Name: kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00
Duration: 13 min 22 s
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作者要感谢 LaBaer 实验室的每个人在项目开发过程中的帮助和批评。该项目得到了NIH赠款U01CA117374、U01AI0777883和弗吉尼亚G.Piper基金会的支持。

1. 常用缓冲器和解决方案
<ol><li>制备TB培养基：特碎的汤（24克/升酵母提取物;20克/升胰蛋白石;4 mL/L甘油;0.017 M KH2PO4;和0.072 M K2HPO4）。0.017 M KH2PO4和 0.072 M K2HPO4解决方案可作为 10 倍磷酸盐缓冲液（0.17 M KH2PO4和 0.72 M K2HPO4） 购买。</li>
	<li>制备LB介质：卢里亚-贝尔塔尼（5克酵母提取物;10克/升锥酮;和10克/升纳Cl）。使用 5 M NaOH 将 pH 调整到 7.0。</li>
	<li>准备 1x TBS： 三层缓冲盐水 （TBS： 50 mM Tris-Cl， pH = 7.5; 150 mM NaCl）。</li>
	<li>准备 1x TBST： TBS 辅以 0.1% 补间 20.</li>
</ol>2. DNA制备
注：用于NAPPA阵列的DNA必须高度纯净;因此，不推荐使用商业DNA小预准备。目前，使用两种DNA制备协议：内部高通量微型制备（此处描述）或商业Midi-或Maxi-prep。内部小型准备协议的平均吞吐量为每人每天 1，500 个样本。
<ol><li>内部高通量小型制备的细菌生长
	<ol>
<li>准备LB/Agar全板。将 30–40 mL 的 LB 琼脂（LB 培养基中 1.5% 的细菌琼脂辅以抗生素选择阳性克隆）倒入每个孔板中。</li>
		<li>现货甘油库存在LB/琼脂板上。在 LB 介质中稀释甘油库存（1：300，通常在 600 μL 的 LB 中为 2 μL）。摇动10分钟。 将稀释的库存的Spot 3 μL摇到LB/agar板上。在 37°C 下孵育，倒置，过夜。</li>
		<li>接种文化。使用在80%乙醇和火焰中灭菌的96针装置，在深井块中接种琼脂板的培养物，每孔1.5 mL，并辅以抗生素。</li>
		<li>孵化文化。用透气密封覆盖块，在 37°C、300–800 rpm 下孵育 22-24 小时，具体取决于摇床。 注：设置为 800 rpm 的摇床是这种孵育的最佳选择。使用速度较慢的摇床可能会导致培养物密度降低，DNA纯化产量降低。</li>
		<li>球菌文化。在3，800 x g和4°C下旋转方块30分钟。丢弃上清液。</li>
	</ol></li>
	<li>内部高通量小型准备 注：多通道移液器或自动分配器可用于执行内部高通量小型准备。如果使用自动分配器，请确保在使用前和解决方案之间清洁系统。<ol><li>准备小型准备期间使用的所有解决方案：<ol>
<li>制备溶液1：TE重悬浮缓冲液（50 mM Tris，pH = 8.0;10 mM EDTA，pH = 8.0;0.1毫克/mLRNA酶）。储存在4°C。</li>
			<li>准备解决方案 2：NaOH/SDS 解液缓冲器（0.2 M NaOH;1% SDS）。为了获得更好的结果，应使用新制作的解决方案。</li>
			<li>准备解决方案 3：KOAC 中和缓冲器 （2.8 M KOAc）。使用冰川醋酸将溶液的pH量调整到5.1。储存在4°C。</li>
			<li>制备溶液N2：平衡缓冲液（100 mM Tris;900 mM KCl;15%EtOH;0.15%Triton X-100）。用磷酸将溶液的pH量调节到6.3。</li>
			<li>制备溶液N3：巴什缓冲液（100 mM Tris;1.15 M KCl;15%EtOH）。用磷酸将溶液的pH量调节到6.3。</li>
			<li>制备溶液N5：洗脱缓冲液（100 mM Tris;1 M KCl;15%EtOH）。用磷酸将溶液的pH量调节到8.5。 注：在阴极交换期间成功控制DNA结合、洗涤和洗脱高度依赖于缓冲KCl浓度和pH值。仔细的缓冲元件测量和 pH 调整至关重要。与所述测量值的微小偏差可能会导致产量的显著损失。</li>
		</ol>
</li>
		<li>重新悬浮颗粒。加入200 μL溶液1，在2000rpm下在RT下摇动5分钟。如有必要，涡旋块。</li>
		<li>莱塞细菌。加入200 μL溶液2，用铝密封密封板并倒置5倍。仔细时间此步骤从解决方案 2 的开头添加。不要超过 5 分钟。</li>
		<li>中和解决方案。加入200 μL溶液3，用铝密封密封板并倒置5倍。由于分解/中和缓冲液，密封件可能会松动，因此在反转时应小心谨慎。建议采用局部反转（其中溶液从不接触密封件）以防止样品之间的交叉污染。</li>
		<li>清除莱沙。在 3，800 x g和 4 °C 下离心板 30 分钟。</li>
		<li>在赖糖颗粒离心步骤期间制备联尼气交换树脂浆料。使用 1 L 瓶，将其填充到 iion 交换树脂中，直到达到 300 mL 标记，然后添加高达 900 mL 的溶液 N2。 注意：此步骤应在发动机罩中执行，以防止吸入二氧化硅。</li>
		<li>准备网换树脂板。将过滤板堆叠在深井块的顶部，作为废物收集容器。混合网倾浆，直到它均匀，然后倒入玻璃槽。使用宽孔 P1000 吸头，将 450 μL 的浆料转移到过滤板的每个孔中。</li>
		<li>离心机堆叠板（树脂板/深井板）在 130 x g和 RT 下缓慢加速 5 分钟。丢弃流过。</li>
		<li>将液前液转移到树脂板/深井块堆栈。以缓慢加速的速度在 30 x g下旋转堆叠板 5 分钟。</li>
		<li>洗涤柱。在每个井中加入400 μL溶液N3（洗涤缓冲液）。将树脂板转移到真空歧管以去除洗涤缓冲液。重复洗涤步骤 3 倍。在最后一次清洗时，确保所有水井都正确清空。以 150 x g旋转堆叠板 5 分钟，以清除任何残余缓冲液。</li>
		<li>埃鲁特DNA将树脂板放在干净的 800 μL 收集板上。在每个井中加入300 μL溶液N5。让它在 RT 处坐 10 分钟，然后在 20 x g下以缓慢的加速速度旋转堆叠板 5 分钟。在 233 x g下旋转堆叠板 1 分钟。</li>
		<li>在-20°C下定量DNA和储存板，直到进一步使用或直接进入DNA沉淀。 注：每个样品至少需要30μg的DNA。如果DNA产量低，建议重复DNA小准备，或在沉淀步骤期间组合两个板（第2.3节）。</li>
