seçeneği içerir.</li>
	<li>Her gerilimde ölçülen akım izi için son 200 ms üzerinden ortalama yanıtı alın; seçilen süre aralığı, gerilim-adım akım aktivasyonunun sabit durum düzeyini yansıtır. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.<ol>
<li>Ticari analiz yazılımında(Malzeme Tablosu)analiz için ilgi çekici bir dosya seçin. NOT: Yazılım, en son alınan dosyayı etkin ekran penceresine yerlemektedir. Açık dosya, voltaj adımı protokolü yle elde edilen bir dizi çakışan iz görüntüler. Varsayılan olarak, etkin pencere içinde dört imleçler (vurgulanan izleme için x ve y değerleri görüntüleniyor) gösterilir.</li>
		<li>400 veya 500 ms gerilim adımının sonunda imleç 2 ve 200 ms aralığında imleç 1'i yerleştirerek analiz aralığını seçin, böylece analiz aralığı 200 ms'dir.</li>
		<li>Analiz>Hızlı Grafik>IV (veya IV kısayol simgesi) (veri oluşturmadan önce istem penceresinde) tıklayarak her voltaj için yanıt alın (veri oluşturmadan önce istem penceresinde y ekseni (Akım) sinyal Bölge seçenekleri için "İmleçler 1..2" ve "Mean" seçilir). I-V grafiğini oluşturmak ve verileri Windows>Sonuçlar'aerişerek görüntülenebilen sonuçlar sütun sayfasına yerleştirmek için Tamam'ı tıklatın.</li>
		<li>4.2.1 - 4.2.3 adımlarını yineleyerek ek dosyaları çözümleyin. İzleri işlerken Sonuçlar sayfasına ek veri eklemek için Analyze>Quick Graph>IV veya IV simgesi kısayolu'nu tıklatın, Değiştir yerine Append'i seçin.</li>
		<li>İlgi alan sütunları seçerek ve kopyalamak için CTRL+C tuşuna basarak verileri elektronik tabloya kopyalayın ve ctrl+V yapıştırın. Sonuçlar çalışma sayfasını ticari analiz yazılımında(Malzeme Tablosu) File>Save As'ıtıklayarak (*.rlt) formatında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her hücre için, her üç koşuliçin de yanıtları, ön ek kontrolü için maksimum voltaj adımının değerine göre normalleştirin (formüle göre: Yanıt/YanıtKontrolü-Max)ve yanıtları gerilim ilişkilerine karşı akım (veya akım yoğunluğu) değerleri olarak grafikleştirin(Şekil 6).<ol>
<li>Çalışma sayfası işlemcisinde, kontrol, test durumu (bu örnekte, 9-phenanthrol) için ortalama yanıtları akım (pA) veya akım yoğunlukları (pA/pF) olarak belirleyin ve her gerilim adımında yıkayın.</li>
		<li>Formülü izleyen ön toplama kontrolü için en yüksek gerilimde (Şekil 6'da+96 mV) elde edilen maksimum kontrol tepkisi ile her koşulun her gerilimi (kontrol, 9-fenantrol ve yıkama) için değerleri böl: Normalleştirilmiş yanıt(x) = Yanıt(x)/ YanıtKontrolü-Max için (x).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Özet analiz için, verileri görselleştirme için grafik programına (örneğin GraphPad Prism) kolayca kopyalanabilecek bir biçimde düzenleyin.</li>
</ol>

Burada açıklanan prosedürler, enzimatik sindirim kullanarak tüm kalınlıkta insan üriner mesane örneklerinden canlı, taze izole DSM hücrelerinin hazırlanmasında ve amfisellerin-B delikli yama-kelepçe yaklaşımını kullanan TRPM4 kanal inhibitörü 9-phenanthrol'a duyarlı tüm hücreli katyon akımlarının kaydedilmesinde yer alan adımları açıklar. Enzimatik prosedür, burada sıralı papain-kollajenaz sindirim yöntemi olarak adlandırılan iki aşamalı ardışık maruziyete dayanır. DSM dokuları ilk olarak papain ve dithiothreitol ile tedavi edilir (bir enzim stabilizatör ajan) nominal Ca2 +-serbest durum altında, düşük Ca varlığında kollajenaz tip II tarafından ikinci adımda takip+. Düşük Ca2 + koşulları altında papain sindirim yürütmek için mantığı düz kas hücrelerinde 1980'lerin sonlarına kadar uzanır. Papain ile hazırlanan taze izole karotis arter düz kas hücreleri uzun bir şekil gösterdi, canlılık gösterdi (Trypan Mavi alımına direnç) ve kontraktil uyaranlara yanıt (yüksek Ca2 + ve histamin)65. Yıllar sonra, bu yöntem DSM hücrelerinin hazırlanmasında uygulandı (bkz. Tablo 1). Kollajenaz tip II seçimi yerine diğer türleri nispeten yüksek proteolitik aktivite ideal DSM dahil olmak üzere düz kas dokuları için uygundur ilgilidir. Gerçekten de, kollajenaz tedavisi tek başına kapsamlı enzim maruziyeti gerektiren tek DSM hücreleri verebilir (≥60 dk)53,54. Kollajenaz aktivitesi Ca2+ bağlıdır ve enzim Ca 2+-serbest koşullar altında inaktif olduğundan, DSM parçalarının optimum enzimatik sindirim Ca2 + 66varlığını gerektirir. Bizim durumumuzda, DS-C içerir 100-200 μM [Ca2+] (Tablo 2). Enzimomatik tedaviden sonra, sindirilmiş DSM parçaları dokulara bağlı herhangi bir enzimi çıkarmak için enzimveya Ca2+ olmadan soğuk DS ile birkaç kez hafifçe yıkanır. Buz gibi DS, DSM hücre bütünlüğünün korunmasına ve kalan papain veya kollajenazın enzimatik aktivitesini sınırlamaya yardımcı olur. Son adımda, enzimle tedavi edilmiş DSM parçalarının yangın cilalı Pasteur pipeti ile tritürasyonu tek bir DSM hücresi salgılar. DSM hücreleri ya hemen yama-kıskaç çalışmaları veya diğer deney türleri için bir kayıt odasına yerleştirilir ya da aynı gün daha sonra kullanılmak üzere DS'de buz üzerinde depolanır (genellikle 8 saat içinde hazırlık, ancak hücreler 24 saate kadar canlı kalır).
