Name: kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

De auteurs willen iedereen in het lab van LaBaer bedanken voor hun hulp en kritiek tijdens de ontwikkeling van het project. Dit project werd gesteund door de NIH Grant U01CA117374, U01AI077883 en Virginia G. Piper Foundation.

<ol>
	<li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+kinases.">Targeting protein kinases.</a> Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).</li><li>Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+inhibitors+in+the+treatment+of+inflammatory+and+autoimmune+diseases.">Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases.</a> Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).</li><li>Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA-approved+small-molecule+kinase+inhibitors.">FDA-approved small-molecule kinase inhibitors.</a> Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).</li><li>Heinrich, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+c-kit+receptor+tyrosine+kinase+activity+by+STI+571,+a+selective+tyrosine+kinase+inhibitor.">Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor.</a> Blood. 96 (3), 925-932 (2000).</li><li>Stagno, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+mesylate+in+chronic+myeloid+leukemia:+frontline+treatment+and+long-term+outcomes.">Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes.</a> Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).</li><li>Ben Ami, E., Demetri, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safety+evaluation+of+imatinib+mesylate+in+the+treatment+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor.</a> Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).</li><li>Ramachandran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+microarrays.">Self-assembling protein microarrays.</a> Science. 305 (5680), 86-90 (2004).</li><li>Festa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+microarray+production+of+freshly+expressed+proteins+in+a+human+milieu.">Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu.</a> Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).</li><li>Rauf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inhibition+of+ERBB4+reduces+cell+growth+in+a+WNT5A-dependent+manner.">Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner.</a> Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).</li><li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarray+signature+of+autoantibody+biomarkers+for+the+early+detection+of+breast+cancer.">Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer.</a> Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Autoantibodies+Associated+with+Basal-like+Breast+Cancers.">Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).</li><li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+Antibody+Immunome+in+Type+1+Diabetes+Using+Protein+Arrays.">Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays.</a> Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Antibody+Targets+for+Tuberculosis+Serology+using+High-Density+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays.">Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Autoantibody+Responses+between+Lung+Adenocarcinoma+and+Benign+Pulmonary+Nodules.">Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules.</a> Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).</li><li>Montor, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+Pseudomonas+aeruginosa+outer+membrane+protein+immunogenicity+using+self-assembling+protein+microarrays.">Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays.</a> Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).</li><li>Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+Protein-Protein+Interactions+Using+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays.">Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+(click+chemistry)-based+detection+of+global+pathogen-host+AMPylation+on+self-assembled+human+protein+microarrays.">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).</li><li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+signature+for+the+serologic+detection+of+ovarian+cancer.">Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).</li><li>Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B-cell+receptor+signaling+pathway+as+a+therapeutic+target+in+CLL.">The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL.</a> Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).</li><li>Smith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+in+B+lymphoid+malignancies.">Ibrutinib in B lymphoid malignancies.</a> Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).</li><li>Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cloning+and+expression+library+creation+for+functional+proteomics.">High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics.</a> Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).</li><li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Wijzigingen en probleemoplossing Tijdens de optimalisatie fase van de studie van kinase activiteit op NAPPA-arrays was een van de belangrijkste bronnen van achtergrond en laag dynamisch bereik waargenomen de BSA die op de drukmix werd gebruikt. BSA was het verstrekken van de primaire amines die nodig zijn voor crosslinking met het aminosilaan oppervlak en was het vangen van het DNA en de Capture antilichaam ter plaatse. Echter, BSA is zeer gefosforyleerd, waardoor het moeilijk voor de detectie van de autofosforylatie signaal op de array boven de achtergrondruis. Om dit probleem op te lossen, werden verschillende alternatieven voor BSA in de drukmix getest, en poly-lysine werd geïdentificeerd als goede substituut. Poly-lysine mist geen fosforylatie plaats; Daarom is de achtergrond van niet-uitgedrukt matrices zeer minimaal. Bovendien, micro arrays bedrukt met poly-lysine zijn reproduceerbaar en vertonen goede niveaus van eiwitten (Figuur 2).
De volgende kritische modificatie uitgevoerd op de standaard NAPPA assay was de toevoeging van een fosfatase/DNase behandelings stap. De behandeling van de micro arrays met fosfatase maakt het mogelijk om elke fosforylering die zich in de IVTT-mix heeft voorgedaan tijdens de eiwitsynthese en-opname te verwijderen (Figuur 3). De bron van deze fosforylering kan afkomstig zijn van intrinsieke autopfosforylatie activiteit of van de activiteit van kinasen die aanwezig zijn in de IVTT-mix. Het verwijderen van alle fosforylering post-expressie toegestaan gemakkelijke identificatie van de kinases die actief zijn en kan autofosforylatie ondergaan (Figuur 3).
Kritieke stappen in het Protocol NAPPA is een robuuste technologie, maar zoals verwacht zijn er verschillende kritieke stappen. De eerste is de verwerving van kwalitatief hoogwaardig DNA in de juiste concentratie. Het gebruik van DNA van slechte kwaliteit of in lage concentraties zal micro arrays van slechte kwaliteit genereren met verschillende functies die niet worden uitgedrukt en weergegeven in de juiste niveaus, waardoor het aantal op de array geanalyseerde eiwitten afneemt. De tweede kritieke stap is de uitdrukking van eiwitten op de Microarray. Het gebruik van een IVTT-systeem dat hoge niveaus van functioneel eiwit zal uitdrukken, is van vitaal belang voor het bestuderen van kinase activiteit op de array.
De volgende kritieke stap op de TKI-screening is hoe de micro arrays worden afgehandeld. De micro arrays moeten niet drogen tijdens elke stap van het Protocol, en een voorzichtige behandeling wordt aanbevolen om krassen te voorkomen die het achtergrond signaal kunnen vergroten. Aangezien de arrays uit het hele experiment tegen elkaar worden vergeleken, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat elke incubatie stap zelfs over alle dia's gaat. De tijd die nodig is om één stap in één array uit te voeren, moet bijvoorbeeld in aanmerking worden genomen wanneer een batch van 20 arrays wordt verwerkt om te voorkomen dat er verschillen zijn in de lengte van de incubatie tussen matrices.