	</ol></li>
	<li>DNA沉淀
	<ol>
<li>解冻板，涡旋使DNA溶液均质化，以230 x g旋转30s，收集井底的所有溶液。</li>
		<li>在每个井中加入40μL的3M NaOAc和240μL异丙醇。用铝制密封件盖住板，然后倒置 3 倍进行混合。</li>
		<li>在 3，800 x g和 25 °C 下将板离心 30 分钟。小心地丢弃上清液。 注：要组合两个板，请将DNA从第二板转移到第一个板的颗粒中，并重复步骤2.3.2~2.3.3。</li>
		<li>清洗和沉淀DNA。在每个井中加入400 μL的80%乙醇。带铝密封的密封板，在 1，000 rpm 下摇动 30 分钟，在 3，800 x g下离心 30 分钟，在 25°C 下摇动 30 分钟。丢弃上清液。</li>
		<li>干燥DNA颗粒。将盘子倒置放在纸巾上，让它们干燥 1⁄2 小时，直到井底没有酒精。以 230 x g密封和离心机 2 分钟，使任何颗粒下降。</li>
		<li>一旦板干燥，用铝密封密封，并在-20°C冷冻，以供以后使用或继续重新悬浮DNA（步骤4.1）。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 阿米尼西兰滑动涂层
<ol><li>将玻璃玻片放在金属架上。目视检查每张幻灯片，确保不存在划痕或瑕疵。</li>
	<li>在涂层溶液中浸没滑动（丙酮中的2%氨基硅烷试剂）在摇动时浸泡15分钟。氨基硅烷溶液可用于在需要丢弃之前覆盖两个机架，每个机架有 30 张幻灯片。</li>
	<li>冲洗步骤。将滑架浸入丙酮洗涤（99%丙酮），来回摇动，然后快速上下 5 倍。倾斜到一个角落滴落，然后淹没在超纯水上下快速5倍。倾斜以滴落，然后放在餐巾上。 注：丙酮洗涤可使用两次，而超纯水每次必须更换。</li>
	<li>使用压力空气干燥滑轨，从各个角度吹上它们约 3 分钟，直到所有水滴都已清除。将涂层滑轨存放在金属机架中的金属机架中，内装有密封的盒子。</li>
</ol>4. 阵列样品制备
<ol><li>将内部迷你准备（步骤 2.3.6）中的 DNA 颗粒重新悬浮在 20 μL 的超纯水中，并在 1，000 rpm 下摇动 2 小时。对于 midi/max 制备 DNA，将每个样品稀释至 1.5 μg/μL 的最终浓度，并将 20 μL 转移到 800 μL 收集板。</li>
	<li>准备打印组合。对于一个96孔板，准备1mL的印刷混合物[237.5μL的超纯水;500μL的多赖氨酸（0.01%）;187.5μL的BS3（二氧化硫，50毫克/mL在DMSO）;和75μL的多克隆抗旗兔抗体]。 注：应按指定顺序添加化学品，以避免降水。</li>
	<li>在每个样品中加入 10 μL 的打印混合物，用铝箔密封板，并在 1，000 rpm 转速下在 RT 下摇动 90 分钟。将盘子在4°C下过夜（±16小时）。</li>
	<li>在打印当天，短暂地旋转和旋转印子。将每个样品的 28 μL 转移到 384 阵列板。这种传输可以使用自动化或多通道移液器完成。跟踪 384 阵列板中样品的位置至关重要。</li>
	<li>将板向下旋转，以去除任何气泡。用铝箔密封板。</li>
</ol>5. 国家适应行动方案阵列的生成：微阵列打印
注：所有打印条件均针对设备和材料表中列出的仪器进行了优化。如果使用其他数组，则可能需要进一步优化。
<ol><li>阵列清理。启动前，根据需要，清空所有废物罐，并加注超纯水或 80% 乙醇。用无绒湿巾和超纯水逐一清洁针脚。用无绒湿巾擦干针脚，并小心地将它们放回阵列头。</li>
	<li>阵列设置：印刷规格[每印油墨最多邮票数量：1;每点邮票数量：1;多枚邮票时间：--;印迹时间（毫秒）：0毫秒;墨迹书写时间（毫秒）：0毫秒;打印深度调整：90微米;接触次数：0。然后，按照灭菌方案：超纯水洗2000ms，干燥时间为0ms，等待时间500ms;重复这些步骤 6 倍;其次是用80%乙醇清洗2000ms，干燥时间1200ms，等待时间500毫秒;重复这些步骤 6 倍。</li>
	<li>幻灯片设计：使用所需的阵列模式设置阵列器。设计应考虑几个因素[即每个示例的副本数、控制功能的位置和数量、数组布局（一个块、几个相同的块）、要打印的数组数、运行长度等]。</li>
	<li>将氨基硅烷涂层滑轨（步骤 3.4）放在阵列甲板上。检查真空是否牢固地将所有滑轨固定到位。启动加湿器（应设置为 60%）。</li>
	<li>将 384 孔板放在阵列甲板上。启动程序。</li>
	<li>为微阵列添加标签。打印完成后，将幻灯片标签放在每张幻灯片的底部（非打印）侧。按数字顺序维护幻灯片打印顺序。</li>
	<li>将打印的阵列存储在 RT 的金属机架中，内装有二氧化硅包的密封盒内。在干燥环境中保存的幻灯片的保质期可达一年。</li>
	<li>（可选）：第二批 90 张幻灯片可以使用相同的示例打印。为此，在打印完板后，立即从阵列甲板上拆下 384 孔板。密封板并将其存放在 4°C。第一批阵列完全完成后，将它们从甲板上移除，放置新的氨基硅烷涂层幻灯片，并开始新的运行。确保每个 384 孔板在使用前 30 分钟在 RT 处。如果每个样品的四个副本打印在一批幻灯片中，建议将 384 孔板分成两个板，通过减少阵列甲板上的时间来减少样品蒸发。 注：在第二次运行开始之前检查所有储层。</li>
</ol>6. 在NAPPA幻灯片上检测DNA
<ol><li>阻止幻灯片。将幻灯片放入移液器盒中，并添加 30 mL 的阻塞缓冲液。在 RT 上在摇摇器上孵育 1 小时。</li>
	<li>弄脏幻灯片。放弃阻滞溶液，加入20 mL的阻断缓冲液和33μL的荧光DNA间染。用搅拌孵育15分钟。然后，用超纯水快速冲洗幻灯片，然后用高压空气干燥。继续扫描（第 11 节）。</li>
</ol>7. 国家适应行动方案幻灯片的表达
<ol><li>在 RT 的摇摇器上用阻塞缓冲器将幻灯片阻塞 1 小时。 在移液器盒中使用大约 30 mL 进行四张幻灯片。</li>
	<li>用超纯水冲洗幻灯片，用过滤过的压缩空气擦干。根据制造商的说明，将密封垫片应用于每张幻灯片。</li>
	<li>添加 IVTT 混合。每张幻灯片需要 150 μL 的 IVTT 混合。在33μL的DEPC水中稀释82.5μL的HeLa解酶，并补充16.5μL的附件蛋白和33 uL的反应混合物。从非标签或非试样端添加IVTT混合物。缓慢地将混合物移入中（如果珠子暂时在入口端向上，则是可以接受的）。轻轻按摩密封垫片，使 IVTT 混合分散并覆盖阵列的整个区域。将小圆端口密封件应用于两个端口。</li>