Tek DSM hücrelerini başarıyla elde etmek için birçok önemli husus belirledik. Bunlardan ilki insan DSM numune kaynağı kalitesiile ilgilidir. Doku bütünlüğünü en iyi şekilde korumak için açık mesane ameliyatlarından elde edilen DSM örnekleri en kısa sürede buz gibi DS'ye yerleştirilir ve soğuk bir ortamda muhafaza edilir. Özellikle, hastadan cerrahi çıkarma üzerine, mesane örneği hemen ameliyathanede tam olarak hazırlanmış bir yan masaya yerleştirilir. Tüm numunenin brüt muayenesi (genellikle radikal veya basit sistektomi sırasında elde edilir) ve açılış ını takip eder. Görsel incelemeden sonra, numunenin tümörle ilgisi olmayan uzak bir bölgesinden tam kalınlıkta idrar merdiveni numunesi çıkarılır ve hemen soğuk (~4 °C) Diseksiyon Solüsyonu (DS)(Tablo 2)içeren bir bardağa (50 veya 100 mL) yerleştirilir ve kapakla sıkıca kapatılır. Doku hasadının planlı niteliği nedeniyle, hasat yapan ameliyathane personeli ve yardımcı personel, doku çıkarma sırasında ameliyathanede bulunan malzemelerin bulunması için cerrahi vakanın başlangıcında alarma geçirilir. İşleme adımlarının rutin, tekrarlayan doğasıyla birlikte alınan bu önlemler, doku için sıcak iskemi süresini korur - çıkarmadan DS solüsyonu ile soğutulmuş kapta yerleştirilmesine kadar - 5 dakikadan daha az. Konteyner daha sonra soğuk ortamı korumak için bir buzdolabı veya buz üzerine bir soğutucu yerleştirilir ve laboratuvara (buz gibi) taşınır. Numune laboratuvara geldiğinde diseksiyon ve enzimatik dissosilasyon adımları başlar. Enzimatik dissosilasyon sonrasında belirli bir DSM örneğinin yüksek kaliteli DSM hücreleri verip veremeyeceğini tahmin etmek çok zordur, bu nedenle enzimatik dissosilasyon adımlarını devam edeceğiz. Birçok durumda, elektrofizyolojik deneylere paralel olarak grubumuz aynı DSM örneklerinden hazırlanan DSM şeritlerinde izometrik gerilim kayıtları yapmaktadır. İzometrik daralma çalışmaları (yayınlanmamış gözlemimiz) için uygun şeritler sağlayan preparatlardan genellikle yüksek kaliteli DSM hücreleri elde edebileceğimizi bulduk.
