Name: kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

Les auteurs tient à remercier tout le monde au laboratoire de LaBaer pour leur aide et leurs critiques lors du développement du projet. Ce projet a été soutenu par la subvention des NIH U01CA117374, U01AI077883 et Virginia G. Piper Foundation.

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Modifications et dépannage Au cours de la phase d'optimisation de l'étude de l'activité kinase sur les tableaux NAPPA, l'une des principales sources de fond et de faible plage dynamique observée était le BSA utilisé sur le mélange d'impression. BSA fournissait les principales amines nécessaires pour croiser la surface de l'aminosilane et piégeait l'ADN et l'anticorps de capture sur place. Cependant, le BSA est fortement phosphorylé, ce qui rend difficile la détection du signal d'autophosphorylation sur le tableau au-dessus du bruit de fond. Pour résoudre ce problème, plusieurs alternatives pour BSA dans le mélange d'impression ont été testées, et la polylysine a été identifiée comme bon substitut. La polylysine n'a aucun site de phosphorylation; par conséquent, l'arrière-plan des tableaux non exprimés est très minime. De plus, les microréseaux imprimés en polylysine sont reproductibles et présentent de bons niveaux de protéines (figure 2).
La modification critique suivante effectuée sur l'analyse standard de NAPPA était l'addition d'une étape de traitement de Phosphatase/DNase. Le traitement des microréseaux avec de la phosphatase permet d'éliminer toute phosphorylation qui s'est produite dans le mélange IVTT lors de la synthèse et de la capture des protéines (Figure 3). La source de cette phosphorylation pourrait provenir de l'activité intrinsèque d'autophosphorylation ou de l'activité des kinases présentes dans le mélange IVTT. L'élimination de toute post-expression de phosphorylation a permis d'identifier facilement les kinases qui sont actives et peuvent subir une autophosphorylation (figure 3).
Étapes critiques du protocole NAPPA est une technologie robuste, mais comme prévu, il ya plusieurs étapes critiques. La première est l'acquisition d'ADN de haute qualité dans la concentration appropriée. L'utilisation d'ADN de mauvaise qualité ou en faibles concentrations générera des microréseaux de mauvaise qualité, plusieurs caractéristiques n'étant pas exprimées et affichées dans les niveaux appropriés, ce qui diminuera le nombre de protéines analysées sur le tableau. La deuxième étape critique est l'expression des protéines sur le microarray. L'utilisation d'un système IVTT qui exprimera des niveaux élevés de protéines fonctionnelles est essentielle pour étudier l'activité kinase sur le tableau.
La prochaine étape critique sur le dépistage DelI est la façon dont les microréseaux sont gérés. Les microréseaux ne doivent pas sécher pendant n'importe quelle étape du protocole, et la manipulation douce est recommandée pour empêcher des rayures qui peuvent augmenter le signal de fond. Étant donné que les tableaux de toute l'expérience seront comparés les uns aux autres, il est important de s'assurer que chaque étape d'incubation est même sur toutes les diapositives. Par exemple, le temps nécessaire pour effectuer une étape dans un seul tableau doit être pris en considération lorsqu'un lot de 20 tableaux est traité pour prévenir les différences dans la durée d'incubation entre les tableaux.
Enfin, la conception de l'expérience et l'inclusion de contrôles positifs et négatifs sont essentielles pour le contrôle de la qualité et l'analyse des données. La première série de contrôles sont celles imprimées dans chaque tableau et comprend des contrôles négatifs [c.-à-d. des taches vides (sans aucun matériau imprimé), de l'eau ou un vecteur vide (n'exprimez que l'étiquette)], ainsi qu'un contrôle positif (c.-à-d. IgG purifié, qui est détecté par le anticorps secondaires et est inerte à l'altération des niveaux de phosphorylation). Collectivement, ils mesurent les niveaux de fond du microarray, le report possible lors de l'impression et l'intensité du signal de la méthode de détection.
La prochaine série de contrôles sont les contrôles de dépistage des médicaments et comprennent les microréseaux déphosphorylés et autophosphorylés (en présence ou en absence de DMSO). Comme mentionné précédemment, le microarray déphosphorylated mesure le niveau de phosphorylation après le traitement de phosphatase et donc le niveau de base pour toutes les autres expériences. Plus le niveau de base est bas, plus la plage dynamique des essais est élevée. Les tableaux autophosphorés présentent les niveaux maximums de phosphorylation de tous les tableaux et le signal doit être fort et clair. Il est utilisé pour l'analyse des données, mais aussi comme un contrôle que toutes les réactions ont été effectuées avec succès sur le tableau.
Limites de la technique À partir de maintenant, l'une des limites du dépistage des médicaments présenté ici est sa capacité à dépister uniquement les kinases protéiques qui peuvent être autophosphorylated. Une façon possible de surmonter cela est d'imprimer un kinase et substrat connu au même endroit. La co-impression de l'ADN pour deux protéines distinctes a été accomplie avec succès15, suggérant la faisabilité de cette approche. En outre, la protéine affichée sur le tableau peut ne pas être pliée correctement résultant en une protéine inactive. L'utilisation du système d'expression basé sur l'homme a apporté une amélioration significative de l'activité kinase mesurée sur le tableau; cependant, certaines protéines ne peuvent toujours pas être analysées sur le tableau en raison de son inactivité.