	<li>将幻灯片放在支架上，并将其转移到可编程的冷却培养箱中。在30°C下孵育90分钟，用于蛋白质表达，随后在15°C孵育30分钟，用于查询蛋白的固定。</li>
	<li>清洗并阻止幻灯片。取出密封垫片，将滑梯浸入移液器盒中，其内约 30 mL 的 1x TBST 辅以 5% 牛奶用于蛋白质显示（第 8 节）或 1x TBST，并辅以 3% 牛血清白蛋白 （BSA） 用于激酶测定或药物筛查（第 9 节）。在RT孵育20分钟，重复此步骤2倍。</li>
</ol>8. 检测国家适应行动方案阵列上的蛋白质
<ol><li>添加原抗体。从挡块溶液（步骤 7.5）中取出滑轨，并使用纸巾轻轻擦干背面（非打印侧）。将幻灯片放在支架上，在 1x TBST = 5% 牛奶中涂抹 600 μL 原抗体（小鼠抗旗）稀释 1：200。在 RT 孵育 1 小时。</li>
	<li>在摇摇器上用 1x TBST + 5% 牛奶清洗幻灯片（每个 3 次 5 分钟）。</li>
	<li>添加二级抗体。从洗涤溶液中取出滑片，并使用纸巾轻轻擦干背面。将幻灯片放在支架上，在 1x TBST = 5% 牛奶中涂抹 600 μL 的二次抗体（cy3-labbeled 抗小鼠抗体）稀释 1：200。保护幻灯片免受光线照射，并在 RT 孵育 1 小时。</li>
	<li>在摇摇器上用 1x TBST 清洗幻灯片（每个 3 次，每次 5 分钟）。用超纯水快速冲洗幻灯片，并使用高压空气干燥。继续扫描（第 11 节）。</li>
</ol>9. 在NAPPA阵列上进行酪氨酸激酶抑制剂筛查
注： 可以在同一实验中处理多个幻灯片，但是，确保在每个步骤中，一次处理一张幻灯片，并且它们不会在步骤之间干燥。将所有解决方案添加到幻灯片的非标签或非试样端。
<ol><li>准备药物筛查期间使用的所有溶液：<ol>
<li>通过组合以下方法制备磷酸酶/DNase溶液：1x蛋白质金属磷酸酶缓冲液（50 mM HEPES，100 mM NaCl，2 mM DTT，0.01% Brij 35，pH = 7.5）;1 mM MnCl2;8，000单位羊肉蛋白磷酸酶;和2个单位的DNase I.为每个微阵列准备400μL的溶液。在使用前添加磷酸酶和DNase。</li>
		<li>使药物稀释。药物在DMSO中重组，最终浓度为10 mM。为了确保在阵列上测试的所有药物浓度，确保为每个浓度创建相同体积的 DMSO（DMSO 中的 10，000x 库存），并保持在 -80°C。在使用时，药物在水中被稀释1：100。</li>
		<li>通过组合以下药物/激酶溶液：1x激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl的pH= 7.5）;5 mM β-糖酸酯;2 mM DTT;0.1 mM Na3VO4;10 mM MgCl2;500 μM ATP;2 μL的药物（在水中稀释1：100）。为每个微阵列准备 200 μL 溶液。</li>
	</ol>
</li>
	<li>进行磷酸酶和DNase治疗。从挡块溶液（步骤 7.5）中取出滑轨，并使用纸巾轻轻擦干背面。将幻灯片放在支架上，并应用 200 μL 的磷酸酶/DNase 溶液。放置微阵列盖玻片，以避免蒸发。在30°C下在烤箱中孵育45分钟。</li>
	<li>磷酸酶和DNase治疗II：从烤箱中取出阵列，丢弃盖玻片，去除多余的溶液，并应用200μL的新鲜磷酸酶和DNase溶液。用盖玻片覆盖微阵列，并在烤箱中30°C孵育45分钟。</li>
	<li>在摇摇器上用 1x TBST + 0.2 M NaCl 清洗幻灯片（每个 3 次 5 分钟）。</li>
	<li>进行药物治疗和激酶反应。从洗涤溶液中取出滑片，并用纸巾轻轻擦干背面。将幻灯片放在支架上，应用 200 μL 的药物/激酶溶液。将盖玻片放在顶部，以避免蒸发。在烤箱中30°C孵育1小时。</li>
	<li>在摇摇器上用 1x TBST + 0.2 M NaCl 清洗幻灯片（每个 3 次 5 分钟）。</li>
	<li>重复步骤8.1~8.4，使用原抗体抗磷酸剂抗体稀释1：100。在所有步骤中更换 1x TBST = 5% 牛奶，使用 1x TBST + 3% BSA。</li>
</ol>10. 自动杂交协议
注：或者，混合化站可用于自动执行NAPPA阵列上的所有杂交和分纸（第7-9节），协议作为补充文件1提供。
11. 图像采集
注：微阵列图像的分辨率应为20微米或更高。
<ol><li>将微阵列加载到滑动支架盒中，蛋白质朝上。将杂志加载到微阵列扫描仪中。</li>
	<li>选择带有 575/30 nm 发射滤波器的绿色激光器，以扫描标有 cy-3 标记的次级抗体的信号。如果使用不同的荧光，请选择正确的激光/波长来检测荧光染料发出的信号。</li>
	<li>定义每个图像的名称以及保存它们的位置。</li>
	<li>（可选）：对于每种新的荧光，建议优化扫描条件，以检测信号强度的线性范围。为此，请使用一系列光电倍增器 （PMT） 扫描微阵列并获取增益，直到获得具有非饱和信号和低背景的清晰图像。</li>
	<li>使用优化的设置扫描所有微阵列，并记住关闭自动增益。 注：对于数据分析，应使用相同的扫描设置扫描所有微阵列。对于使用cy3作为荧光剂的激酶测定，使用设备和材料表中列出的扫描仪扫描图像，其PMT为20%，激光强度为25%，分辨率为10微米。
</li>
</ol>12. 数据处理和分析
注： 有几个软件包可用于量化具有类似功能的微阵列数据。此处描述的过程是为设备和材料表中列出的软件设计的。
<ol><li>加载要量化的 TIFF 文件，设计网格以匹配微阵列布局，并调整点的大小，以将整个信号与尽可能小的区域合并。相邻点不应重叠。目视检查软件的性能，并在必要时手动调整网格。</li>
	<li>量化微阵列的信号强度。目视检查这些斑点是否有任何异常（非特异性结合、灰尘等），并将其从数据分析中删除。</li>
	<li>使用阵列上不存在点的邻近区域的信号在本地更正背景。</li>
	<li>数据规范化。要比较不同阵列的信号，必须标准化每个微阵列的信号强度。要排除任何异常值，请使用从脱磷化微阵列的正控制（IgG 点）中修剪的 30% 信号的均值对数据进行规范化。 注：在微阵列的磷酸化和脱磷酸化期间，来自IgG点的信号不会发生变化，适用于规范化。</li>
	<li>识别活动激酶。对于微阵列上显示的每个特征，计算自磷化阵列和去磷化阵列中标准化信号强度之间的比率。设置 1.5 倍的阈值以识别有源激酶，并将所有其他特征标记为无法进行自磷酸化 （N/A）。</li>
	<li>计算步骤 12.5 中标识的每个激酶的活动，作为调整信号的百分比（归一化正控制阵列 （DMSO） 的信号强度减去归一化负控制阵列（去磷化）的信号强度）。</li>
</ol>