İkinci faktör farklı enzim çok variabilities ile ilgilidir. Hem papain hem de kollajenaz tip II için, bir tedarikçiden her yeni bir enzim geldiğinde, doku sindirimi için DS'deki enzim aktivitesinin farklılık gösterebileceğini gözlemledik. Biz, bu nedenle, rutin her yeni lot için enzim konsantrasyonu ve kuluçka aralıkları optimize. Lot değişkenliği katkısını en aza indirmek için, aynı lottan daha büyük miktarlarda sipariş ve enzimlerin 2 mL aliquots stok çözümleri büyük bir toplu yapmak ve kullanıma kadar ~-20 °C onları saklayın. Ancak zamanla dondurulmuş stoklar (2 haftaya kadar depolanır) enzimatik aktivitelerini kaybedebilir. Üçüncü değişken enzim sindirim tedavilerinin sıcaklığı ile ilgilidir. Hem papain hem de kollajenaz enzimatik aktivitelerısı sıcaklık bağımlılığını gösterir. Papain ve kollajenaz tip II normal vücut fizyolojisi67,68kapsayan sıcaklık aralıklarında aktivite sergilemek . Bu nedenle, DSM hücre bütünlüğünü korumak için daha yüksek sıcaklıklardan kaçınarak ~37 °C'de enzim tedavilerini sabit tutmayı hedefliyoruz. Dördüncü göz son derece uygun (mükemmel klasik düz kas özellikleri sergileyen) sağlıksız, aşırı sindirilmiş hücrelere kadar her hazırlık içinde mevcut DSM hücrelerinin kalitesinin değişkenliği ile ilgilidir. Uzun süreli enzim kuluçka aralığı hasarlı hücrelerin yüksek sayıda elde edilmesiiçin ana nedenlerinden biridir. Aşırı enzim tedavileri de iyon kanallarının protein yapılarını bozar, reseptörler, ve taşıyıcılar, olumsuz işlevselliğini etkileyen. Enzimatik olarak elde edilen, taze izole edilmiş hücrelerden elde edilen sonuçların yorumlanması bu hususu göz önünde bulundurmalıdır. Enzim sindirim koşullarının optimizasyonu son derece canlı hücrelerin yüzdesini artırmayı amaçlamaktadır. Mikrodizi analizleri gibi daha fazla sayıda canlı hücreye dayanan deneysel yaklaşımlar, tek hücreli yama-kıskaç elektrofizyolojisi veya Ca2+ görüntüleme gibi daha az hücrede başarıyla gerçekleştirilenlerden daha sağlam optimizasyonlar gerektirir. Yukarıda belirtilen faktörlerin göz önünde bulundurulması, yüksek kaliteli tek DSM hücreleri elde edilmesinde son on yılda araştırma çabalarımıza yol açmıştır.
Delikli yama-kelepçe tekniği çeyrek yüzyılı aşkın bir süredir elektrofizyolojik bir yaklaşımdır. Çeşitli yayınlar teknik hususların ayrıntılarını sağlar69,70,71,72,73. Hücre perforasyonu amphotericin-B, nystatin, gramicidin veya β-escin ile elde edilebilir (bkz.32her birine genel bakış için). Delikli yama-kelepçe kayıtlarının diğer elektrofizyolojik yaklaşımlara göre en büyük avantajı, hücre içi hücre içi ortamın - hücre içi Ca dahil2+ve sinyal molekülleri (örneğin, cAMP, PKA, fosfatlar ve fosfodiesterazlar) - korunur. Bu teknik, bu nedenle, ideal yakın fizyolojik koşullar altında tüm hücreli iyon kanal akımları ve düzenleyici mekanizmaları araştırmak için uygundur. Önemli bir uyarı hücre içi bileşiminin konvansiyonel bütün hücre ve tek kanallı ekscised-patch (iç ve dış-dış) kayıtlar gibi diğer elektrofizyolojik yöntemlerden farklı olarak tam olarak kontrol edilemeyeceğidir. Deneyimlerimize göre, üç faktör rutin olarak amphotericin-B-delikli yama-kelepçe deneylerinin başarılı deneysel sonuçlarına katkıda bulunur. Bunlardan ilki, bir kaydı denemek için seçilen DSM hücresinin kalitesidir. DSM hücreleri, hücre yüzeyinin etrafında iyi tanımlanmış bir hale ile yarı kontraktil (serpantin benzeri), yüksek kontrastlı parlak bir görünüm sergileyen ve kayıt odasının cam dibine sıkıca iliştirilebilen yüksek kontrastlı parlak bir görünüm sergilediklerinde giga-mühür oluşumu ve hücre perforasyonu nispeten kolay gerçekleşir. Başarı için ikinci ve üçüncü faktörler, sırasıyla, kaynak kalitesi ve amphotericin-B solubilization (dimetil sülfoksit / DMSO ve hücre içi pipet çözeltisi) ile ilgilidir. Kaynak ve lot çeşitleri açısından farklı tedarikçiler arasında tutarsızlıklar gözlemledik. Her gün tozdan amphotericin-B stok çözeltisi ve ardından hücre içi pipet çözeltisinde seyreltme yeni bir çözüm hazırlıyoruz. Bu adımlar geniş sonication ve girdap gerektirir. Taze yapılmış amphotericin-B içeren pipet çözeltisi ile başarılı hücre perforasyonu (<50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K mω)="" following="" giga-seal="" formation="" can="" be="" usually="" obtained="" within="" 30="" min.="" the="" concentration="" of="" amphotericin-b="" in="" the="" pipette="" solution="" also="" requires="" optimization="" dependent="" on="" the="" amphotericin-b="" lot="" and="" source.="" under="" our="" experimental="" conditions,="" the="" final="" amphotericin-b="" concentrations="" in="" the="" pipette="" range="" from="" 200="" to="" 500="" µg/ml.