Une deuxième limitation est la mesure de la phosphorylation à l'aide d'un anticorps pan antiphospho-tyr. En dépit de sa non-spécificité concernant le motif du site de phosphorylation, toutes les phosphorylations mesurées se sont produites sur des résidus de tyrosine, laissant derrière eux des serines et des thréonines et leurs kinases respectives. À ce jour, plus de 10 anticorps pan phospho-Ser/Thr ont été testés sans succès, malgré plusieurs tentatives pour optimiser les conditions d'incubation et de lavage. Un nouveau système de détection indépendant des anticorps peut être la meilleure option pour augmenter le nombre de kinases protéiques qui peuvent être dépistées pour l'inhibition des médicaments. Dans ce contexte, quelques options sont disponibles, y compris la radioactivité ou des approches chimiques comme la conjugaison par clic. Une série d'optimisations est nécessaire pour minimiser le signal d'arrière-plan et fournir une bonne plage dynamique pour les essais.
La troisième limitation est l'acquisition de clones d'ADNc à imprimer sur le tableau. Les clones d'ADNc peuvent être générés à l'aide de n'importe quelle technique de clonage, y compris des systèmes de recombinaison spécifiques au site, tels que Creator ou Gateway23. Une autre option est d'acheter les clones de la bibliothèque DNAsu, trouvé à lt;https://dnasu.org/DNASU/Home.do-gt;, où plus de 17.000 clones cDNAs, y compris l'ensemble du kinome humain, est facilement disponible pour être utilisé pour la construction de tableaux NAPPA24 .
La quatrième limite est que tous les laboratoires ne sont pas équipés d'équipements appropriés pour fabriquer et filtrer leurs propres tableaux NAPPA. Ce protocole fournit des méthodes alternatives pour générer l'ADN à imprimer sur le microréseau, sans avoir besoin d'équipement à haut débit, et des protocoles pour effectuer manuellement toutes les étapes d'hybridation. Cependant, l'accès à un scanner de tableau et de microarray est toujours nécessaire. Une option pour surmonter ce problème est d'utiliser le service de base NAPPA et l'installation, trouvé à lt;http://nappaproteinarray.org / 'gt;, qui distribue personnalisé salan iemn à un prix académique à but non lucratif. Enfin, comme de toute méthode de dépistage, les données obtenues sur les tableaux sont susceptibles d'être des artefacts (positifs ou négatifs) et devraient donc être validées à l'aide d'analyses orthogonales.
Importance par rapport aux méthodes existantes Plusieurs plates-formes sont disponibles dans le commerce pour le dépistage des kinases protéiques. Une approche couramment utilisée est l'analyse de liaison, qui peut être effectuée avec des fragments de protéines, domaine kinase, de plus grands fragments de protéines avec le domaine kinase et certaines régions de régulation, et même des protéines pleine longueur. Les protéines sont généralement exprimées dans les systèmes bactériens en raison du coût et de la simplicité dans les protocoles d'expression et de purification. L'interaction entre le médicament d'intérêt et la protéine est ensuite mesurée avec un certain type d'évaluation de rapport comme la fluorescence ou la présence d'étiquettes, par exemple. La principale limitation de cet ensemble d'approches est le fait que la protéine n'est pas nécessairement active lors de l'interaction avec le médicament, ce qui peut entraîner l'identification de fausses interactions positives et fausses et négatives. Les fragments de protéines sont particulièrement vulnérables aux changements dans la conformation et le manque d'activité et toutes les données obtenues doivent être validées à l'aide de protéines actives, de préférence sous leur forme intégrale. Une autre limitation de certaines plates-formes est la capacité de filtrer uniquement les analogues ATP, limitant son utilisation globale.
La plupart des services disponibles dans le commerce pour le dépistage des ITC à l'aide d'approches enzymatiques n'utilisent que des versions sauvages de la kinase d'intérêt, et parfois seulement quelques mutants sélectionnés. Sachant que la résistance aux médicaments est très fréquente chez les patients traités par TKI, il est important d'être en mesure de mesurer la réponse médicamentelle chez différents mutants, pour la sélection de l'inhibiteur le plus approprié. En raison de la nature de nAPPA, le criblage des mutants de kinase est simple et peut être facilement accompli, et le seul outil exigé est l'incorporation du mutant de kinase dans la collection de cDNA de NAPPA, qui peut être faite par mutagénèse spécifique au site, par exemple.
Applications futures L'une des formes les plus courantes de traitement s'écoule ntlapse dans le traitement du cancer à l'aide d'inhibiteurs de la kinase est l'acquisition de mutations dans la cible médicamenteuse au cours d'un cours de traitement. Le dépistage de ces mutants concernant leur réponse aux inhibiteurs de la kinase est d'une importance vitale pour la sélection de la deuxième/troisième génération de TKIs afin d'obtenir un traitement personnalisé pour chaque patient. L'approche de dépistage des médicaments présentée ici, fournit une plate-forme de dépistage impartiale dans laquelle tout inhibiteur de la tyrosine kinase peut être testé contre un panel de kinases tyrosine présents dans le génome humain. Étant donné que les protéines affichées sur les tableaux NAPPA sont exprimées in vitro à partir de l'ADNc imprimé sur la diapositive, n'importe quelle variante mutante peut facilement être incorporée dans la collection d'ADNc pour être affichée sur le tableau. L'installation dans laquelle les mutants kinase peuvent être générés et exprimés sur le tableau, combiné avec la puissance à haut débit de la technique NAPPA, fournit un environnement unique pour l'étude des mutants kinase et leur réponse aux médicaments, ce qui rend NAPPA approprié pour dépistage personnalisé des médicaments, l'un des objectifs de la médecine de précision.

Les kinases protéiques sont responsables de la phosphorylation de leurs cibles et peuvent moduler des voies moléculaires complexes qui contrôlent de nombreuses fonctions cellulaires (c.-à-d. prolifération cellulaire, différenciation, mort cellulaire et survie). La déréglementation de l'activité kinase est associée à plus de 400 maladies, faisant des inhibiteurs de la kinase l'une des principales classes de médicaments disponibles pour le traitement de plusieurs maladies, y compris le cancer, les troubles cardiovasculaires et neurologiques ainsi que les inflammatoires et les maladies auto-immunes1,2,3.