<ol>
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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).</li></ol>

提交人声明没有利益冲突。

修改和故障排除 在NAPPA阵列激酶活性研究的优化阶段，观察到的背景和低动态范围的主要来源之一是印刷组合上使用的BSA。BSA提供与氨基酸表面交联所需的主要胺，并当场捕获DNA和捕获抗体。然而，BSA是高磷酸化的，因此很难检测背景噪声上方阵列上的自磷酸化信号。为了解决这个问题，对印刷混合物中的BSA几种替代品进行了测试，并确定了多利地因的良好替代品。多利地因缺乏任何磷酸化位点;因此，来自非表示数组的背景非常小。此外，用多赖因打印的微阵列可重现，并显示良好的蛋白质水平（图2）。
对标准NAPPA测定进行的下一个关键修改是添加磷酸酶/DNase治疗步骤。用磷酸酶处理微阵列，可以去除在蛋白质合成和捕获过程中在IVTT混合物中发生的任何磷酸化（图3）。这种磷酸化的来源可能来自内在的自磷酸化活性或IVTT混合物中存在的激酶活性。去除所有磷酸化后表达，便于识别活性和可进行自磷酸化的激酶（图3）。
协议中的关键步骤 NAPPA 是一项强大的技术，但如预期的那样，有几个关键步骤。首先是在适当的浓度下获得高质量的DNA。使用质量差或浓度低的DNA会产生质量差的微阵列，其中几个特征没有在适当的水平上表达和显示，从而减少阵列上分析的蛋白质数量。第二个关键步骤是微阵列上蛋白质的表达。IVTT系统的使用，表达高水平的功能蛋白，对于研究阵列上的激酶活性至关重要。
TKI 筛查的下一个关键步骤是如何处理微阵列。在协议的任何步骤中，微阵列都不应干燥，建议进行温和的处理，以防止可能增加背景信号的划痕。由于整个实验中的数组将相互比较，因此必须确保每个孵化步骤均匀于所有幻灯片。例如，在处理一批 20 个数组时，应考虑在单个数组中执行一个步骤所需的时间，以防止阵列之间孵育长度的差异。
最后，实验设计和包括正负控制对质量控制和数据分析至关重要。第一组控件是每个阵列中打印的控件，包括负控制 （即空点（不打印任何材料）、水或空矢量（仅表示标记））），以及正对照（即纯化 IgG，由二次抗体，对磷酸化水平的改变是惰性的）。它们共同测量微阵列的背景电平、打印过程中的可能结转以及检测方法的信号强度。
下一组控制措施是药物筛选控制，包括脱磷和自磷酸化微阵列（在存在或不存在DMSO的情况下）。如前所述，脱磷化微阵列测量磷酸化处理后的磷酸化水平，从而测量所有其他实验的基线水平。基线水平越低，测定的动态范围越高。自动磷化阵列提供所有阵列的最大磷酸化水平，信号应强而清晰。它用于数据分析，但也作为一种控制，所有反应都成功地在阵列上执行。
技术的限制 到目前为止，这里介绍的药物筛选的局限性之一是它只能筛选可自动磷酸光的蛋白质激酶。克服这种情况的一种可能方法是在同一位置打印激酶和已知基板。两种不同蛋白质的DNA联合打印成功，表明这种方法的可行性。此外，阵列上显示的蛋白质可能无法正确折叠，导致蛋白质不活性。基于人的表现系统的使用，使阵列上测得的激酶活性有了显著改善;然而，由于某些蛋白质不活动，仍无法在阵列上进行分析。
第二个限制是使用泛抗磷-磷酸化物抗体测量磷酸化。尽管磷酸化部位的图案不特定，但所有测得的磷基都发生在酪氨酸残留物上，留下丝氨酸和酪氨酸及其各自的激酶。迄今为止，尽管有几次尝试优化孵育和洗涤条件，但已对10多种泛磷-Ser/Thr抗体进行了测试，但没有成功。一种独立于抗体的新检测系统可能是扩大可筛选药物抑制蛋白激酶数量的最佳选择。在这方面，有一些选项可供选择，包括放射性或化学方法，如点击结合。需要一系列优化来最小化背景信号，并为测定提供良好的动态范围。
第三个限制是获取要打印在阵列上的 cDNA 克隆。cDNA克隆可以使用任何克隆技术生成，包括站点特定的重组系统，如创建者或网关23。另一种选择是从DNAAu库购买克隆，在<https：//dnasu.org/DNASU/Home.do>上找到，其中超过17，000个cDNA克隆，包括整个人类基诺姆，随时可用于建设NAPPA阵列24.
第四个限制是，并不是每个实验室都配备适当的设备来制造和筛选自己的NAPPA阵列。该协议提供了生成要打印在微阵列上的 DNA 的替代方法，无需高通量设备，并且协议可手动执行所有杂交步骤。但是，仍需要访问阵列器和微阵列扫描仪。克服这一问题的一个选择是使用NAPPA核心服务和设施，见<http：//nappaproteinarray.org/>，它以非营利的学术价格分发定制的NAPPA微阵列。最后，与任何筛选方法一样，阵列上获得的数据容易成为人工制品（正数或阴性），因此应使用正交测定进行验证。
相对于现有方法的重要性 一些平台可用于商业上的蛋白质激酶的筛选。常用的一种方法是结合测定，它可以与蛋白质片段、激酶域、具有激酶域和某些调节区域的较大蛋白质片段，甚至全长蛋白质一起进行。由于表达和纯化协议的成本和简单性，蛋白质通常在细菌系统中表达。感兴趣的药物与蛋白质之间的相互作用，然后通过某种类型的报告测定，如荧光或标签的存在，例如测量。这套方法的主要局限性是，蛋白质在与药物相互作用时不一定活跃，这可能导致识别假阳性和假阴性相互作用。蛋白质片段特别容易受到构象变化和缺乏活性的影响，获得的所有数据都应使用活性蛋白进行验证，最好是全长形式。某些平台的另一个限制是仅筛选 ATP 模拟功能，从而限制了其整体使用。
大多数使用基于酶的方法筛选TKI的商用服务只使用感兴趣的激酶的野生类型版本，有时也只使用选定的少数突变体。知道耐药性在TKI治疗的患者中很常见，因此能够测量不同突变体的药物反应，以选择最合适的抑制剂是很重要的。由于NAPPA的性质，激酶突变体的筛选是简单和容易完成的，唯一需要的工具是将激酶突变体纳入NAPPA cDNA集合，例如，可以通过位点特异性突变进行。
未来应用 使用激酶抑制剂进行癌症治疗中最常见的治疗方式之一是在治疗过程中获取药物靶点突变。对这些突变体对激酶抑制剂的反应进行筛查，对于选择第二代/第三代TKIs，为每位患者实现个性化治疗至关重要。这里介绍的药物筛选方法提供了一个无偏见的筛选平台，任何酪氨酸激酶抑制剂都可以根据人类基因组中存在的酪氨酸激酶面板进行测试。由于 NAPPA 阵列上显示的蛋白质在体外从幻灯片上打印的 cDNA 表示，因此任何突变变异都可以轻松合并到要显示在阵列上的 cDNA 集合中。激酶突变体可以在阵列上生成和表达的设施，结合NAPPA技术的高通量能力，为研究激酶突变体及其对药物的反应提供了独特的环境，使NAPPA适合个性化药物筛选，精准医学的目标之一。