="" since="" amphotericin-b="" exhibits="" light="" sensitivity,="" its="" solutions="" need="" to="" be="" kept="" in="" the="" dark.="" using="" the="" amphotericin-b="" perforated="" patch-clamp="" technique,="" our="" group="" recorded="" voltage-step="" induced=""></50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K>+Ca2+ve insan, kobay, fare ve/veya sıçan DSM hücrelerinden seçici olmayan katyon akımları17,21,22,23,29,30,31,35,60. Burada, insan DSM hücrelerinde seçici olmayan katyon akımlarının kaydedilmesi için koşulları açıklıyoruz. 9-Phenanthrol, TRPM4 kanallarının bir engelleyici, dsm uyarılabilirlik kontrolünde bu kanalların rolünü destekleyen gerilim adım indüklenen akımlar zayıflatılmış. Bir not olarak, genellikle en az 45 dakika bir giga-mühür elde ettikten sonra ve optimum kararlı voltaj adım non-selektif katyon akımları indüklenen kayıt perforasyon başlatılması gerektirir. Voltaj rampaları voltaj-adım protokollerine alternatif olarak da kullanılabilir30,64. Burada, eski yaklaşım voltaj bağımlı inaktivasyon etkisini en aza indirir ve bir süre boyunca uyarılmış akımın ortalama sağlar, çünkü bir hiperpolarize tutma membran potansiyelinden bir voltaj-adım protokolü bir rampa protokolü yerine tercih edildi rampa nın gerilim başına tek bir veri noktası sağladığı bir gerilim-adım. İkinci nokta özellikle insan DSM hücreleri için geçerlidir, zira akımlar gerilim adımları sırasında değişken aktivite gösterirler (Şekil 5VeŞekil 6). Amphotericin-B delikli yama-kelepçe tekniği DSM hücrelerinin ve diğer hücre türlerinin özelliklerini belirlemede gerekli olmuştur ve gelecekte yeni keşifler sağlamada yardımcı olmaya devam edecektir. Ayrıca, taze izole tek DSM hücreleri başarıyla tüm hücreli K ölçmek için kullanılabilir+Cl-ve Ca2+yama-kelepçe tekniğinin konvansiyonel moduna sahip akımlar, mevcut kelepçe ile membran potansiyel kaydı ve önceki raporlarımıztarafından örneklenen tek kanallı kayıtlar23,29,35,64.
Tek hücreli yama-kıskaç yöntemlerine ek olarak, taze izole DSM hücreleri Ca2 + görüntüleme, RT-PCR/q-RT-PCR, immünositokimya, yerinde yakınlık ligasyon testleri ve genomik yaklaşımlar (örneğin, mikrodizim, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34dahil olmak üzere diğer teknik yaklaşımlar ile incelenebilir . Tek hücreli transkripsiyon belirleme yöntemleri gelişmeye ve son derece hassas olmaya devam ettikçe, bireysel DSM hücrelerinin elektriksel veya farmakolojik özelliklerini transkripsiyon/proteom profilleriile rutin ve özel olarak birbirine bağlama yı öngörüyoruz. Bu, önce bir DSM hücresinden kaydedilmesi ve ardından mRNA veya protein alınması ve ardından transkripsiyonel/proteomik analizler ile elde edilecektir. Bu tür yöntemler zaten DSM olmayan hücrelerde test edilmiş olmasına rağmen, şu anda teknik olarak zorlu, rutin olarak kabul edilecek duyarlılık eksikliği, ve birkaç seçilmiş gen ürünleri başarılı tespiti ile sınırlıdır74. Kontrol ve hastalıklı hasta donörlerinden elde edilen idrar kesesi hücrelerinde yapılan fonksiyon-moleküler profil ekspresyonu, normal DSM fonksiyonlarını, patogenezi ve etkili yeni tedavi yaklaşımlarını belirlemek için gerekli fizyolojik süreçlere dair öngörüler sağlayacaktır.

Detrusor düz kas (DSM) hücreleri idrar kesesi en bol hücre tipini oluşturur ve sonuçta idrar depolama ve gevşeme ve daralma yoluyla boşluk kontrolü, sırasıyla. DSM hücreleri bitişik bağ dokusu, sinir süreçleri, interstisyel hücreler ve diğer hücre tipleri1ile iç içe düz kas demetleri oluşturur. DSM hücrelerinin idrar kesesi fonksiyonundaki rolünün güncel anlaşılması çok düzeyli entegre bir yaklaşımla sağlanmıştır. Her deneysel yöntem - ister vitro izole tek hücreler, in vitro /ex vivo düz kas demetleri içeren doku şeritleri, ya da in vivo tayini (sitometri ve voiding fonksiyon değerlendirmeleri gibi) - DSM fizyolojik ve farmakolojik özellikleri içine önemli ve özel anlayışlar sağlar (ayrıntılar için değerlendirmeler1,2,3,4,5,6 bakınız). Ancak, izole tek hücrelerden elde edilen sonuçların yorumlanması, sonuçların özellikle tek hücre tipinin kendisine atfedilmesine olanak tanır. Bu gerçekleşme tüm kalınlıkta idrar kesesi örnekleri taze izole DSM hücreleri elde etmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmak için itici güç olmuştur. Diğer birçok hücre tipinin aksine, düz kas hücreleri elektrofizyolojik ve kontraktil özellikleri nde belirli değişiklikler de dahil olmak üzere kendi yerli fenotip kaybı nedeniyle güvenilir kültürlü olamaz7,8. Bu durum fizyolojik olarak aktif olan taze izole DSM hücreleri üzerinde yapılan çalışmaların önemini daha da güçlendirmektedir.