Avec l'avènement de la médecine de précision, l'identification de nouvelles thérapies, en particulier les inhibiteurs de la kinase, ont un grand attrait pharmaceutique et clinique. Plusieurs approches peuvent être utilisées pour l'identification de nouvelles paires possibles d'inhibiteurs de la kinase/kinase, y compris la conception de novo des inhibiteurs de la kinase et l'identification de nouvelles cibles pour les médicaments approuvés par la FDA. Ce dernier est particulièrement attrayant, puisque le temps et l'argent nécessaires à la mise en œuvre de ces médicaments dans les cliniques sont considérablement réduits en raison de la disponibilité des données d'essais cliniques antérieures. Un exemple canonique de la réutilisation d'un inhibiteur de kinase est l'imatinib, initialement conçu pour le traitement de la leucémie myélogène chronique (LMC) par l'inhibition de BCR-Abl, qui peut également être utilisé avec succès pour le traitement de c-Kit sur-exprimant tumeurs stromales gastro-intestinales (GISTs)4,5,6,7.
Le criblage des inhibiteurs de kinase peut être exécuté dans des essais contraignants ou des essais enzymatiques-basés. La première classe d'essais se concentre sur les interactions protéines-médicaments et peut fournir des informations telles que le site de ligature et l'affinité. Puisque l'activité de la kinase au moment de ces essais est inconnue, un certain nombre d'interactions peuvent être manquées ou faussement identifiées en raison des changements conformationnels dans la protéine. D'autre part, les essais à base d'enzymatiques exigent que les kinases protéiques soient actives et fournissent des informations précieuses sur l'effet de l'inhibiteur sur l'activité enzymatique, cependant, ce type de dépistage est généralement plus long et coûteux. À l'heure actuelle, les deux types d'essais sont disponibles dans le commerce auprès de plusieurs sources. Ils représentent une option fiable pour le dépistage des inhibiteurs de la kinase avec quelques limitations, y compris: I) la plupart des méthodes impliquent l'essai de kinases multiples individuellement, ce qui peut rendre le dépistage d'un grand ensemble de protéines coûteux; II) l'ensemble de kinases à tester se limite à une liste de kinases présélectionnées de type sauvage et à plusieurs versions mutées bien connues de certaines kinases, ce qui entrave l'essai de nombreux nouveaux isoformes mutés.
Dans ce contexte, les microréseaux protéiques sont une plate-forme puissante capable de surmonter certaines des limites présentées par les techniques disponibles dans le commerce. Il convient d'effectuer des essais à base d'enzymatiques dans le dépistage à haut débit à l'aide de protéines actives pleine longueur de toute séquence d'intérêt. Les microréseaux peuvent être générés par une approche auto-assemblée comme NAPPA (tableau de protéines programmables à l'acide nucléique), dans lequel les protéines sont exprimées juste à temps pour les essais, augmentant la probabilité que ceux affichés sur le tableau sont en effet actifs. Les protéines affichées sur NAPPA sont produites à l'aide de ribosomes d'origine humaine et de protéines chaperon afin d'améliorer la probabilité de pliage naturel et d'activité.
Les protéines sont initialement programmées en imprimant des cDNA codant pour les gènes d'intérêt fusionnés avec une étiquette de capture, avec un agent de capture, sur la surface du microarray. Les protéines sont ensuite produites sur les microréseaux à l'aide d'un système de transcription et de traduction in vitro (IVTT), et les protéines fraîchement exprimées sont immobilisées sur la surface du microréseau par l'agent de capture. Les tableaux NAPPA exprimés peuvent être utilisés pour l'étude des protéines affichées sur le tableau d'une manière impartiale et à haut débit8,9.
Auparavant, il a été démontré que les protéines affichées sur les tableaux NAPPA sont pliées correctement pour interagir avec des partenaires connus10; en outre, leur activité enzymatique a été exploitée pour la première fois en 2018, lorsqu'il a été démontré que les kinases protéiques affichées sur l'autophosphorylate microarray11. À ce jour, la méthodologie NAPPA a été utilisée pour de nombreuses applications distinctes, y compris la découverte de biomarqueurs12,13,14,15,16,17, interactions protéines-protéines10,18, identification de substrat19, et dépistage des médicaments11. Sa flexibilité est l'une des caractéristiques clés de la plate-forme qui permet de s'adapter à chaque application.