蛋白质激酶负责其目标的磷酸化，并可以调节控制许多细胞功能的复杂分子通路（即细胞增殖、分化、细胞死亡和存活）。放松激酶活性与400多种疾病有关，使激酶抑制剂成为治疗多种疾病的主要药物之一，包括癌症、心血管和神经系统疾病以及炎症和自身免疫性疾病1，2，3。
随着精密医学的出现，新疗法，特别是激酶抑制剂的鉴定，在药物学和临床上都有很大的吸引力。有几种方法可用于识别可能的新激酶/激酶抑制剂对，包括激酶抑制剂的解设计以及确定现有FDA批准药物的新靶点。后者特别有吸引力，因为由于以前的临床试验数据可用，在诊所实施这些药物所需的时间和资金大大减少。激酶抑制剂再用途的一个规范例子是imatinib，最初设计用于通过抑制BCR-Abl治疗慢性骨髓性白血病（CML），该抑制也可用于治疗C-Kit过度表达胃肠道基质肿瘤（GISTs）4，5，6，7 。
激酶抑制剂的筛选可以在结合化测定或酶基测定中进行。第一类检测侧重于蛋白质-药物相互作用，并可提供结扎部位和亲和力等信息。由于这些测定时激酶的活动未知，由于蛋白质的构象变化，一些相互作用可能丢失或被错误识别。另一方面，基于酶的检测要求蛋白激酶活性，并提供有关抑制剂对酶活性影响的宝贵信息，然而，这种类型的筛选通常更耗时和昂贵。目前，这两种检测均可从多个来源获得。它们是一种可靠的选择，用于筛选激酶抑制剂，但存在一些局限性，包括：I） 大多数方法涉及单独测试多个激酶，这使得筛选大量蛋白质的成本更高;II） 要测试的激酶集仅限于预先选择的野生型激酶列表和一些激酶的一些众所周知的突变版本，从而阻碍了许多新突变等形物的测试。
在此背景下，蛋白质微阵列是一个强大的平台，能够克服商业上可用的技术带来的一些限制。它适用于使用任何感兴趣的序列的全长活性蛋白质在高通量筛选中执行酶基化检测。微阵列可以通过自组装的方法（如NAPPA（核酸可编程蛋白质阵列）生成，在该方法中，蛋白质在检测时正好表达出来，增加了阵列上显示的蛋白质确实活跃的可能性。NAPPA上显示的蛋白质使用人类衍生的核糖体和伴生蛋白产生，以提高自然折叠和活性的可能性。
蛋白质最初通过打印cDNA编码来编程，这些基因与捕获标记融合在微阵列表面上。然后，使用体外转录和翻译（IVTT）系统在微阵列上产生蛋白质，捕获剂将新表达的蛋白质固定在微阵列表面。表达的NAPPA阵列可用于研究以无偏见、高通量方式在阵列上显示的蛋白质8，9。
此前，它表明，在NAPPA阵列上显示的蛋白质被正确折叠，以与已知的合作伙伴10相互作用;此外，他们的酶活性在2018年首次被利用，当时显示微阵列自磷酸酯11上显示的蛋白质激酶。迄今为止，NAPPA方法已用于许多不同的应用，包括生物标志物发现12，13，14，15，16，17，蛋白质-蛋白质相互作用10，18，基质鉴定19，药物筛选11。其灵活性是平台的关键特性之一，允许适应每个应用程序。
这里给出了一种在自组装的NAPPA阵列中筛选酪氨酸激酶抑制剂的协议。该平台针对活性人类蛋白激酶的显示和蛋白质激酶活性分析进行了优化，背景低，动态范围高。在使用NAPPA筛选激酶抑制剂时实施的修改包括：I）印刷化学的变化，II）在激酶抑制剂筛选之前对蛋白质微阵列的脱磷，以及III）优化检测阵列上的磷酸酯蛋白。该协议是同类协议中的第一种，它提供了有关NAPPA微阵列中激酶研究的独特信息。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>364 well plates (for arraying)</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>x7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 &#181;L 96-well collection plate</td>
			<td>Abgene</td>
			<td>AB-0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin device</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>140500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>1.00066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone 99.9%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum seal for 96 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76004-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>80370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>37535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 35</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>BP345-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeepWell Block, case of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-intercalating dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plates</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA77002804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Permeable Seals, box of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass box</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human-based IVTT system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPure Mouse IgG whole molecule</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>31202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (Potassium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4(Potassium phosphate monobasic)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Protein Phosphatase</td>
			<td>new england biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifterslips, 24 x 60 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25X60I24789001LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal 30-slide rack with no handles</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4 (Sodium orthovanadate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOAc (Sodium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410.10 / 740414.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoprep Anion II</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740503.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>79617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution (0.01%)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Phosphatase (Lambda)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs, Inc</td>
			<td>44904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica packets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100489-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single well plate</td>
			<td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (3M, pH 5.5)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB media (Terrific Broth)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T0918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>IBI scientific</td>
			<td>IB70144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td>Maker/model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable chilling incubator</td>
			<td>Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker for bacterial growth</td>
			<td>ATR Multitron shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold with liquid waste trap</td>
			<td>MultiScreenVacuum Manifold 96 well</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well autopippetor/liquid handler</td>
			<td>Genmate or Biomek FX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser</td>
			<td>Wellmate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarrayer</td>
			<td>Genetix QArray2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic hybridization station</td>
			<td>Tecan HS4800 Pro Hybridization Station</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Tecan PowerScanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray data quantification</td>
			<td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays

激酶抑制剂的筛选对于更好地了解药物的特性和识别具有临床影响的潜在新靶点至关重要。据报告，有几种方法可以完成这种筛选。然而，每种酶都有其自身的局限性（例如，仅筛选ATP类似物，限制使用纯化激酶域，一次测试多个激酶相关，以及缺乏筛选蛋白激酶的灵活性。新的突变）。这里，提出了一种克服其中一些限制并可用于激酶抑制剂的无偏筛选的新方案。这种方法的一个优势是能够比较不同激酶或同一激酶不同变异之间的多种蛋白质的激酶抑制剂的活性。采用基于人类的体外转录和翻译系统（IVTT）通过表达蛋白激酶产生的自组装蛋白微阵列。微阵列上显示的蛋白质是活跃的，允许测量激酶抑制剂的效果。以下过程详细介绍了从微阵列生成和筛选到数据分析的协议步骤。

自组装的NAPPA微阵列提供了一个坚实的平台，可用于许多不同的应用，包括生物标志物发现、蛋白质-蛋白质相互作用、基质鉴定和药物筛选10、11，12，13，14，15，16，17，18，19，20。
图1中，用于研究激酶活性和筛选NAPPA微阵列上的酪氨酸激酶抑制剂的总体方法在图1中进行了图。首先，NAPPA微阵列是由cDNA和捕获剂固定到涂层微阵列上产生的。然后，使用基于人的IVTT系统，将cDNA用作蛋白质转录和翻译的模板，新合成的蛋白质被捕获剂9固定。通过测量DNA水平（确认一致的打印）或阵列上显示的蛋白质（确认蛋白质表达和捕获），可以监测打印微阵列的质量;图 1.为了减小背景信号并增加实验的动态范围，用1）lambda磷酸酶处理微阵列，以去除Ser/Thr/Tyr残留物中的磷酸化，然后用2）DNase来简化现场的化学，减少背景 （图 1）。
下一步是自磷酸化反应，在没有ATP的情况下用激酶缓冲液孵育微阵列（负控制阵列，称为去磷酸化微阵列），激酶缓冲液补充ATP（正控制，称为自动磷酸酯阵列）或 ATP = DMSO（车辆控制）。应该强调的是，在这一步中，不添加激酶;因此，通过使用泛抗磷-酪氨酸抗体测量其磷酸化水平，然后使用cy3-labbebed二次抗体（图1），对微阵列上显示的每个激酶的内在活性进行量化。
显示以四元印刷的人类蛋白激酶面板的NAPPA-激酶阵列的质量控制如图2所示。固定DNA的水平是通过DNA染色来测量的，它显示了整个微阵列的均匀信号，表明阵列上打印的DNA数量是均匀的。也可以观察几个特征，没有任何DNA染色。这些功能对应于一些控制，其中脱氧核糖核酸从印刷混合物中省略了，即空斑（未打印任何内容）、水斑、纯化 IgG 点（多利因、交联和纯化 IgG）、仅打印组合（完整打印组合：多流变加上交联剂和反旗抗体，没有任何DNA]。使用抗标记抗体在IVTT反应后评估NAPPA-激酶微阵列上显示的蛋白质水平。
对于激酶筛选，使用 Flag 作为首选标记，并使用抗旗抗体测量微阵列上显示的蛋白质水平。如图所示，大多数含有cDNA的斑点成功地显示了可检测的蛋白质水平。一些没有cDNA的控制点也揭示了与抗旗抗体的信号：IgG点（用于检测二次抗体的活性）和空的载体点（仅标记的cDNA代码）（图2）。NAPPA-激酶微阵列在幻灯片间表现出良好的可重复性，不同印刷批次中蛋白质显示水平的相关性高于0.88（图2）。在同一批次中，相关性甚至更高，接近 0.92（未显示数据）。
其次，使用抗磷-酪氨酸抗体测量阵列上显示的蛋白质的激酶自磷酸化活性（图3）。阵列上显示的蛋白质在表达后表现出高水平的蛋白质磷酸化（图3，左图），这可能是由阵列上显示的蛋白质的内在激酶活性或IVTT混合物中存在的活性激酶引起的。这种磷酸化通过羊角磷酸酶处理完全去除，这些微阵列用于激酶测定。脱磷后，没有ATP进行的自磷酸化反应显示磷酸化水平没有显著水平，如预期的那样，而在ATP存在的情况下用激酶缓冲液孵育的微阵列显示蛋白质磷酸化速度高达15分钟（（图 3.在药物筛选中，在自磷酸化反应60分钟后测量激酶活性，以最大化被测试的激酶数量。
在蛋白质表达（图3，左）和自磷酸化反应60分钟之后的微阵列中，磷酸化水平的测量显示：i）蛋白质仅磷酸化表达后，表明它们可以通过IVTT混合物上的蛋白质进行外生磷酸化，但不能自光磷化;ii） 蛋白质磷酸化仅在自磷酸化反应后，表明这些蛋白质在蛋白质表达后不活跃，并且要求激酶缓冲液中的共因子是活跃的;或 iii） 两个阵列上的蛋白质磷酸光，表明它们在两种环境中都处于活动状态（图3）。
作为在NAPPA激酶阵列上筛选酪氨酸激酶抑制剂的结果的一个示例，使用了三种在蛋白激酶中具有明显选择性的激酶抑制剂：陶罗斯波林、伊马替尼和伊布鲁替尼。对于所有筛选，在自磷酸化反应期间，用增加的TKI浓度（从100 nM到10 uM）孵育脱磷酸化NAPPA微阵列。第一个TKI测试是staurosporine，一种全球蛋白激酶抑制剂，它显示强效激酶抑制在微阵列上几乎所有被测试的11激酶。