Tot slot is het ontwerp van het experiment en het opnemen van zowel positieve als negatieve controles van cruciaal belang voor kwaliteitscontrole en gegevensanalyse. De eerste set besturingselementen zijn de afdrukken in elke array en bevat negatieve controles [d.w.z. lege vlekken (zonder materiaal gedrukt), water of lege Vector (alleen de tag uitdrukken)], evenals een positieve controle (d.w.z. gezuiverde IgG, die wordt gedetecteerd door de secundair antilichaam en is inert voor verandering in de fosforylatie niveaus). Gezamenlijk meten ze de achtergrondniveaus van de Microarray, mogelijk overdracht tijdens het printen en de signaalintensiteit van de detectiemethode.
De volgende set van controles zijn de drug screening controles en omvatten de gedefosforyleerd en autophosphorylated micro arrays (in de aanwezigheid of afwezigheid van DMSO). Zoals eerder vermeld, meet de gedefosforyleerd microarray het niveau van fosforylatie na behandeling met fosfatase en dus het Baseline niveau voor alle andere experimenten. Hoe lager het basislijn niveau, hoe hoger het dynamische bereik van de assays. De autophosphorylated arrays presenteren de maximale fosforylatie niveaus van alle arrays en het signaal moet sterk en duidelijk zijn. Het wordt gebruikt voor gegevensanalyse, maar ook als een controle dat alle reacties met succes werden uitgevoerd op de array.
Beperkingen van de techniek Vanaf nu is een van de beperkingen van de drug screening hier gepresenteerd is de mogelijkheid om alleen te screenen eiwit kinases die kunnen worden autophosphoryated. Een mogelijke manier om dit te overwinnen is om een kinase en bekend substraat op dezelfde plek af te drukken. Co-Printing van DNA voor twee verschillende eiwitten werd met succes gerealiseerd15, wat de haalbaarheid van deze aanpak suggereert. Bovendien kan het eiwit dat op de array wordt weergegeven niet correct worden gevouwen, wat resulteert in een inactief eiwit. Het gebruik van de mens gebaseerde expressie systeem maakte een significante verbetering in de kinase activiteit gemeten op de array; Sommige eiwitten kunnen echter nog steeds niet worden geanalyseerd op de array vanwege de inactiviteit.
Een tweede beperking is de meting van de fosforylering met behulp van een pan anti-fosho-Tyr-antilichaam. Ondanks zijn niet-specificiteit met betrekking tot het motief van de fosforylatieplaats, traden alle gemeten fosforylaties op in tyrosine-residuen, waardoor serines en threonines en hun respectieve kinasen achterblijven. Tot op heden zijn meer dan 10 pan-fosho-ser/thr-antilichamen zonder succes getest, ondanks verschillende pogingen om incubatie-en wascondities te optimaliseren. Een nieuw detectiesysteem dat onafhankelijk is van antilichamen kan de beste optie zijn om het aantal eiwit kinasen dat kan worden gescreend op remming van de drug uit te breiden. In deze context zijn een paar opties beschikbaar, waaronder radioactiviteit of chemische benaderingen zoals Klik conjugatie. Er is een reeks optimalisaties nodig om het achtergrond signaal te minimaliseren en een goed dynamisch bereik voor de assays te bieden.
De derde beperking is de overname van cDNA-klonen die op de array moeten worden gedrukt. De cDNA-klonen kunnen worden gegenereerd met behulp van een kloon techniek, inclusief sitespecifieke recombinatie systemen, zoals Creator of gateway23. Een andere optie is om de klonen van de bibliotheek DNAsu te kopen, te vinden op < https://Nasu.org/dnasu/Home.do >, waar meer dan 17.000 cDNAs-klonen, inclusief de gehele menselijke kinome, direct beschikbaar is om te worden gebruikt voor de bouw van NAPPA-arrays24 .
De vierde beperking is dat niet elk laboratorium is uitgerust met de juiste apparatuur om hun eigen NAPPA-arrays te fabriceren en te schermen. Dit protocol biedt alternatieve methoden voor het genereren van het DNA dat moet worden afgedrukt op de Microarray, zonder de noodzaak van apparatuur met hoge doorvoer en protocollen om alle hybridisatie stappen handmatig uit te voeren. Echter, toegang tot een arrayer en Microarray scanner is nog steeds nodig. Een optie om dit probleem te verhelpen is om de NAPPA core-service en-faciliteit te gebruiken, te vinden op < http://appaproteinarray.org/>, die aangepaste NAPPA-micro arrays distribueert tegen een academische prijs zonder winstoogmerk. Ten slotte zijn, vanaf elke screenings methodologie, de op de arrays verkregen gegevens vatbaar voor artefacten (positief of negatief) en moeten daarom worden gevalideerd met behulp van orthogonale assays.
Significantie met betrekking tot bestaande methoden Verschillende platformen zijn commercieel beschikbaar voor de screening van proteïne kinases. Een aanpak routinematig gebruikt is bindende testen, die kan worden uitgevoerd met eiwit fragmenten, kinase domein, grotere eiwit fragmenten met het kinase domein en sommige regelgevende regio's, en zelfs volledige-lengte eiwitten. De eiwitten worden meestal uitgedrukt in bacteriële systemen als gevolg van de kosten en eenvoud in de expressie en zuivering protocollen. De interactie tussen de drug van belang en het eiwit wordt vervolgens gemeten met een soort van rapport assay zoals fluorescentie of aanwezigheid van tags, bijvoorbeeld. De belangrijkste beperking van deze reeks benaderingen is het feit dat het eiwit niet noodzakelijkerwijs actief is tijdens de interactie met het medicijn, wat kan resulteren in de identificatie van vals-positieve en vals-negatieve interacties. Eiwit fragmenten zijn bijzonder kwetsbaar voor veranderingen in de conformatie en het gebrek aan activiteit en alle verkregen gegevens moeten worden gevalideerd met behulp van actieve eiwitten, bij voorkeur in de volledige lengte vorm. Een andere beperking van sommige van de platforms is de mogelijkheid om alleen ATP-analogen te schermen, waardoor het totale gebruik ervan wordt beperkt.