Ici, un protocole pour le criblage des inhibiteurs de kinase de tyrosine dans les tableaux auto-assemblés de NAPPA est présenté. La plate-forme est optimisée pour l'affichage des kinases actives de protéine humaine et pour l'analyse de l'activité de kinase de protéine, avec le fond bas et la gamme dynamique élevée. Parmi les modifications mises en œuvre pour utiliser nAPPA pour le dépistage des inhibiteurs de la kinase, mentionnons : I) les changements dans la chimie de l'impression, II) la déphosphorylation du microréseau protéique avant le criblage des inhibiteurs de la kinase, et III) l'optimisation de la détection de protéines phosphorylées sur le tableau. Ce protocole est le premier du genre et fournit des informations uniques sur l'étude kinase dans les microréseaux NAPPA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>364 well plates (for arraying)</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>x7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 &#181;L 96-well collection plate</td>
			<td>Abgene</td>
			<td>AB-0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin device</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>140500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>1.00066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone 99.9%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum seal for 96 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76004-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>80370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>37535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 35</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>BP345-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeepWell Block, case of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-intercalating dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plates</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA77002804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Permeable Seals, box of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass box</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human-based IVTT system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPure Mouse IgG whole molecule</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>31202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (Potassium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4(Potassium phosphate monobasic)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Protein Phosphatase</td>
			<td>new england biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifterslips, 24 x 60 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25X60I24789001LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal 30-slide rack with no handles</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4 (Sodium orthovanadate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOAc (Sodium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410.10 / 740414.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoprep Anion II</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740503.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>79617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution (0.01%)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Phosphatase (Lambda)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs, Inc</td>
			<td>44904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica packets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100489-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single well plate</td>
			<td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (3M, pH 5.5)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB media (Terrific Broth)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T0918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>IBI scientific</td>
			<td>IB70144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td>Maker/model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable chilling incubator</td>
			<td>Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker for bacterial growth</td>
			<td>ATR Multitron shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold with liquid waste trap</td>
			<td>MultiScreenVacuum Manifold 96 well</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well autopippetor/liquid handler</td>
			<td>Genmate or Biomek FX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser</td>
			<td>Wellmate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarrayer</td>
			<td>Genetix QArray2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic hybridization station</td>
			<td>Tecan HS4800 Pro Hybridization Station</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Tecan PowerScanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray data quantification</td>
			<td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays

Le dépistage des inhibiteurs de la kinase est crucial pour mieux comprendre les propriétés d'un médicament et pour l'identification de cibles potentiellement nouvelles ayant des implications cliniques. Plusieurs méthodologies ont été signalées pour effectuer un tel dépistage. Cependant, chacun a ses propres limites (p. ex., le dépistage de seulement analogues ATP, la restriction à l'utilisation de domaines de kinase purifiés, les coûts importants associés aux tests de plus de quelques kinases à la fois, et le manque de flexibilité dans le dépistage des kinases protéiques avec mutations nouvelles). Ici, un nouveau protocole qui surmonte certaines de ces limitations et peut être employé pour le criblage impartial des inhibiteurs de kinase est présenté. Une force de cette méthode est sa capacité à comparer l'activité des inhibiteurs de kinase à travers les protéines multiples, soit entre différentes kinases ou différentes variantes de la même kinase. Des microréseaux de protéines auto-assemblés générés par l'expression de kinases protéiques par un système de transcription et de traduction in vitro (IVTT) à base humaine sont utilisés. Les protéines affichées sur le microarray sont actives, permettant de mesurer les effets des inhibiteurs de la kinase. La procédure suivante décrit les étapes du protocole en détail, de la génération de microréseaux et le dépistage à l'analyse des données.

Les microréseaux NAPPA auto-assemblés fournissent une plate-forme solide qui peut être utilisée pour de nombreuses applications distinctes, y compris la découverte de biomarqueurs, les interactions protéines-protéines, l'identification du substrat et le dépistage des médicaments10,11 ,12,13,14,15,16,17,18,19,20.
La méthodologie globale adoptée pour l'étude de l'activité kinase et le dépistage des inhibiteurs des kinases tyrosines sur les microréseaux NAPPA est représentée de façon schématique à la figure 1. Tout d'abord, les microréseaux NAPPA sont générés par l'immobilisation de l'ADNc et de l'agent de capture sur les microréseaux enduits. Les CDNA sont ensuite utilisés comme modèle pour la transcription et la traduction des protéines, à l'aide d'un système IVTT à base humaine, et les protéines nouvellement synthétisées sont immobilisées par l'agent de capture9. La qualité du microréseau imprimé peut être surveillée en mesurant les niveaux d'ADN (confirmant une impression cohérente) ou de protéines affichées sur le tableau (confirmant l'expression et la capture des protéines; Figure 1). Pour diminuer le signal de fond et augmenter la plage dynamique de l'expérience, les microréseaux sont traités avec 1) lambda phosphatase pour éliminer la phosphorylation des résidus de Ser/Thr/Tyr, puis avec 2) DNase pour simplifier la chimie sur place et diminuer (figure1).
L'étape suivante est la réaction d'autophosphorylation, dans laquelle les microréseaux sont incubés avec un tampon kinase en l'absence d'ATP (tableau de contrôle négatif, appelé microarrays déphosphorylés), et le tampon kinase est complété par l'ATP (contrôle positif, appelés tableaux autophosphorés) ou ATP et DMSO (contrôle des véhicules). Il convient de souligner qu'au cours de cette étape, aucune kinase n'est ajoutée; par conséquent, l'activité intrinsèque de chaque kinase affichée sur le microarray est quantifiée par la mesure de ses niveaux de phosphorylation à l'aide d'un anticorps pan antiphopho-tyrosine suivi d'un anticorps secondaire cy3-labbeled (figure 1).
Le contrôle de la qualité des tableaux NAPPA-kinase affichant un panneau de kinases de protéines humaines imprimés en quadruplicate est montré dans la figure 2. Les niveaux d'ADN immobilisé ont été mesurés par la coloration de l'ADN et il a montré un signal pair à travers le microarray, suggérant que la quantité d'ADN imprimée sur le tableau était uniforme. Il est également possible d'observer plusieurs caractéristiques sans aucune coloration d'ADN. Ces caractéristiques correspondent à certaines commandes dans lesquelles l'ADN a été omis du mélange d'impression [c.-à-d., taches vides (rien n'a été imprimé), taches d'eau, tache IgG purifiée (poly-lysine, crosslinker et IgG purifié), mélange d'impression seulement (mélange d'impression complet : poly-lysine plus crosslinker et anticorps anti-drapeau, sans ADN)]. Les niveaux de protéine affichés sur les microarrays nAPPA-kinase ont été évalués après la réaction d'IVTT utilisant l'anticorps anti-tag.