接下来，伊马替尼被测试，一种ABL和c-Kit抑制剂用于治疗慢性骨髓性白血病和胃肠道基质肿瘤4，5，6，7。在NAPPA-激酶阵列上，imatinib显示Abl1和BCR-Abl1活性显著减少，而其他激酶大多未受影响（图4A）。激酶活性的数据量化针对脱磷酸化阵列进行了标准化，并代表正控制微阵列的百分比（仅限车辆）。TNK2（非相关激酶）、Abl1和BCR-Abl1的数据如图4B所示。不出所料，伊马替尼对Abl1和BCR-ABl1表现出选择性抑制。由于正控制阵列上缺乏活动，c-Kit 的数据没有定论。
最后，对布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）的FDA批准的共价抑制剂ibrutinib进行了测试。Ibrutinib目前用于治疗几种与血液有关的癌症与过度活跃的BTK，包括慢性淋巴细胞白血病（CLL），地壳细胞淋巴瘤，和瓦尔登斯特伦的巨球蛋白血症21，22。图4C代表伊布鲁替尼筛查的典型结果。ABL1（非相关激酶）和BTK（规范靶）和ERBB4（潜在新目标）的激酶活性如图4D所示。数据表明ERBB4可以抑制伊布鲁替尼在剂量特定的方式。这种抑制在体外和基于细胞的测定11中得到证实，证明了该平台的力量。
综合起来，数据表明，NAPPA-激酶微阵列平台可用于无偏地筛选TK抑制剂。此外，筛选速度快，易于定制，包括感兴趣的蛋白质激酶的任何变异。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg"> 图1：NAPPA阵列中酪氨酸激酶抑制剂质量控制和筛选的原理表。NAPPA 阵列使用 cDNA 编码打印，用于与标记和捕获抗体融合的感兴趣的蛋白质。在体外转录和翻译反应（IVTT）期间，合成的蛋白质通过捕获抗体的标记在微阵列表面捕获。阵列的质量控制 （QC） 是通过使用荧光 DNA 间印染料测量幻灯片上打印的 DNA 水平，以及使用标记特异性抗体在阵列上显示的蛋白质水平来执行的。对于激酶筛选，在IVTT反应后，用DNase和磷酸酶处理微阵列，以去除印刷的DNA和蛋白质合成过程中可能发生的所有磷酸化。脱磷阵列现已准备就绪，可用于药物筛选。对于每个测定，通常使用三组控制：（I） 脱磷化阵列，其中自动磷酸化反应在没有ATP的情况下执行;（II） 自动磷酸化微阵列，在ATP存在的情况下进行自磷酸化反应;（III） DMSO处理阵列（车辆），其中自动磷酸化反应使用ATP和DMSO执行。用不同浓度的激酶抑制剂处理的幻灯片遵循DMSO处理阵列所用完全相同的协议。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg"> 图2：自组装的NAPPA激酶阵列质量控制的代表性结果。显示了由荧光DNA间染（左）测量的DNA含量和抗旗抗体（中）测量的微阵列上显示的蛋白质水平。右侧是两个 NAPPA 激酶阵列上显示的蛋白质水平的相关图，这些阵列以不同批次打印。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg"> 图3：NAPPA-激酶阵列中激酶活性的代表性结果。使用抗pTyr抗体测量蛋白质磷酸化，然后使用cy3标记抗小鼠抗体，用于研究四联体蛋白激酶的微阵列，以研究阵列上的蛋白质激酶活性。在自磷酸化反应期间，使用无磷酸酶/DNase处理和没有ATP的控制阵列来测量蛋白质表达（后表达）后的背景磷酸化。其余微阵列用磷酸酶/DNA处理，自磷酸化反应在没有ATP（脱磷化微阵列，阴性控制）或ATP（自磷化微阵列）的情况下进行。对于自磷酸化微阵列，如所示，自动磷酸化反应为15分钟、30分钟、45分钟或60分钟。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg"> 图4：来自NAPPA激酶阵列上的酪氨酸激酶屏幕的代表性数据。（A） 磷酸酶/DNase处理的NAPPA-激酶阵列在自磷酸化反应过程中在增加的伊马替尼浓度下孵育，用抗磷-tyr抗体测量激酶活性。（B） 在接触伊帕替尼的NAPPA-激酶阵列上观察到的激酶活性的定量。数据根据负控制阵列（去磷酸化）的信号进行归一化，并显示为正控制阵列的百分比（在 DMSO 存在的情况下执行自磷化反应）。类似的数据显示为伊布鲁替尼 （C， D） 的筛选.这个数字已由拉乌夫等人11修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
补充文件1。使用自动杂交站筛选NAPPA阵列中的酪氨酸激酶抑制剂的替代方案。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">请点击此处下载此文件。</a>