Het merendeel van de commercieel beschikbare diensten voor de screening van TKIs met behulp van enzymatische gebaseerde benaderingen maken gebruik van alleen wilde type versies van het kinase van belang, en soms slechts een geselecteerde paar mutanten. Wetende dat de resistentie van de drug is zeer gebruikelijk bij patiënten behandeld met TKI, het is belangrijk om te kunnen meten van de reactie van de drug in verschillende mutanten, voor de selectie van de meest geschikte remmer. Door de natuur van NAPPA is de screening van kinase mutanten eenvoudig en kan gemakkelijk worden bereikt, en de enige vereiste tool is de opname van de kinase mutant in de NAPPA cDNA-collectie, die bijvoorbeeld kan worden gedaan door locatiespecifieke mutagenese.
Toekomstige toepassingen Een van de meest voorkomende vormen van behandeling verstrijkt in kankertherapie met behulp van kinase remmers is de verwerving van mutaties in het doel van de drug tijdens een behandelingskuur. De screening van deze mutanten met betrekking tot hun reactie op kinase remmers is van vitaal belang voor de selectie van de tweede/derde generatie van TKIs om een gepersonaliseerde behandeling voor elke patiënt te bereiken. De drug screening aanpak hier gepresenteerd, biedt een onbevooroordeelde screening platform waarin elke tyrosine kinase remmer kan worden getest tegen een panel van tyrosine kinases aanwezig in het menselijk genoom. Aangezien de op NAPPA-arrays getoonde eiwitten in vitro worden uitgedrukt uit de cDNA die op de dia zijn gedrukt, kan elke Mutante variant eenvoudig worden opgenomen in de cDNA-collectie die op de array wordt weergegeven. De faciliteit waarin de kinase mutanten kunnen worden gegenereerd en uitgedrukt op de array, gecombineerd met de hoge doorvoer kracht van de NAPPA-techniek, biedt een unieke omgeving voor de studie van kinase mutanten en hun respons op drugs, waardoor NAPPA geschikt is voor gepersonaliseerde drug screening, een van de doelstellingen van Precision Medicine.

Proteïne kinases zijn verantwoordelijk voor de fosforylering van hun doelen en kunnen complexe moleculaire trajecten moduleren die veel cellulaire functies beheersen (d.w.z. celproliferatie, differentiatie, celdood en overleving). Deregulering van kinase activiteit wordt geassocieerd met meer dan 400 ziekten, het maken van kinase remmers een van de belangrijkste klassen van geneesmiddelen beschikbaar voor de behandeling van verschillende ziekten, met inbegrip van Cancer, cardiovasculaire en neurologische aandoeningen, alsmede inflammatoire en auto-immuunziekten1,2,3.
Met de komst van precisie geneeskunde, de identificatie van nieuwe therapieën, vooral kinase remmers, hebben een grote aantrekkingskracht farmaceutisch en klinisch. Verschillende benaderingen kunnen worden gebruikt voor de identificatie van mogelijke nieuwe paren van kinase/kinase remmers, met inbegrip van de de Novo ontwerp van kinase remmers en identificatie van nieuwe doelstellingen voor bestaande FDA-goedgekeurde geneesmiddelen. Dit laatste is vooral aantrekkelijk, omdat de tijd en het geld die nodig zijn voor de uitvoering van deze geneesmiddelen in klinieken drastisch worden verlaagd als gevolg van de beschikbaarheid van eerdere klinische proefgegevens. Een canoniek voorbeeld van de herbestemming van een kinase remmer is Imatinib, aanvankelijk ontworpen voor de behandeling van chronische myeloïde leukemie (CML) door de remming van BCR-ABL, die ook met succes kan worden gebruikt voor de behandeling van c-Kit over-uitdrukken gastro-intestinale stromale tumoren (gists)4,5,6,7.
De screening van kinase remmers kan worden uitgevoerd in bindende assays of op enzymatische gebaseerde testen. De eerste klasse van assays richt zich op de interacties van eiwit-geneesmiddelen en kan informatie verschaffen zoals ligatie plaats en affiniteit. Aangezien de activiteit van het kinase op het moment van deze tests onbekend is, kan een aantal interacties worden gemist of ten onrechte worden geïdentificeerd als gevolg van conformationele veranderingen in het eiwit. Aan de andere kant vereisen enzymatische assays dat de eiwit kinasen actief zijn en waardevolle informatie verstrekken over het effect van de remmer op enzymactiviteit, maar dit type screening is over het algemeen meer tijdrovend en duur. Op dit moment zijn beide typen assays commercieel beschikbaar vanuit verschillende bronnen. Ze vertegenwoordigen een betrouwbare optie voor de screening van kinase remmers met enkele beperkingen, waaronder: I) de meeste methoden omvatten het testen van meerdere kinasen afzonderlijk, waardoor de screening van een groot aantal eiwitten kostbaar kan zijn; II) de te testen set kinases is beperkt tot een lijst van vooraf gekozen, wild-type kinasen en verschillende bekende gemuteerde versies van sommige kinasen, waardoor het testen van vele nieuwe gemuteerde isoforms wordt belemmerd.
In deze context zijn eiwit arrays een krachtig platform dat een aantal van de beperkingen die door commercieel verkrijgbare technieken worden voorgesteld, kan overwinnen. Het is geschikt om op enzymatische gebaseerde assays uit te voeren in een screening met hoge doorvoer met behulp van volledige, actieve eiwitten van een willekeurige reeks van belang. De micro arrays kunnen worden gegenereerd door een zelf-geassembleerde benadering zoals NAPPA (nucleïnezuur programmeerbare eiwit array), waarbij eiwitten net op tijd worden uitgedrukt voor de assays, waardoor de kans toeneemt dat die weergegeven op de array inderdaad actief zijn. De op NAPPA getoonde eiwitten worden geproduceerd met behulp van met de mens afgeleide ribosomen en chaperonne eiwitten om de waarschijnlijkheid van natuurlijke vouwen en activiteit te verbeteren.