1980'lerin sonlarında ve 1990'ların başında, Isenberg grubu (Almanya) kobay idrar kesesi9,10,11,12,13 (Tablo 1)elde edilen taze izole DSM hücreleri üzerinde elektrofizyolojik çalışmalar bir dizi yayınladı. Yöntem, hayati hücrelerin elde edilmesine yardımcı olan ve diğerlerinin izlemesi için bir başlangıç kılavuzu olarak hizmet eden iki önemli gözlemin altını çizdi. Onlar 1) enzimajen tedavi öncesi Ca2 +-serbest çözelti / orta ve 2) kollajenaz içeren bir çözüm ile doku sindirimi ile izole DSM adet ön tedavi edildi. Bu iki kritik adım, DSM hücre dissosiyasyon yordamlarının sonraki tüm türevlerine dahil edilmiştir(Tablo 1). Şu anda, grubumuz iki aşamalı sıralı papain-kollajenaz dissociation yaklaşım kullanır. DSM parçaları önce papain içeren bir enzim çözeltisi ile, daha sonra kollajenaz tip II ile aynı çözeltide (DS, diseksiyon/sindirim çözeltisi) çözünür şekilde tedavi edilir. Bu yaklaşım, kobay, domuz, sıçan, fare ve daha da önemlisi insan dahil olmak üzere çeşitli türlerden tek DSM hücreleri verir(Tablo 1).
Tek DSM hücreleri birden fazla moleküler biyoloji ve fizyolojik deneyler için bir kaynak sağlar. Şimdiye kadar immünositokimya ile çalışılan protein ve mRNA ekspresyonu, veya RT-PCR/qRT-PCR tayinleri, büyük iletkenlik gerilimi ve Ca2+-aktif (BK), küçük iletkenlik Ca2+-aktif K+ tip 3 (SK 33), voltaj kapılı K+ (Kv),L tipi voltaj kapılı Ca2+ (Cav),ve geçici reseptör potansiyeli melastatin tip 4 (TRPM4) kanallarının yanı sıra Na/Ca2+ değiştirici 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Hepsinin DSM uyarılabilirliğini, hücre içi Ca2+ seviyelerini ve kontraktiliteyi kontrol ettikleri düşünülmektedir. Yama-kelepçe elektrofizyolojik yaklaşımlar, doğrudan kobay, fare, sıçan veya insan DSM hücreleri üzerinde gerçekleştirilen, L-tipi Cavbiyofiziksel ve farmakolojik özellikleri doğrudan gösteri sağlanan , Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK, ve TRPM4 kanalları17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. Yaklaşımlar arasında konvansiyonel bir bütün hücre voltaj-kelepçesi, delikli voltaj-kelepçe ve tek kanallı kayıtlar (hücre bağlı, iç-dış ve dış-dış konfigürasyonlar) yer aldı. Buna ek olarak, dsm'nin akım kelepçesi kullanılarak membran potansiyeli kaydı, hedef le ilgili farmakolojik ajanların hücre uyarılabilirliğini değiştirdiğine dair kanıtlar sağlamıştır. Örneğin, TRPM4 inhibitörü 9-phenanthrol dsm hücrelerinde hiperpolarizasyon indüklenen insanlar, kobay, ve sıçan idrar kesesi19,20,22,31. Çeşitli elektrofizyolojik yöntemler arasında, amphotericin-B (ve nystatin, gramicidin ve β-escin) delikli yama-kelepçe kayıtları içsel hücre içi sinyal molekülleri ve yollarını koruyarak önemli bir avantaj sağlar. Sadece düşük molekül ağırlıklı katyonlar ve daha az ölçüde, Cl- ama protein veya Ca2 + dahil sinyal molekülleri - amfiericin-B veya nystatin32tarafından oluşturulan plazma membran gözenekleri ile geçirgen . Delikli yama-kıskaç deneylerinin başarılı sonucu, bu tekniğe özgü birçok genel değişkene bağlıdır. Burada grubumuzun15,22,33,34,35,36,37,38,39yıllarında başarıyla kullandığı amphotericin-B kullanan prosedürün ayrıntılarını açıklıyoruz.