Pour le dépistage de la kinase, Flag a été utilisé comme étiquette de choix et le niveau de protéines affiché sur le microarray a été mesuré à l'aide d'un anticorps anti-drapeau. Comme indiqué, la majorité des taches contenant cDNA avec succès affiché des niveaux détectables de protéines. Certains des points de contrôle sans ADNc ont également révélé un signal avec l'anticorps anti-drapeau : igG spot (utilisé pour détecter l'activité de l'anticorps secondaire) et des taches vectorielles vides (codes d'ADNc pour l'étiquette seulement) (Figure 2). Les microréseaux nAPPA-kinase ont montré une bonne reproductibilité entre les diapositives, avec la corrélation des niveaux d'affichage des protéines parmi les lots d'impression distincts supérieurs à 0,88 (figure 2). Dans le même lot, la corrélation était encore plus élevée, proche de 0,92 (données non affichées).
Ensuite, l'activité d'autophosphorylation de kinase des protéines affichées sur le tableau a été mesurée à l'aide d'anticorps antiphospho-tyrosine (figure 3). Les protéines affichées sur le tableau présentaient des niveaux élevés de phosphorylation protéique après expression (Figure 3, gauche), qui peuvent être causés par l'activité intrinsèque de kinase de la protéine affichée sur le tableau ou par des kinases actives présentes dans le mélange IVTT. Cette phosphorylation a été complètement enlevée avec le traitement de phosphatase de lambda et ces microarrays ont été employés pour les essais de kinase. Après la déphosphorylation, les réactions d'autophosphorylation effectuées sans ATP n'ont montré aucun niveau significatif de phosphorylation, comme prévu, tandis que les microarrays incubés avec le tampon de kinase en présence de l'ATP ont montré la phosphorylation de protéine aussi rapide que 15 min ( Figure 3). Pour le dépistage des médicaments, l'activité de kinase a été mesurée après 60 min de réaction d'autophosphorylation pour maximiser le nombre de kinases testées.
La comparaison entre les microréseaux dans lesquels les niveaux de phosphorylation ont été mesurés juste après l'expression des protéines (Figure 3, à gauche) et après 60 minutes de réaction d'autophosphorylation(figure 3, droite) a montré : i) protéines phosphorylées seulement après expression, suggérant qu'ils peuvent être exogènement phosphorylés par les protéines présentes sur le mélange IVTT, mais ne peuvent pas être autophosphorylated ; ii) protéine phosphorylated seulement après la réaction d'autophosphorylation, suggérant que ces protéines n'étaient pas actives après l'expression de protéine et ont exigé des co-facteurs présents dans le tampon de kinase pour être actifs ; ou iii) de protéines phosphorylées sur les deux tableaux, ce qui suggère qu'ils étaient actifs dans les deux milieux (figure 3).
À titre d'exemple des résultats obtenus pour le dépistage des inhibiteurs de la tyrosine kinase sur les tableaux de nAPPA-kinase, trois inhibiteurs de la kinases ayant une sélectivité distincte entre les kinases protéiques ont été utilisés : staurosporine, imatinib et ibrutinib. Pour tous les dépistages, les microréseaux NAPPA déphosphorylés ont été incubés avec des concentrations croissantes de TKI (allant de 100 nM à 10 uM) pendant la réaction d'autophosphorylation. Le premier TKI testé était la staurosporine, un inhibiteur mondial de la kinase protéique, qui a montré une inhibition puissante de la kinase sur le microarray à travers pratiquement toutes les kinases testées11.
Ensuite, l'imatinib a été testé, un inhibiteur ABL et c-Kit utilisé pour le traitement de la leucémie myélogène chronique et les tumeurs stromales gastro-intestinales4,5,6,7. Sur les tableaux NAPPA-kinase, l'imatinib a montré une réduction significative de l'activité Abl1 et BCR-Abl1 alors que d'autres kinases sont restées pour la plupart inchangées (figure 4A). La quantification des données pour l'activité de kinase a été normalisée par rapport au tableau déphosphorylé et représentée en pourcentage du microréseau de contrôle positif (véhicule seulement). Les données relatives à TNK2 (kinase non pertinente), Abl1 et BCR-Abl1 sont présentées à la figure 4B. Comme prévu, l'imatinib a montré l'inhibition sélective vers Abl1 et BCR-ABl1. Les données pour c-Kit n'étaient pas concluantes en raison du manque d'activité sur les tableaux de contrôle positifs.
Enfin, l'ibrutinib, un inhibiteur covalent approuvé par la FDA de la tyrosine kinase de Bruton (BTK), a été testé. L'ibrutinib est actuellement utilisé dans le traitement de plusieurs cancers liés au sang avec la BTK hyperactive, y compris la leucémie lymphocytique chronique (LCL), le lymphome de cellules de manteau, et la macroglobulinemia de Waldenstrâm21,22. Figure 4C, est représentatif des résultats typiques obtenus pour le dépistage de l'ibrutinib. L'activité kinase d'ABL1 (kinase non pertinente) et de BTK (cible canonique) et d'ERBB4 (nouvelle cible potentielle) est indiquée à la figure 4D. Les données suggèrent ERBB4 peut être inhibé par l'ibrutinib d'une manière spécifique dose. Cette inhibition a été confirmée in vitro et dans les essais cellulaires11, démontrant la puissance de cette plate-forme.