De eiwitten worden in eerste instantie geprogrammeerd door het afdrukken van cDNAs-codering voor genen van belang gefuseerde met een Capture-tag, samen met een Capture-agent, op het microarray-oppervlak. De eiwitten worden vervolgens geproduceerd op de micro arrays met behulp van een in vitro transcriptie-en vertaalsysteem (IVTT), en de vers uitgedrukte eiwitten worden geïmmobiliseerd op het microarray-oppervlak door de Capture-agent. Uitgedrukt nappa arrays kunnen worden gebruikt voor de studie van de eiwitten weergegeven op de array in een onbevooroordeelde, hoge doorvoer manier8,9.
Eerder werd aangetoond dat eiwitten die worden weergegeven op NAPPA-arrays correct worden gevouwen om te communiceren met bekende partners10; Bovendien werd hun enzymatische activiteit voor het eerst uitgebuit in 2018, toen werd aangetoond dat eiwit kinasen weergegeven op de microarray autophosphorylate11. Tot op heden is nappa methodologie gebruikt voor vele verschillende toepassingen, waaronder biomarker Discovery12,13,14,15,16,17, eiwit-eiwit interacties10,18, substraat identificatie19, en drug screening11. De flexibiliteit is een van de belangrijkste kenmerken van het platform die aanpassing aan elke toepassing mogelijk maakt.
Hier wordt een protocol voor de screening van tyrosine kinase remmers in zelf-geassembleerde NAPPA arrays gepresenteerd. Het platform is geoptimaliseerd voor de weergave van actieve menselijke eiwit kinasen en voor de analyse van proteïne kinase activiteit, met een lage achtergrond en een hoog dynamisch bereik. Onder de wijzigingen die zijn geïmplementeerd om NAPPA te gebruiken voor de screening van kinase remmers zijn: I) veranderingen in de druk chemie, II) de-fosforylering van de proteïne Microarray voorafgaand aan de screening van de kinase remmer, en III) optimalisatie van de detectie van gefosforyleerd eiwitten op de array. Dit protocol is de eerste in zijn soort en biedt unieke informatie over de kinase studie in NAPPA micro arrays.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>364 well plates (for arraying)</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>x7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 &#181;L 96-well collection plate</td>
			<td>Abgene</td>
			<td>AB-0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin device</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>140500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>1.00066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone 99.9%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum seal for 96 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76004-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>80370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>37535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 35</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>BP345-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeepWell Block, case of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-intercalating dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plates</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA77002804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Permeable Seals, box of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass box</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human-based IVTT system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPure Mouse IgG whole molecule</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>31202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (Potassium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4(Potassium phosphate monobasic)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Protein Phosphatase</td>
			<td>new england biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifterslips, 24 x 60 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25X60I24789001LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal 30-slide rack with no handles</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4 (Sodium orthovanadate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOAc (Sodium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410.10 / 740414.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoprep Anion II</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740503.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>79617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution (0.01%)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Phosphatase (Lambda)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs, Inc</td>
			<td>44904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica packets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100489-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single well plate</td>
			<td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (3M, pH 5.5)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB media (Terrific Broth)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T0918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>IBI scientific</td>
			<td>IB70144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td>Maker/model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable chilling incubator</td>
			<td>Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker for bacterial growth</td>
			<td>ATR Multitron shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold with liquid waste trap</td>
			<td>MultiScreenVacuum Manifold 96 well</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well autopippetor/liquid handler</td>
			<td>Genmate or Biomek FX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser</td>
			<td>Wellmate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarrayer</td>
			<td>Genetix QArray2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic hybridization station</td>
			<td>Tecan HS4800 Pro Hybridization Station</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Tecan PowerScanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray data quantification</td>
			<td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays

De screening van kinase remmers is cruciaal voor een beter begrip van de eigenschappen van een medicijn en voor de identificatie van potentieel nieuwe doelen met klinische implicaties. Er zijn verschillende methodologieën gemeld om deze screening te volbrengen. Echter, elk heeft zijn eigen beperkingen (bijv. de screening van alleen ATP-analogen, beperking tot het gebruik van gezuiverde kinase domeinen, aanzienlijke kosten in verband met het testen van meer dan een paar kinases tegelijk, en gebrek aan flexibiliteit bij het screenen van eiwit kinasen met nieuwe mutaties). Hier, een nieuw protocol dat enkele van deze beperkingen overkomt en kan worden gebruikt voor de onbevooroordeelde screening van kinase remmers wordt gepresenteerd. Een sterkte van deze methode is de mogelijkheid om te vergelijken van de activiteit van kinase remmers over meerdere eiwitten, hetzij tussen verschillende kinases of verschillende varianten van hetzelfde kinase. Zelf-geassembleerde eiwit micro arrays gegenereerd door de expressie van eiwit kinases door een mens gebaseerde in vitro transcriptie en vertaalsysteem (IVTT) worden gebruikt. De eiwitten die op de microarray worden weergegeven zijn actief, waardoor de effecten van kinase remmers kunnen worden gemeten. De volgende procedure beschrijft de stappen van het protocol in detail, van de microarray generatie en screening naar de gegevensanalyse.

Zelf-geassembleerde NAPPA-micro arrays bieden een solide platform dat kan worden gebruikt voor vele verschillende toepassingen, waaronder biomarkerdetectie, eiwit-eiwit interacties, substraat identificatie en geneesmiddelen screening10,11 ,12,13,14,15,16,17,18,19,20.
De algemene methodologie voor de studie van kinase activiteit en screening van tyrosine kinases-remmers op NAPPA-micro arrays wordt schematisch weergegeven in Figuur 1. Ten eerste worden NAPPA micro arrays gegenereerd door de immobilisatie van cDNA en Capture agent op de gecoate micro arrays. De Cdna's worden vervolgens gebruikt als een sjabloon voor de transcriptie en vertaling van eiwitten, met behulp van een mens gebaseerde IVTT-systeem, en de nieuw gesynthetiseerde eiwitten worden geïmmobiliseerd door de Capture agent9. De kwaliteit van de gedrukte Microarray kan worden bewaakt door het meten van DNA-niveaus (het bevestigen van consistent printen) of eiwit dat op de array wordt weergegeven (ter bevestiging van de eiwit expressie en-opname; Figuur 1). Om het achtergrond signaal te verlagen en het dynamische bereik van het experiment te vergroten, worden de micro arrays behandeld met 1) Lambda fosfatase om fosforylering van ser/thr/Tyr-residuen te verwijderen, vervolgens met 2) DNase om de chemie ter plaatse te vereenvoudigen en achtergrond (Figuur 1).