Tartışmasız, non-selektif katyon kanalları DSM hücrelerinde en az anlaşılan kanal türlerinden biri olmaya devam etmektedir. Seçici olmayan katyon benzeri bir kanalın ilk raporu 1993 yılına dayanıyor. Wellner ve Isenberg11 tarafından kağıt iyon geçirgenlik aşağıdaki rütbe sırasını gösteren bir 33 pS streç-aktive tek kanal: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+ve Gd3 +tarafından kanal aktivitesinin inhibisyonu , non-selektif katyon kanallarının genel bir inhibitörü. Neredeyse on yıl sonra, Thorneloe ve Nelson40 fare DSM hücrelerinde Na+ geçirgen katyon akımları açıklanan, Gd tarafından inhibe3 +, bütün hücre kayıtları kullanarak. Seçici olmayan katyon kanallarının moleküler kimlikleri ve biyofiziksel karakterizasyonları belirlenmeye devam ettiği için, bu araştırma alanında ileride yapılacak araştırmalar alabı gerekmektedir. Non-selektif katyon kanalı akımlarının kaydı için burada açıklanan protokol - cs+ ,TEA+içeren hücre dışı ve pipet intrasellüler solüsyon lar kullanılarak ve nifedipin(Tablo 2) bu fizyolojik ve farmakolojik olarak Kv ve Cav akımları azaltmak - non-selektif katyon kanallarının elektrofizyolojik araştırmalarda yararlı olmuştur ve olmaya devam edecektir. Biz kobay, sıçan ve insan DSM hücrelerinde TRPM4 kanal bloker 9-phenanthrol tarafından tüm hücre katyon akımlarının inhibisyonu ölçüde belirlemek için bu özel protokolü kullandık19,20,22.
Birlikte ele alındığında, insan idrar kesesi taze izole tek DSM hücreleri elde etmek için burada açıklanan yöntem yama-kelepçe tekniği, Ca2 +görüntüleme, immünositokimya, yerinde proksimal dava tahlil ve tek hücreli RT-PCR/qRT-PCR yanı sıra mikrodizi analizi, RNA-seq, ve CHIPQ-se-se-se-se-se-se-se-se-siq çeşitli yapılandırmaları kullanarak elektrofizyolojik araştırmalar için son derece uygun canlı hücreler sağlar. Amphotericin-B delikli yama-kelepçe yönteminin kullanımı diğer konfigürasyonlardan farklı olarak yerel hücre ortamını korur. Burada özetlenen özel koşullar kullanılarak, DSM hücrelerindeki K+ ve Ca2+ akımlarının katkılarını inkâr etmek üzere tasarlanan voltaj-adım indüklenen akımlar, biyofiziksel ve farmakolojik karakterizasyonlara uygun seçici olmayan katyon akımlarının özelliklerini gösterir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td>Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-Phenanthrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>211281</td>
			<td>TRPM4 channel inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP928-250</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>European Pharmacopoeia Reference Standards</td>
			<td>5</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin-B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-100MG</td>
			<td>Used for patch/cell perforation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9006</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Extracellular solution and DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-7.5</td>
			<td>Capillary for preparation of pulled patch electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8518</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>pCLAMP-10</td>
			<td>Commerical software and part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004177</td>
			<td>DS-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203025</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Miltex Dental Wax Technologies, Inc.</td>
			<td>18058351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer with Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-077-32</td>
			<td>Placed in tissue bath to monitor temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DDT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Reducing agents used together with Papain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Required to pull electrodes with very fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating foam tube rack/holder</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82017-634</td>
			<td>Used for holding tubes with enzymes for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid (Na salt)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>DS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>pH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Data Acquisition System</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-442-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroForge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Used for fire-polishing electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Extracellular and intracellular solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7634</td>
			<td>L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of Patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-metalic syringe needle, MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF-34G-5</td>
			<td>Filling of intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>DS-P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td>
			<td>Axon Axopatch 200B</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC computer</td>
			<td>DELL</td>