Prises ensemble, les données suggèrent que la plate-forme de microréseau NAPPA-kinase pourrait être utilisée pour le dépistage impartial des inhibiteurs des atS. En outre, le dépistage est rapide et peut être facilement personnalisé pour inclure toute variation des kinases protéiques d'intérêt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique du contrôle de la qualité et du criblage des inhibiteurs de la tyrosine kinase dans les tableaux NAPPA. Les tableaux NAPPA sont imprimés avec un codage de cDNA pour la protéine d'intérêt fusionnée avec une étiquette et un anticorps de capture. Pendant la transcription in vitro et la réaction de traduction (IVTT), les protéines synthétisées sont capturées sur la surface du microarray à travers l'étiquette par l'anticorps de capture. Le contrôle de la qualité (QC) des tableaux est effectué par la mesure des niveaux d'ADN imprimés sur la diapositive, à l'aide d'un colorant fluorescent intercalant l'ADN, et les niveaux de protéines affichées sur le tableau à l'aide d'anticorps spécifiques aux étiquettes. Pour le criblage de kinase, les microarrays sont traités avec le DNase et la phosphatase, après la réaction d'IVTT, pour enlever l'ADN imprimé et toute la phosphorylation qui a pu s'être produite pendant la synthèse de protéine. Les tableaux déphosphorylés sont maintenant prêts à être utilisés pour l'écran de drogue. Pour chaque test, trois ensembles de contrôles sont couramment utilisés : (I) tableaux déphosphorylés, dans lesquels la réaction d'autophosphorylation est effectuée sans ATP; (II) microréseaux autophosphorés, dans lesquels la réaction d'autophosphorylation est effectuée en présence de l'ATP; et (III) tableau traité DMSO (véhicule), dans lequel la réaction d'autophosphorylation est effectuée avec ATP et DMSO. Les diapositives traitées avec une concentration différente d'inhibiteurs de la kinase suivent exactement le même protocole utilisé pour les tableaux traités Par DMSO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg"> Figure 2 : Résultats représentatifs du contrôle de la qualité pour les tableaux NAPPA-kinase auto-assemblés. La teneur en ADN mesurée par un colorant fluorescent intercalant l'ADN (à gauche) et les niveaux de protéines affichés sur le microréseau mesuré par l'anticorps anti-Flag (au milieu) sont montrés. Sur le côté droit se trouve une parcelle de corrélation des niveaux de protéines affichées sur deux tableaux NAPPA-kinase imprimés en lots distincts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg"> Figure 3 : Résultats représentatifs de l'activité kinase dans les tableaux NAPPA-kinase. Des microarrays affichant des kinases de protéine dans le quadruplicate ont été employés pour étudier l'activité de kinase de protéine sur le réseau par la mesure de la phosphorylation de protéine utilisant l'anticorps anti-pTyr, suivi de l'anticorps anti-souris cy3-étiqueté. Des tableaux de contrôle sans traitement de phosphatase/DNase et sans ATP pendant la réaction d'autophosphorylation ont été employés pour mesurer la phosphorylation de fond après expression de protéine (post-expression). Les microréseaux restants ont été traités avec la phosphatase/ADN, et la réaction d'autophosphorylation a été exécutée sans ATP (microarray déphosphorylé, contrôle négatif) ou avec ATP (microarrays autophosphorylated). Pour les microréseaux autophosphorylated la réaction d'autophosphorylation a été exécutée pendant 15 min, 30 min, 45 min, ou 60 min, comme indiqué. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg"> Figure 4 : Données représentatives de l'écran tyrosine kinase sur les tableaux NAPPA-kinase. (A) Les tableaux traités par phosphatase/DNase ont été incubés dans des concentrations croissantes d'imatinib pendant la réaction d'autophosphorylation et l'activité de kinase a été mesure avec l'anticorps anti-phospho-tyr. (B) Quantification de l'activité kinase observée sur les tableaux NAPPA-kinase exposés à l'imatinib. Les données ont été normalisées par rapport au signal des tableaux de contrôle négatifs (déphosphoryés) et elles sont indiquées en pourcentage des tableaux de contrôle positifs (réaction d'autophosporylation effectuée en présence de DMSO). Des données similaires sont présentées pour le dépistage de l'ibrutinib (C,D). Ce chiffre a été modifié à partir de Rauf et coll.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Dossier supplémentaire 1. Protocole alternatif pour le criblage des inhibiteurs de la tyrosine kinase dans les tableaux NAPPA à l'aide d'une station d'hybridation automatisée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Un protocole détaillé pour la génération de microarrays de protéines humaines auto-assemblés pour le dépistage des inhibiteurs de la kinase est présenté.