De volgende stap is de autofosforylatie reactie, waarbij micro arrays worden geïnineerd met kinase buffer in de afwezigheid van ATP (negatieve controle array, aangeduid als gedefosforyleerd micro arrays), en kinase buffer wordt aangevuld met ATP (positieve controle, aangeduid als "autophosphorylated arrays") of ATP + DMSO (voertuig controle). Er moet worden benadrukt dat tijdens deze stap geen kinase wordt toegevoegd; Daarom wordt de intrinsieke activiteit van elk kinase dat op de microarray wordt weergegeven, gekwantificeerd door meting van zijn fosforylatie niveaus met behulp van een pan anti-fosfostyrosine-antilichaam gevolgd door een Cy3-labbeled secundair antilichaam (Figuur 1).
De kwaliteitscontrole van de NAPPA-kinase arrays met een panel van menselijke proteïne kinases, gedrukt in quadruplicaat, wordt weergegeven in Figuur 2. De niveaus van geïmmobiliseerd DNA werden gemeten door DNA-kleuring en het toonde een gelijkmatig signaal over de Microarray, wat suggereert dat de hoeveelheid DNA gedrukt op de array uniform was. Het is ook mogelijk om verschillende functies te observeren zonder enige DNA-kleuring. Deze functies corresponderen met enkele besturingselementen waarin DNA werd weggelaten uit de drukmix [d.w.z. lege vlekken (niets werd gedrukt), watervlekken, gezuiverde IgG-spot (poly-lysine, als en gezuiverde IgG), alleen printen mix (complete Printing mix: poly-lysine Plus als-en Anti-Flag-antilichamen, zonder DNA)]. De op de NAPPA-kinase micro arrays getoonde niveaus van eiwitten werden na de IVTT-reactie beoordeeld met anti-tagantilichamen.
Voor de kinase screening, vlag werd gebruikt als de tag van de keuze en het niveau van eiwit weergegeven op de microarray werd gemeten met behulp van een Anti-Flag-antilichaam. Zoals getoond, de meerderheid van de vlekken met cDNA met succes weergegeven detecteerbare niveaus van eiwitten. Sommige van de controle spots zonder cDNA onthulde ook het signaal met het Anti-Flag antilichaam: IgG spot (gebruikt om de activiteit van het secundaire antilichaam te detecteren) en lege Vector vlekken (cDNA-codes voor de tag alleen) (Figuur 2). NAPPA-kinase-micro arrays vertoonden een goede reproduceerbaarheid tussen de dia's, met de correlatie tussen de niveaus van eiwit weergave en verschillende druk partijen hoger dan 0,88 (figuur 2). Binnen dezelfde batch was de correlatie nog hoger, dicht bij 0,92 (gegevens niet weergegeven).
Volgende, de kinase autofosforylatie activiteit van de eiwitten weergegeven op de array werd gemeten met behulp van anti-fosho-tyrosine antilichamen (Figuur 3). Eiwit weergegeven op de array toonde hoge niveaus van eiwit fosforylering na expressie (Figuur 3, links), die kan worden veroorzaakt door intrinsieke kinase activiteit van het eiwit weergegeven op de array of door actieve kinases aanwezig in de ivtt mix. Deze fosforylering werd volledig verwijderd met de Lambda fosfatase behandeling en deze micro arrays werden gebruikt voor de kinase assays. Na defosforylering, autofosforylatie reacties uitgevoerd zonder ATP toonde geen significante niveaus van fosforylering, zoals verwacht, terwijl micro arrays geïnincubeerd met kinase buffer in de aanwezigheid van ATP toonde eiwit fosforylering zo snel als 15 min ( Figuur 3). Voor de geneesmiddelen screening werd de kinase activiteit gemeten na 60 min van de autofosforylatie reactie om het aantal geteste kinases te maximaliseren.
De vergelijking tussen micro arrays waarbij de fosforylatie spiegels direct na de eiwit expressie werden gemeten (Figuur 3, links) en na 60 min van de autopfosforylatie reactie (Figuur 3, rechts) toonden: i) eiwitten die alleen fosforyleerd zijn na uitdrukking, suggereren dat ze exogenously fosforyleerd kunnen zijn door eiwitten die aanwezig zijn op de IVTT-mix, maar niet autophosphoryated; II) eiwit fosforyleerd pas na de autofosforylatie reactie, suggereren deze eiwitten waren niet actief na eiwit expressie en vereiste co-factoren aanwezig in de kinase buffer actief te zijn; of III) eiwit fosforyleerd op beide matrices, wat suggereert dat ze actief waren in beide instellingen (Figuur 3).
Als voorbeeld van de resultaten verkregen voor de screening van tyrosine kinase remmers op NAPPA-kinase arrays werden drie kinases remmers met een uitgesproken selectiviteit over eiwit kinasen gebruikt: staurosporine, Imatinib en ibrutinib. Voor alle screenings werden gedefosforyleerd nappa-micro arrays geïnincubeerd met toenemende concentraties van TKI (variërend van 100 nm tot 10 uM) tijdens de autofosforylatie-reactie. De eerste TKI getest was staurosporine, een wereldwijde proteïnekinaseremmer, dat toonde krachtige kinase remming op de microarray over vrijwel alle kinasen getest11.
Vervolgens werd Imatinib getest, een ABL-en c-Kit-remmer gebruikt voor de behandeling van chronische myeloïde leukemie en gastro-intestinale stromale tumoren4,5,6,7. Op NAPPA-kinase arrays toonde Imatinib een significante afname in Abl1 en BCR-Abl1 activiteit, terwijl andere kinasen grotendeels onaangetast bleven (figuur 4a). De kwantificering van de gegevens voor de kinase activiteit werd genormaliseerd tegen de gedefosforyleerd array en weergegeven als een percentage van de positieve controle Microarray (alleen voertuig). Gegevens voor TNK2 (niet-relevant kinase), Abl1 en BCR-Abl1 worden weergegeven in figuur 4b. Zoals verwacht toonde Imatinib selectieve remming naar Abl1 en BCR-ABl1. De gegevens voor de c-Kit waren onduidelijk vanwege het gebrek aan activiteit op de positieve controle-arrays.