			<td>Custom configuration</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Aspera Instruments</td>
			<td>PH700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427-436</td>
			<td>Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue bath, 100 mL</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>1583-101</td>
			<td>Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl tubing</td>
			<td>ColePalmer</td>
			<td>06405-3</td>
			<td>Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulator bath, Haake D1 L</td>
			<td>Haake</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Connected to tissue bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Part of patch-clamp rig setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and utilization of freshly isolated human detrusor smooth muscle cells for characterization of 9-phenanthrol-sensitive cation currents

İdrar kesesi duvarı içinde bulunan detrusor düz kas (DSM) hücreleri sonuçta idrar depolama ve voiding kolaylaştırmak. Canlı, taze ve izole Edilmiş DSM hücrelerinin hazırlanması, başarıları sonraki fonksiyonel ve moleküler çalışmalar için en uygun hücreleri sağlayan önemli bir teknik zorluk sunar. Burada geliştirilen ve özenle hazırlanmış ve on yılı aşkın bir süredir grubumuz tarafından başarıyla kullanılan yöntem, açık mesane ameliyatlarından elde edilen insan idrar kesesi örneklerinin diseksiyonunu, ardından DSM parçalarının enzimatik iki aşamalı tedavisini ve taze izole Edilmiş DSM hücrelerini elde etmek için mekanik triturasyonunu tanımlar. İlk adım diseksiyon mukoza (ürotelyum, lamina propria ve muscularis mukoza) ve komşu bağ, vasküler ve yağ dokuları mevcut dism asyon içerir . DSM daha sonra nominal Ca2+içeren diseksiyon/sindirim çözeltisi (DS) parçalara (2-3 mm x 4-6 mm) kesilir. DSM parçaları daha sonra adım başına 30-45 dakika boyunca ~37 °C'de papain ve kollajenaz içeren DS ile ayrı ayrı aktarılır ve sırayla işlem göredir. Enzimsiz büyükbaş hayvan serumu içeren DS ile yapılan yıkamalar ve ateşcilli pipetle tritürasyon sonrasında parçalar tek DSM hücreleri salgılar. Yeni izole Edilmiş DSM hücreleri iyon kanallarının yama-kelepçe elektrofizyolojik ve farmakolojik karakterizasyonu için idealdir. Özellikle, TRPM4 kanal bloker 9-phenanthrol amphotericin-B delikli yama-kelepçe yaklaşımı ile kaydedilen voltaj adım uyarılmış katyon akımları azaltır göstermektedir. DSM hücreleri tek hücreli RT-PCR, mikrodizi analizi, immünostokimya, yerinde yakınlık ligasyon tahlil ve Ca2+ görüntüleme gibi diğer tekniklerle de incelenebilir. Tek DSM hücrelerinin kullanılmasının en büyük avantajı yapılan gözlemlerin ortaya çıkan tek hücre özellikleriyle doğrudan ilişkili olmasıdır. Taze izole edilmiş insan DSM hücrelerinin çalışmaları, idrar kesesinde katyon geçirgenliği de dahil olmak üzere çeşitli iyon kanallarının özelliklerini karakterize eden önemli bilgiler sağlamıştır ve DSM hücresel özelliklerinin ve düzenleyici mekanizmaların aydınlatIlmesinde altın bir standart olarak devam edecektir.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents at JoVE.com

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

Biz iki adım lı enzimatik prosedür istihdam insan idrar kesesi örnekleri tek taze izole detrusor düz kas hücrelerinin hazırlanması için bir yöntem açıklar. Elde edilen canlı DSM hücreleri fizyolojik ve farmakolojik özellikleri ortaya çıkarmak için açıklanan amphotericin-B patch-clamp elektrofizyolojisi de dahil olmak üzere çeşitli tek hücre teknikleri ile incelenebilir.

9-Fenanthrol Duyarlı Katyon Akımlarının Karakterizasyonu İçin Yeni İzole Edilmiş İnsan Detrusor Düz Kas Hücrelerinin Hazırlanması ve Kullanımı

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...

Detrusor düz kas hücreleri sonuçta idrar voiding ve depolama kolaylaştırır idrar mesane duvarı oluşturur. Protokolümüz tek düz kas hücrelerinin taze izolasyon için doğrulanmış ve güvenilir bir yöntem sağlar. Taze izole insan detrusor düz kas hücreleri tek hücre düzeyinde elektrofizyolojik ve moleküler incelemeler için bir fırsat sağlar.Tek detrusor düz kas hücrelerini kontrol, normal ve hastalıklı insan idrar kesesi lerden inceleyerek, iyon kanalları gibi farmakolojik hedefleri doğrulama fırsatına sahibiz. Tek insan detrusor düz kas hücreleri yama-kelepçe elektrofizyolojisi gibi elektrofizyolojik deneyler için idealdir. Burada, nonselektif katyon kanalı olan geçici reseptör potansiyeli melastatin dört kanal olan TRPM4 adlı tek bir iyon kanalının incelenmesine bir örnek sunacağız.Acemiler, taze izole DSM hücreleri elde etmek için kritik önemli adımları tanımak da dahil olmak üzere verimlilik ve aşinalık gerektiren diseksiyon ve enzimatik tedavi adımları ile mücadele edebilir. Bu insan mesane histolojisi aşina olmak önemlidir, tek hücreleri izole etmek için protokol adımları esnek kalır, ve başlangıçta bu protokolü kullanarak suboptimal hücreleri almak için bekliyoruz. Tüm kalınlıkidrar kesesi numunesi inceleyerek başlayın.Numuneyi, mukozayı yukarı bakacak şekilde sabitleyip, buz gibi soğuk DS ile doldurulmuş silikon enantiomer kaplı 150 mm yuvarlak tabağa sabitleyip keskin bir diseksiyon la tüm mukozayı dikkatlice