Dépistage de l'inhibiteur de kinase dans les microréseaux de protéines humaines auto-assemblés

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

NAPPA est une puissante plate-forme de microrésoration protéique qui peut être utilisée pour l’étude de l’activité et de la fonction protéiques d’une manière impartiale à haut débit. Les protéines affichées sur NAPPA sont produites dans un système d’expression à base humaine utilisant des ribosomes et chaperons d’origine humaine afin d’améliorer la probabilité de pliage et d’activité naturels. L’utilisation de tableaux NAPPA pour le dépistage des inhibiteurs de la kinase fournit une nouvelle plate-forme pour l’essai de nouveaux médicaments et de mutations kinase cliniquement pertinentes.Les microrésiteurs protéiques générés par la méthodologie NAPPA peuvent être utilisés pour de nombreuses applications distinctes, y compris la découverte de biomarqueurs, les interactions protéines-protéines, l’identification du substrat et le dépistage des médicaments. Effectuez des étapes de contrôle de la qualité en cours de route. Testez la qualité de votre préparation d’ADN, le microrése d’ADN et le microrésitent protéique.Si dans n’importe quelle étape la qualité n’est pas bonne, il suffit de recommencer. Lisa Miller, technicienne dans mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour préparer la croissance bactérienne dans la maison à haut débit mini-préparation, d’abord inoculer les bactéries dans la plaque d’auger dans un format de puits 96, et laisser croître pendant 16 heures.Le lendemain, remplissez chaque puits de la plaque de puits profond avec 1,5 millilitres de bouillon terrible moyen, complété par de l’ampicilline d’anticorps. L’anticorps dépend du marqueur de sélection du plasmide. Ensuite, stérilisez un dispositif de 96 broches avec 80% d’éthanol et de flamme.Utilisez le dispositif stérile de 96 broches pour ramasser les colonies de la plaque d’agar incubée pendant la nuit et plonger dans les puits de la plaque profonde du puits pour inoculer la culture. Couvrir le bloc d’un joint perméable au gaz et incuber sur un shaker pendant 22 à 24 heures à 37 degrés Celsius, et 300 à 800 rpm. Après cela, les cultures de granulés et de réutiliser les cultures selon le manuscrit.Bactéries Lyse en ajoutant 200 microlitres de solution deux dans chaque puits, sceller la plaque avec un joint en aluminium, et inverser cinq fois. Incuber les cellules pendant exactement cinq minutes. Pour neutraliser la solution, ajouter 200 microlitres de solution trois, sceller la plaque avec un joint en aluminium et inverser cinq fois.Ensuite, faites tourner la plaque à 3800 G, quatre degrés Celsius, pendant 30 minutes pour dégager le supernatant lysate. Pour préparer des plaques de résine d’échange d’anion, d’abord, mélanger le lisier d’échange d’anion, et verser le lisier dans une auge en verre. Empilez les plaques de filtre sur une plaque de puits profonde pour agir comme un récipient de collecte des déchets.Ensuite, à l’aide de larges pointes P1000, mélanger le lisier, et transférer 450 microlitres de la boue dans chaque puits des plaques de filtre. Centrifugeuse et jeter le flux à travers. Maintenant, transférez les supernatants lysate à la pile de plaque de résine et de bloc de puits profond.Faites tourner les plaques empilées pendant cinq minutes à 30 fois G avec la vitesse de montée en puissance la plus lente et jetez le flux à travers. Pour laver la colonne, ajouter 400 microlitres de tampon de lavage N3 solution à chaque puits. Transférer la plaque de résine dans le collecteur sous vide pour enlever le tampon de lavage.Répétez l’étape de lavage trois fois, puis retirez tout tampon de lave-linge restant avec une brève rotation de cinq minutes à 30 fois G.To élisez l’ADN, placez la plaque de résine sur une plaque de collecte propre de 800 microlitres. Ajouter 300 microlitres de solution N5 à chaque puits et laisser reposer à température ambiante pendant dix minutes. Ensuite, faites tourner les plaques empilées pendant cinq minutes à 20 fois G avec une vitesse de montée en puissance lente à 233 fois G pendant une minute.Conservez les assiettes à 20 degrés Celsius négatifs avant de les utiliser. Tout d’abord, placez les glissières sur une grille et submergez les glissières dans un réservoir de verre contenant la solution de revêtement de 2 % de réacétone d’aminosilane. Faire basculer les toboggans pendant 15 minutes.Rincez ensuite les diapositives à l’acétone suivies d’un rinçage final à l’eau. Ensuite, séchez les glissières à l’aide d’air sous pression. Soufflant sur eux sous tous les angles pendant environ trois minutes jusqu’à ce que toutes les gouttelettes d’eau ont été enlevés.Conservez les glissières enduites à température ambiante sur une grille métallique à l’intérieur d’une boîte hermétiquement scellée. Maintenant, procédez à précipiter l’ADN tel que décrit dans le manuscrit. Puis, résuspendez la pastille d’ADN dans 20 microlitres d’eau ultrapure et secouez à 1000 rpm pendant deux heures.Pour préparer l’échantillon de tableau, ajoutez 10 microlitres de mélange d’impression fraîchement préparé qui contient l’anticorps, le crosslinker, et la polylysine à chaque échantillon d’ADN. Sceller les plaques avec du papier d’aluminium et agiter à température ambiante pendant 90 minutes à 1000 rpm. Conserver les assiettes toute la nuit à quatre degrés Celsius.Le jour de l’impression, brièvement vortex et tourner les plaques. Transférer 28 microlitres de chaque échantillon dans une plaque de puits 384. Placez les glissières enduites d’aminosilane et la plaque de puits 384, sur le pont du tableau de bord, et commencez le programme d’impression de microréseau.Lorsque l’impression est terminée, étiquetez les microarrays. Les microarrays peuvent être stockés pendant des mois jusqu’à nouvel usage. Pour mesurer les niveaux d’ADN, placez les glissières dans une boîte de pipette et bloquez-les avec 50 millilitres de tampon de blocage.Incuber les glissières sur un shaker à température ambiante pendant une heure. Ensuite, jetez la solution et ajoutez 20 millilitres de tampon bloquant et 33 microlitres de colorant intercalaire d’ADN fluorescent. Incuber pendant 15 minutes avec agitation.Une fois l’incubation terminée, rincez rapidement les glissières à l’eau ultra pure et séchez-les à l’air comprimé. Les microarrays