Tot slot, ibrutinib, een FDA-goedgekeurde covalente remmer van Bruton tyrosine kinase (BTK), werd getest. Ibrutinib wordt momenteel gebruikt bij de behandeling van verschillende bloedgerelateerde kankers met overactieve BTK, waaronder chronische lymfatische leukemie (CLL), mantelcellymfoom en waldenström's Waldenström21,22. Figuur 4cis representatief voor de typische resultaten die zijn verkregen voor de screening van ibrutinib. De kinase activiteit van ABL1 (niet-relevant kinase) en BTK (canonieke doel) en ERBB4 (potentieel nieuw doelwit) wordt weergegeven in figuur 4D. De gegevens suggereren ERBB4 kan worden geremd door ibrutinib in een dosis specifieke manier. Deze remming werd bevestigd in vitro en in cel gebaseerde assays11, het demonstreren van de kracht van dit platform.
Samen, de gegevens suggereren dat NAPPA-kinase Microarray platform kan worden gebruikt voor de onbevooroordeelde screening van TK-remmers. Bovendien is de screening snel en kan deze gemakkelijk worden aangepast om elke variatie van de eiwit kinases van belang te omvatten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg"> Figuur 1: schematische weergave van kwaliteitscontrole en screening van tyrosinekinaseremmers in NAPPA-arrays. NAPPA-arrays worden bedrukt met cDNA-codering voor het eiwit van de belangstelling gefuseerd met een tag en een Capture-antilichaam. Tijdens de in vitro transcriptie-en vertalings reactie (IVTT) worden de gesynthetiseerde eiwitten op het microarray-oppervlak door de tag opgevangen door het Capture-antilichaam. De kwaliteitscontrole (QC) van de arrays wordt uitgevoerd door de meting van de niveaus van het DNA gedrukt op de glijbaan, met behulp van een fluorescerende DNA-intercalating kleurstof, en de niveaus van eiwit weergegeven op de array met behulp van tag-specifieke antilichamen. Voor de kinase screening worden de micro arrays behandeld met DNase en fosfatase, na de IVTT-reactie, om het gedrukte DNA en alle fosforylering te verwijderen die zich tijdens de eiwitsynthese kunnen hebben voorgedaan. De gedefosforyleerd arrays zijn nu klaar om te worden gebruikt voor het medicijn scherm. Voor elke test worden routinematig drie sets van controles gebruikt: (I) gedefosforyleerd matrices, waarbij de autofosforylatie reactie zonder ATP wordt uitgevoerd; II) autopfosforylated micro arrays, waarbij de autophosphorylatie reactie wordt uitgevoerd in aanwezigheid van ATP; en (III) DMSO-behandelde array (voertuig), waarin de autofosforylatie-reactie wordt uitgevoerd met ATP en DMSO. De dia's behandeld met verschillende concentraties van kinase remmers volgen exact hetzelfde protocol dat wordt gebruikt voor de DMSO behandelde arrays. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg"> Figuur 2: representatieve resultaten van kwaliteitscontrole voor zelf-geassembleerde NAPPA-kinase arrays. DNA-gehalte gemeten door een fluorescerende DNA-intercalciërende kleurstof (links) en eiwit niveaus weergegeven op de Microarray, gemeten door Anti-Flag-antilichamen (midden) worden weergegeven. Aan de rechterkant is een correlatie plot van de niveaus van eiwit weergegeven op twee NAPPA-kinase arrays gedrukt in afzonderlijke batches. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg"> Figuur 3: representatieve resultaten van de kinase activiteit in NAPPA-kinase arrays. Micro arrays die eiwit kinasen in quadruplicaat weergeven, werden gebruikt om proteïne kinase activiteit op de array te bestuderen door de meting van eiwit fosforylering met anti-pTyr antilichamen, gevolgd door Cy3-gelabeld anti-muis antilichaam. Control arrays zonder fosfatase/DNase behandeling en zonder ATP tijdens de autofosforylatie reactie werden gebruikt voor het meten van de achtergrond fosforylering na eiwit expressie (post-expressie). De resterende micro arrays werden behandeld met fosfatase/DNA, en de autofosforylatie reactie werd uitgevoerd zonder ATP (gedefosforyleerd Microarray, negatieve controle) of met ATP (autophosphorylated micro arrays). Voor de autophosphoryated micro arrays werd de autofosforylatie reactie uitgevoerd gedurende 15 min, 30 min, 45 min, of 60 min, zoals afgebeeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg"> Figuur 4: representatieve gegevens van tyrosine kinase scherm op NAPPA-kinase arrays. (A) fosfatase/DNase behandelde nappa-kinase arrays werden geïnineerd in toenemende concentraties van Imatinib tijdens de autophosphorylatie reactie en de kinase activiteit was maatregel met anti-fosho-Tyr antilichaam. B) kwantificering van de kinase activiteit waargenomen op nappa-kinase arrays blootgesteld aan Imatinib. Gegevens werden genormaliseerd tegen het signaal van de negatieve controle matrices (gedefosforyleerd) en het wordt weergegeven als een percentage van de positieve controle arrays (autophosporylation-reactie uitgevoerd in de aanwezigheid van DMSO). Vergelijkbare gegevens worden getoond voor de screening van ibrutinib (C, D). Dit cijfer is gewijzigd van Rauf et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullend bestand 1. Alternatief protocol voor screening van tyrosine kinase remmers in NAPPA arrays met behulp van een geautomatiseerd hybridisatie station. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Een gedetailleerd protocol voor het genereren van zelf-geassembleerde humane eiwit arrays voor de screening van kinase remmers wordt gepresenteerd.