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Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

提出了用于筛选激酶抑制剂的自组装人类蛋白质微阵列的详细方案。

自组装的人类蛋白质微阵列中的激酶抑制剂筛选

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

NAPPA 是一个功能强大的蛋白质微阵列平台，可用于以无偏高通量的方式研究蛋白质活性和功能。NAPPA上显示的蛋白质在基于人类的表达系统中使用人类衍生的核糖体和伴郎产生，以提高自然折叠和活动的可能性。使用NAPPA阵列筛选激酶抑制剂为新药和临床相关激酶突变的检测提供了一个新的平台。NAPPA 方法产生的蛋白质微阵列可用于许多不同的应用，包括生物标志物发现、蛋白质-蛋白质相互作用、基质识别和药物筛选。沿途执行质量控制步骤。测试您的DNA制剂、DNA微阵列和蛋白质微阵列的质量。如果在任何步骤的质量都不好，就重新开始吧。演示这个程序的将是丽莎·米勒，一个在我的实验室的技术人员。要准备细菌生长在家庭高通量迷你准备，首先接种细菌在螺旋板96井格式，并让它生长16小时。第二天，用1.5毫升的特好肉汤介质填充深井板的每个井，辅以抗体安培西林。抗体取决于质粒上的选择标记。然后，用 80% 乙醇和火焰对 96 针设备进行消毒。使用无菌 96 针装置从隔夜孵化的阿加板中挑选菌落，并潜入深井板的井中，为培养体接种。用气体渗透密封盖住块，在 37 摄氏度和 300 至 800 rpm 的摇床上孵育 22 至 24 小时。之后，颗粒培养和根据手稿重新暂停文化。将200微升溶液加入两口，用铝密封密封板，并反转五次。将细菌加入200微升溶液中。孵育细胞整整五分钟。要中和溶液，请添加 200 微升溶液三，用铝密封密封板，并反转五次。然后，在3800G，4摄氏度的旋转板，30分钟清除裂样上清液。要准备心安尼交换树脂板，首先将心安尼交换浆料混合，然后将泥浆倒入玻璃槽中。将过滤板堆叠在深井板上，以充当废物收集容器。然后，使用宽板 P1000 尖端，混合浆料，将 450 微升浆料转移到滤芯的每个孔中。离心并丢弃流经。现在，将落酸中盐转移到树脂板和深井块的堆栈中。以最慢的加速速度旋转堆叠板 5 分钟，并丢弃流经。要清洗柱，请向每个井添加 400 微升溶液 N3 洗涤缓冲液。将树脂板转移到真空歧管中，以去除洗涤缓冲液。重复洗涤步骤三次，然后以30倍的短暂5分钟旋转去除任何剩余的洗涤缓冲液G.To将DNA洗脱，将树脂板放在干净的800微升收集板上。在每个井中加入300微升溶液N5，让它在室温下坐10分钟。然后，在 20 倍 G 下旋转堆叠板 5 分钟，将速度慢速提升至 233 倍 G，一分钟。使用前在负 20 摄氏度时存放板。首先，将滑梯放在机架上，将幻灯片淹没在玻璃储液罐中，其中含有丙酮中 2%氨基硅烷试剂的涂层溶液。摇动幻灯片 15 分钟。然后，用丙酮冲洗幻灯片，然后在水中进行最后冲洗。接下来，使用压力空气干燥滑梯。从各个角度吹到它们约三分钟，直到所有水滴被移除。将涂层的幻灯片在室温下存放在密封紧密的盒子内的金属机架上。现在，继续沉淀手稿中描述的DNA。然后，将DNA颗粒重新在20微升超纯水中重新浇水，以1000转/秒的速度摇动两小时。要准备阵列样品，请将10微升新鲜制备的打印混合物添加到每个DNA样品中，其中含有抗体、交联和聚聚氨酸。用铝箔密封板，在室温下在 1000 rpm 下摇动 90 分钟。将盘子在四摄氏度下过夜。在印刷日，短暂地旋转和旋转板。将每个样品的 28 微升转移到 384 井板中。将氨基硅烷涂层幻灯片和 384 井板放在阵列甲板上，然后启动微阵列打印程序。打印完成后，为微阵列贴上标签。微阵列可以存储数月，直到进一步使用。要测量DNA水平，请将幻灯片放在移液器盒中，用50毫升的阻滞缓冲液封住它们。在室温下将滑梯孵育在摇摇器上一小时。然后，丢弃溶液，加入20毫升的阻隔缓冲液和33微升的荧光DNA交色染料。用搅拌孵育15分钟。孵育结束后，用超纯水快速冲洗滑梯，用压力空气干燥。微阵列已准备好进行扫描。要表达微阵列，请按之前所示方式挡住幻灯片，然后用超纯水冲洗，然后用过滤的压缩空气干燥。将密封垫片连接到每个滑轨上。在幻灯片上加入 130 毫升的体外转录和翻译混合物，轻轻按摩密封垫片，使体外转录和翻译混合展开，覆盖阵列的整个区域，没有任何气泡。将小圆形端口密封件应用于两个端口。在30摄氏度下孵育90分钟，用于蛋白质表达，随后在15摄氏度下孵育30分钟，用于查询蛋白的固定。然后，取出垫片，用牛奶在 15 毫升 TBST 中清洗三次，每次 5 分钟，然后在同一溶液中块开一个小时。为了检测阵列上的蛋白质，用牛奶去除TBST，将幻灯片放在格子板上，并应用600微升的原抗体、小鼠抗旗、稀释一至两百和1倍TBST，辅以5%牛奶。在室温下孵育一小时。在摇摇器上用 50 毫升 1 倍 TBST 和 5% 牛奶清洗滑梯，每次 5 分钟。重复二级抗体的过程。一个小时的孵育期结束后，在摇摇器上用1倍TBST清洗幻灯片三次，每次5分钟。然后，用超纯水快速冲洗滑梯，并使用压力空气干燥。幻灯片已准备好扫描。要进行磷酸酶和DNase治疗，请用TBST清洗和阻挡表达的幻灯片，并辅以手稿中描述的3%BSA。然后，将幻灯片放在格栅板上，并应用 200 微升磷酸酶 DNase 溶液。将微阵列盖滑放在顶部以避免蒸发。在30摄氏度下在烤箱中孵育1小时30分钟。然后，在摇摇器上用 1x TBST 和 0.2 摩尔氯化钠清洗幻灯片三次，每次洗涤 5 分钟。要进行药物治疗和激酶反应，将幻灯片放在格子板上，并应用200微升药物激酶溶液。将盖滑放在顶部以避免蒸发。在烤箱中孵育一小时，温度为30摄氏度。可重现数据的关键是跨幻灯片的一致孵育时间。这在激酶反应期间尤其重要。应说明处理每张幻灯片所需的时间。之后，在摇摇器上用1xTBST和0.2摩尔氯化钠清洗滑梯三次，每次5分钟。重复蛋白质检测，使用原发抗体磷磷酪氨酸抗体稀释1至100在TBST，辅以3%牛血清白蛋白。使用1x TBST和3%牛血清白蛋白在用原抗体孵育后进行洗涤，使用TBST进行二次抗体孵育后洗涤。如前所述，清洗和干燥。对于图像采集，请将微阵列加载到幻灯片架杂志中。将杂志加载到微阵列扫描仪中。使用优化的设置扫描所有微阵列，并记住在比较实验图像时关闭自动增益。将图像传输到量化软件，将网格与点对齐，并量化微阵列上每个要素的信号强度。继续进行统计分析。在这项研究中，微阵列显示大多数含有互补DNA的斑点成功地显示了可检测的蛋白质水平。NAPPA激酶微阵列在幻灯片中表现出良好的可重复性，不同印刷批次的蛋白质显示水平的相关性高于0.88。NAPPA激酶阵列中激酶活性的代表性结果表明，表达后蛋白磷酸化水平高。磷酸酶处理后测量磷酸化水平的微阵列与60分钟的自磷酸化反应后的比较表明阵列上存在活性蛋白激酶。在NAPPA激酶阵列上，imatinib显示ABL1和BCR-ABL1活性显著减少，而其他激酶大多未受影响。激酶活性对脱磷化阵列进行正常化，并代表正对微阵列的百分比，显示对ABL1和BCR-ABL1的选择性抑制。伊布鲁替尼筛查的典型结果表明，ABL1非相关激酶的激酶活性不受影响。Btk 规范目标， 和 ERBB4 潜在的新目标， 显示减少活动在伊布鲁替尼的存在。数据表明ERBB4可以抑制伊布鲁替尼在剂量特定的方式。蛋白质微阵列筛查的成功在很大程度上取决于微阵列本身的质量。应使用几个正负控制功能进行适当的数据分析。NAPPA激酶测定是一个筛选平台，因此，获得的数据应在后续测定中验证，其中可能包括体外激酶测定或基于细胞的测定。由于我们的协议从cDNA开始，任何激酶突变或变异都可以很容易地融入微阵列中，并在高通量中研究。在制备 Anion 交换树脂浆料和板材时，建议使用口罩防止可能吸入树脂颗粒。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

用放射性标记的ATP测定蛋白激酶活性

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

科研

生物化学

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

用肽微阵列分析组蛋白抗体特异性

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

用体外激酶法鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1特异磷酸化部位

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

利用商用仪器和自由开源亮度分析软件对蛋白质的聚齐聚进行无标定的体外定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

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放射性脉冲追逐对活细胞蛋白质折叠、迁移和降解的分析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

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人类外周血神经细胞分离通过评估Rab10磷酸化来询问帕金森氏症相关的LRRK2激酶途径

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

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使用新激酶蛋白的强生化方法在分子水平上进行表征

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

热通菌膜-双磷酶抑制剂的筛选

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