sont prêts à être scannés. Pour exprimer les microarrays, bloquez les glissières comme indiqué précédemment, puis rincez-les à l’eau ultra pure, et séchez-les à l’air comprimé filtré.Fixez un joint d’étanchéité à chaque glissière. Ajouter 130 millilitres de transcription in vitro et de mélange de traduction sur les diapositives, et masser doucement les joints d’étanchéité de sorte que le mélange de transcription in vitro et de traduction s’étend et couvre toute la zone du tableau sans bulles. Appliquer les petits joints de port ronds sur les deux ports.Incuber pendant 90 minutes à 30 degrés Celsius pour l’expression des protéines, suivi de 30 minutes à 15 degrés Celsius pour l’immobilisation de la protéine de requête. Ensuite, retirez le joint, lavez les glissières trois fois pendant cinq minutes chacune en 15 millilitres TBST avec du lait, et bloquez dans la même solution pendant une heure. Pour la détection des protéines sur le tableau, retirer le TBST avec du lait, placer les diapositives sur une plaque de grille, et appliquer 600 microlitres d’anticorps primaires, anti-drapeau de souris, dilué un à deux cents, et 1x TBST complété avec 5% de lait.Incuber pendant une heure à température ambiante. Lavez les toboggans avec 50 millilitres de 1x TBST et 5% de lait sur le shaker à bascule trois fois pendant cinq minutes chacun. Répétez la procédure pour l’anticorps secondaire.Une fois l’incubation d’une heure terminée, laver les toboggans avec 1x TBST sur le shaker à bascule trois fois pendant cinq minutes chacun. Rincez ensuite rapidement les glissières à l’eau ultra pure et séchez à l’aide d’air sous pression. Les diapositives sont prêtes à être numérisées.Pour effectuer le traitement à la phosphatase et au DNase, lavez et bloquez les diapositives exprimées avec tbst complétées par 3%BSA tel que décrit dans le manuscrit. Ensuite, placez les glissières sur une plaque de grille et appliquez 200 microlitres de solution phosphatase DNase. Placez un slip de couverture de microarray sur le dessus pour éviter l’évaporation.Incuber à 30 degrés Celsius pendant une heure et 30 minutes au four. Ensuite, lavez les diapositives avec 1x TBST et 0,2 chlorure de sodium molaire sur le shaker à bascule trois fois pendant cinq minutes chacun. Pour effectuer le traitement médicamenteux et la réaction de kinase, placez les glissières sur la plaque de grille et appliquez 200 microlitres de solution de kinase de drogue.Placez un glissement de couvercle sur le dessus pour éviter l’évaporation. Incuber pendant une heure à 30 degrés Celsius dans le four. La clé des données reproductibles est le temps d’incubation constant entre les diapositives.Ceci particulièrement important pendant la réaction de kinase. Le temps nécessaire pour traiter chaque diapositive doit être pris en compte. Après cela, laver les diapositives avec 1x TBST et 0,2 chlorure de sodium molaire sur le shaker à bascule trois fois pendant cinq minutes chacun.Répéter la détection des protéines à l’aide d’anticorps primaires phosphotyrosine anticorps dilué un à 100 dans TBST, complétée par 3% d’albumine de sérum bovine. Utilisez 1x TBST et 3% d’albumine de sérum bovin pour le lavage après l’incubation avec l’anticorps primaire, et TBST pour les lavages après incubations avec des anticorps secondaires. Laver et sécher comme auparavant.Pour l’acquisition d’images, chargez les microarrays dans le chargeur de support de diapositives. Chargez le chargeur dans le scanner microarray. Scannez tous les microarrays avec les paramètres optimisés et n’oubliez pas d’éteindre le gain automatique lorsque vous comparez des images à travers des expériences.Transférez les images vers un logiciel de quantification, alignez la grille avec les taches et quantifiez l’intensité du signal de chaque entité sur le microrése. Procéder à l’analyse statistique. Dans cette étude, le microarray a montré la majorité des taches contenant l’ADN complémentaire avec succès montré des niveaux détectables de protéine.Nappa kinase microarrays a montré une bonne reproductibilité parmi les diapositives, avec la corrélation des niveaux d’affichage des protéines entre les lots d’impression distincts supérieurs à 0,88. Les résultats représentatifs de l’activité de kinase dans les tableaux de kinase de NAPPA ont montré des niveaux élevés de phosphorylation de protéine après expression. La comparaison entre les microrésaires dans lesquels les niveaux de phosphorylation ont été mesurés juste après le traitement de phosphatase, et après 60 minutes de réaction d’autophosphorylation, suggère la présence des kinases actives de protéine sur le tableau.Sur les tableaux de kinase nappa, l’imatinib a montré une réduction significative de l’activité ABL1 et BCR-ABL1, tandis que d’autres kinases sont restées la plupart du temps inchangées. L’activité de kinase normalisée contre le tableau déphosphorylated et représentée en pourcentage du microarray positif de contrôle a montré l’inhibition sélective de l’imatinib vers ABL1 et BCR-ABL1. Les résultats typiques obtenus pour le criblage d’ibrutinib ont montré que l’activité de kinase de kinase d’ABL1 kinase non-pertinente n’est pas affectée.BTK cible canonique, et ERBB4 nouvelle cible potentielle, a montré une activité réduite en présence d’ibrutinib. Les données suggèrent qu’ERBB4 peut être inhibé par l’ibrutinib d’une manière spécifique à la dose. Le succès des criblages de microrésaires protéiques dépend fortement de la qualité du microrésaire lui-même.Plusieurs caractéristiques de contrôle positives et négatives devraient être utilisées pour permettre une analyse appropriée des données. Nappa kinase test est une plate-forme de dépistage, et en tant que tel, les données obtenues doivent être validées dans les tests de suivi, qui peuvent inclure des analyses de kinase in vitro, ou des analyses à base de cellules. Puisque notre protocole commence avec cDNA, n’importe quelle mutation ou variation de kinase peut être facilement incorporée dans le microarray et étudiée dans le haut débit.Pendant la préparation de la boue et des plaques de résine d’échange d’anion, il est recommandé d’utiliser des masques pour empêcher l’inhalation possible des particules de résine.

Research

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Recherche

Biochimie

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