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

NAPPA is een krachtig eiwitmicroarrayplatform dat kan worden gebruikt voor de studie van eiwitactiviteit en functie op een onbevooroordeelde hoge doorvoerwijze. De eiwitten die op NAPPA worden weergegeven, worden geproduceerd in een menselijk expressiesysteem met menselijke afgeleide ribosomen en chaperonnes om de kans op natuurlijke vouwen en activiteit te verbeteren. Het gebruik van NAPPA-arrays voor de screening van kinaseremmers biedt een nieuw platform voor de test van nieuwe geneesmiddelen en klinisch relevante kinasemutaties.Eiwitmicroarrays gegenereerd door NAPPA-methodologie kan worden gebruikt voor vele verschillende toepassingen, waaronder biomarkerdetectie, eiwit-eiwitinteracties, substraatidentificatie en geneesmiddelenscreening. Voer onderweg stappen voor kwaliteitscontrole uit. Test de kwaliteit van je DNA-preparaat, de DNA-microarray en de eiwitmicroarray.Als in een stap de kwaliteit niet goed is, gewoon opnieuw beginnen. Het aantonen van de procedure zal Lisa Miller zijn, een technicus in mijn laboratorium. Ter voorbereiding van bacteriële groei voor in huis hoge doorvoer mini-prep, eerst inenten de bacteriën in de vijzel plaat in een 96 goed formaat, en laat het groeien voor 16 uur.Vul de volgende dag elke put van de diepe putplaat met 1,5 milliliter geweldig bouillonmedium, aangevuld met antilichaamampicilline. Het antilichaam is afhankelijk van de selectiemarker op de plasmide. Steriliseer vervolgens een 96-pins apparaat met 80% ethanol en vlam.Gebruik het steriele 96-pins apparaat om kolonies te plukken van de 's nachts geïncubeerde agarplaat en onderdompel in de putten van de diepe putplaat om de cultuur in te enten. Bedek het blok met een gas-permeabele afdichting en incubeer op een shaker voor 22 tot 24 uur bij 37 graden Celsius, en 300 tot 800 rpm. Daarna, pellet culturen en resuspend de culturen volgens het manuscript.Lyse bacteriën door het toevoegen van 200 microliters van oplossing twee in elke put, verzegelen de plaat met een aluminium afdichting, en omkeren vijf keer. De cellen precies vijf minuten uitbroeden. Om de oplossing te neutraliseren, voeg 200 microliter van oplossing drie, verzegel de plaat met een aluminium afdichting en omkeren vijf keer.Draai vervolgens de plaat op 3800 G, vier graden Celsius, gedurende 30 minuten om het lysaat supernatant te wissen. Om anion uitwisseling hars platen voor te bereiden, eerst, meng de anion uitwisseling drijfmest, en giet de drijfmest in een glazen trog. Stapel filterplaten op een diepe putplaat om als afvalinzamelvat op te treden.Vervolgens, met behulp van breed karton P1000 tips, meng de drijfmest, en breng 450 microliter van de drijfmest in elke put van de filterplaten. Centrifugeren en gooi de doorstroom weg. Nu, breng de lysate supernatants naar de stapel hars plaat en diepe put blok.Draai de gestapelde platen gedurende vijf minuten op 30 keer G met langzaamste opritsnelheid en gooi de flow-through weg. Om de kolom te wassen, voeg 400 microliters van oplossing N3 wasbuffer aan elke put. Breng de harsplaat over op vacuümspruitstuk om de wasbuffer te verwijderen.Herhaal de wasstap drie keer en verwijder vervolgens de resterende wasmachinebuffer met een korte vijf minuten spin op 30 keer G.To het DNA te verwijderen, plaats de harsplaat op een schone 800 microliter verzamelplaat. Voeg 300 microliter oplossing N5 toe aan elke put en laat het tien minuten op kamertemperatuur zitten. Draai vervolgens vijf minuten lang de gestapelde platen op 20 keer G met een langzame opritsnelheid tot 233 keer G gedurende een minuut.Bewaar platen op negatieve 20 graden Celsius voorafgaand aan gebruik. Plaats eerst de glijbanen op een rek en dompel de dia's onder in een glazen reservoir met de coatingoplossing van 2%aminosilane reagens in aceton. Rock de glijbanen gedurende 15 minuten.Spoel vervolgens de glijbanen in aceton, gevolgd door een laatste spoeling in water. Droog vervolgens de glijbanen met druklucht. Blazen op hen uit alle hoeken voor ongeveer drie minuten totdat alle waterdruppels zijn verwijderd.Bewaar de gecoate glijbanen op kamertemperatuur op een metalen rek in een goed afgesloten doos. Nu, ga verder met het neerslaan van het DNA zoals beschreven in het manuscript. Dan, resuspend de DNA-pellet in 20 microliters van ultrazuiver water en schudden bij 1000 rpm gedurende twee uur.Om arraymonsters voor te bereiden, voeg je 10 microliters vers bereide drukmix toe die het antilichaam, crosslinker en polylysine aan elk DNA-monster bevat. Verzegel platen met aluminiumfolie en schud bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten bij 1000 rpm. Bewaar de platen 's nachts op vier graden Celsius.Op de drukdag, kort vortex en draai de platen. Breng 28 microliter van elk monster over naar een 384 putplaat. Plaats de aminosilane gecoate glijbanen en de 384 putplaat, op het arrayerdek, en start het microarray printprogramma.Wanneer het afdrukken is gedaan, etiketteert u de microarrays. De microarrays kunnen maanden worden bewaard tot verder gebruik. Om de niveaus van DNA te meten, plaats de dia's in een pipetdoos en blokkeer ze met 50 milliliter blokkeerbuffer.Broed de glijbanen op een schommelende shaker bij kamertemperatuur gedurende een uur. Gooi vervolgens de oplossing weg en voeg 20 milliliter blokkeerbuffer en 33 microliter fluorescerende DNA-intercalating kleurstof toe. Incubeer gedurende 15 minuten met agitatie.Na de incubatie is voorbij, snel spoelen de glijbanen met ultra zuiver water en droog met druklucht. De microarrays zijn klaar om gescand te worden. Om de microarrays uit te drukken, blokkeer je de dia's zoals eerder getoond en spoel ze vervolgens af met ultra zuiver water en droog je met gefilterde perslucht.Bevestig een afdichtingspakking aan elke