çıkarın. Birkaç mukozasız detrusor düz kas veya DSM parçaları kesip. Papain ve dithiothreitol veya DS-P içeren önceden ısıtılmış DS bir ila iki mililitre ile bir tüp içine üç ila altı DSM adet yerleştirin.37 derecede 30-45 dakika kuluçkaya yatarak tüpü 10-15 dakikada bir sallayın. Kuluçkadan sonra DS-P'yi tüpten çıkarın ve DSM parçalarını kısa bir süre buz gibi DS ile yıkayın. DSM parçalarıyla DSM'yi yeni bir tüpe aktarın ve DSM parçalarını tüpün alt kısmında bırakarak DSM'yi çıkarın. Tüpe kollajenaz tip II veya DS-C içeren bir ila iki mililitre DS ekleyin.Ve 37 derecede, ara sıra sallayarak kuluçkaya yat. DS-C'yi atın ve enzimle tedavi edilen DSM parçalarını buz gibi ds ile 5-10 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra DS'yi tüpün içine bırakın ve tek DSM hücrelerini serbest bırakmak için parçaları ateşte cilalı Pasteur pipetiyle hafifçe triturate edin. Pipet 0.25 ila bir mililitre hücre süspansiyonu ters bir mikroskop un sahne üzerinde oturan cam bir alt hazneüzerine ve hücrelerin yapışmasını sağlamak için en az 45 dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra, banyodan DS'yi çıkarın ve süper füzyon yoluyla E çözeltisi ile değiştirin. Birden fazla yama elektrotları çekin, elektrot ipuçlarını ateş cilalayın ve gerekirse diş balmumu ipuçlarını katlayın. Çözeltideki elektrotun üzerine kısa bir süre daldırarak, bir yama elektrotucunu amphotericin-B olmadan pipet çözeltisi ile doldurun.Yama kıskaç elektrofizyolojisinin başarısı DSM hücre kalitesine ve amphotericin-B solubilizasyonuna bağlıdır. Elektrot, amfisericin-B içeren aynı pipet çözeltisi ile doldurun ve elektrotun bir yama kelepçesi amplifikatör baş aşamasına bağlı bir tutucuüzerine monte edin. Elektrotun uç kısmı sadece batırılmış böylece ekstrasellüler çözelti yüzeyinin hemen altına elektrot yerleştirmek için bir mikromanipülatör kullanın.Daha sonra, ticari satın alma yazılımının membran test penceresi işlevini kullanarak elektrot direncini belirleyin ve elektrotun ilgi hücresine doğru ilerletin. Elektrot ile hücre yüzeyine dokunduğumda, boru ile elektrota hafif hızlı negatif basınç uygulayarak giga-seal oluşturur. Bu, elektrotun ucundaki negatif basınçla sonuçlanır ve membran testi ile doğrulanan başarılı bir giga-seal elde eve gelir.Amphotericin-B'nin pipetten aşağı yayılması ve plazma zarına sokulması için 30 ila 60 dakika bekleyin, öncelikle monovalent katyonlar için seçici gözenekleri oluşturan. Membran test fonksiyonu ile giga-contasını izlemeye devam edin. Yama perforasyonu en uygun olduğunda, amplifikatördeki hücre kapasitansve seri direnci için kadranları ayarlayarak kapasitans geçicilerini iptal edin.Kararlı voltaj-adım katyon akımları gözlendikten sonra, el yazmasında açıklandığı gibi yönlendirme gerilim-adım protokolü ile akımları kaydedin. Bir bileşik veya fizyolojik test koşulu superfusion tarafından test etmek ve kontrol ve test koşulları yanı sıra yıkama için yanıtları kaydedin uygulayın. Bu protokol fonksiyonel ve moleküler çalışmalar için sağlıklı, taze DSM hücrelerini izole etmek için kullanılabilir.Sağlıklı tek DSM hücreleri mil şekilli morfolojisi, keskin iyi tanımlanmış kenarlar, hücre etrafında iyi tanımlanmış bir hale ve mikroskop altında bakıldığında yarı kontraktil görünüm ile karakterizedir. Ayrıca, taze izole DSM hücreleri mekanik stimülasyon ve karbachol yanıt. Sonraki yama-kıskaç deneylerinde hücre parçaları ve canlı olmayan veya aşırı sindirilmiş hücrelerden kaçınılmalıdır.İzole hücreler amhotericin-B delikli yama-kıskaç deneylerinde tüm hücre akımlarının üç farklı insan DSM hücresinde gerilim adımı veya rampa protokolü ile ölçüldüğü deneylerde kullanılmıştır. Deneyler 9-phenanthrol, bir TRPM4 kanal inhibitörü, etkili ve geri insan DSM katyon akımları inhibe ortaya koymuştur. 9-fenanthrol duyarlı akım bileşeni pozitif voltaj ve dışa doğru düzeltme güçlü bir inhibisyon göstermektedir.Enzimomatik tedavi adımları, adımlar 2.2 ve 2.3, sıcaklık, enzim tedavileri süresi, enzim lot kaynakları ve DSM hücrelerinin kalitesi de dahil olmak üzere, yüksek kaliteli insan DSM hücreleri elde etmek için önemli belirleyicileri vardır. İnsan DSM hücreleri de ideal kalsiyum ve siklik AMP de dahil olmak üzere hücre içi ikinci haberci düzeylerini değerlendirmek için uygundur, immünositokimya ile protein ifadeleri tespit, ve ko-ifade in situ proksimal dava tsay, ve RT-PCR tarafından mRNA ifade, qRT-PCR, mikrodiziler, ve yeni nesil sıralama. İnsan DSM hücreleri idrar kesesi BK, kalsiyum, TRPM4 kanallarının rollerini anlayışımızı ilerlettir.Gelecekteki gelişmeler özellikle elektrofizyolojik veya farmakolojik özellikleri transkripsiyon veya proteom profilleri ile bağlantı sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Odak Ca 2 +</supDüz kas> Geçici Algılama

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

İnsan Umblikal Arter düz kas hücrelerinin izolasyonu (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter Düz Kas Hücre İzolasyonu

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption: Glioblastoma Kök Hücreleri için İzole İnsan MSC kondriyayı aktarma

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...