glijbaan. Voeg 130 milliliter in vitro transcriptie en vertaling mix op de dia's, en zachtjes masseren de afdichting pakkingen, zodat de in vitro transcriptie en vertaling mix verspreidt zich en bestrijkt het hele gebied van de array zonder bubbels. Breng de kleine ronde poortafdichtingen aan op beide poorten.Incubeer gedurende 90 minuten bij 30 graden Celsius voor eiwitexpressie, gevolgd door 30 minuten bij 15 graden Celsius voor immobilisatie van het query-eiwit. Verwijder vervolgens de pakking, was de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten elk in 15 milliliter TBST met melk, en blok in dezelfde oplossing voor een uur. Voor de detectie van de eiwitten op de array, verwijder de TBST met melk, plaats de dia's op een roosterplaat en breng 600 microliter van primair antilichaam, muisanti-vlag, verdund een tot tweehonderd, en 1x TBST aangevuld met 5% melk.Een uur lang uitbroeden bij kamertemperatuur. Was de glijbanen met 50 milliliter 1x TBST en 5% melk op de schommelende shaker drie keer gedurende vijf minuten per stuk. Herhaal de procedure voor het secundaire antilichaam.Na de een uur incubatie is voorbij, was de dia's met 1x TBST op de schommelende shaker drie keer gedurende vijf minuten elk. Spoel vervolgens snel de glijbanen af met ultra zuiver water en droog met druklucht. De dia's zijn klaar om te worden gescand.Om de fosfatase en DNase behandeling uit te voeren, was en blokkeer de uitgedrukte dia's met TBST aangevuld met 3%BSA zoals beschreven in het manuscript. Plaats vervolgens de glijbanen op een rasterplaat en breng 200 microliter van fosfatase DNase-oplossing aan. Plaats een microarray cover slip op de top om verdamping te voorkomen.Incubeer op 30 graden Celsius gedurende een uur en 30 minuten in de oven. Dan, was glijbanen met 1x TBST en 0,2 molaire natriumchloride op de schommelende shaker drie keer gedurende vijf minuten elk. Om de behandeling van het geneesmiddel en kinasereactie uit te voeren, plaatst u de dia's op de rasterplaat en past u 200 microliters van de kinaseoplossing van geneesmiddelen aan.Plaats een cover slip op de top om verdamping te voorkomen. Een uur lang uitbroeden bij 30 graden Celsius in de oven. De sleutel tot reproduceerbare gegevens is consistente incubatietijd tussen dia's.Dit is vooral belangrijk tijdens de kinase reactie. De tijd die nodig is om elke dia te verwerken, moet worden verantwoord. Daarna, wasg glijbanen met 1x TBST en 0,2 molaire natriumchloride op de schommelende shaker drie keer gedurende vijf minuten elk.Herhaal eiwitdetectie met als primair antilichaam fosfotyrosineantilichaam verdund een tot 100 in TBST, aangevuld met 3%runderserum albumine. Gebruik 1x TBST en 3% runderserum albumine voor het wassen na de incubatie met primair antilichaam, en TBST voor wasbeurten na incubaties met secundair antilichaam. Wassen en drogen zoals voorheen.Laad de microarrays in het diahouderblad voor het verwerven van afbeeldingen. Laad het magazijn in de microarray scanner. Scan alle microarrays met de geoptimaliseerde instellingen en vergeet niet om de automatische winst uit te schakelen bij het vergelijken van afbeeldingen over experimenten.Breng de beelden over naar een kwantificeringssoftware, lijn het raster uit met de vlekken en kwantificeer de signaalintensiteit van elke functie op de microarray. Ga verder met statistische analyse. In deze studie toonde de microarray de meeste vlekken die complementair DNA bevatten met succes detecteerbare niveaus van eiwitten.NAPPA kinase microarrays toonde een goede reproduceerbaarheid onder dia's, met de correlatie van de niveaus van eiwit weer te geven tussen verschillende printpartijen hoger dan 0,88. Representatieve resultaten van kinaseactiviteit in NAPPA kinase arrays toonden een hoog niveau van eiwitfos fosforylatie na expressie. De vergelijking tussen microarrays waarbij de fosforylatieniveaus direct na de behandeling met fosfatase werden gemeten en na 60 minuten autofosfoloatiereactie, suggereert de aanwezigheid van actieve eiwitkinasen op de array.Op NAPPA kinase arrays vertoonde imatinib een aanzienlijke daling van de ABL1- en BCR-ABL1-activiteit, terwijl andere kinases meestal onaangetast bleven. De kinaseactiviteit normaliseerde tegen de dephosphorylated array en vertegenwoordigde als een percentage van de positieve controlemicroarray toonde selectieve remming van imatinib naar ABL1 en BCR-ABL1. Typische resultaten verkregen voor de ibrutinib screening toonde de kinase activiteit van ABL1 niet-relevante kinase is onaangetast.BTK canonieke doelstelling, en ERBB4 potentiële nieuwe doelstelling, Toonde verminderde activiteit in de aanwezigheid van ibrutinib. De gegevens suggereren ERBB4 kan worden geremd door ibrutinib in een dosis-specifieke manier. Het succes van eiwitmicroarray screenings zijn sterk afhankelijk van de kwaliteit van de microarray zelf.Verschillende positieve en negatieve controlefuncties moeten worden gebruikt om een goede gegevensanalyse mogelijk te maken. NAPPA kinase test is een screening platform, en als zodanig, de verkregen gegevens moeten worden gevalideerd in follow-up testen, die kunnen omvatten in vitro kinase testen, of cel gebaseerde tests. Aangezien ons protocol begint met cDNA, kan elke kinase mutatie of variatie gemakkelijk worden opgenomen in de microarray en bestudeerd in hoge doorvoer.Tijdens de voorbereiding van de anionuitwisselingsdrijfmest en platen wordt aanbevolen maskers te gebruiken om mogelijke inademing van de harsdeeltjes te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de Parkinson Geassocieerde LRRK2 Kinase Pathway door de beoordeling van Rab10 fosforylatie

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

De afleiding van eiwitkristallen met I3C met behulp van Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...