Name: kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לכולם במעבדת הLaBaer על עזרתם וביקורתם במהלך התפתחות הפרויקט. פרויקט זה נתמך על ידי המענק NIH U01CA117374, U01AI077883 ו-וירג ג ' פייפר קרן.

<ol>
	<li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+kinases.">Targeting protein kinases.</a> Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).</li><li>Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+inhibitors+in+the+treatment+of+inflammatory+and+autoimmune+diseases.">Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases.</a> Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).</li><li>Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA-approved+small-molecule+kinase+inhibitors.">FDA-approved small-molecule kinase inhibitors.</a> Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).</li><li>Heinrich, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+c-kit+receptor+tyrosine+kinase+activity+by+STI+571,+a+selective+tyrosine+kinase+inhibitor.">Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor.</a> Blood. 96 (3), 925-932 (2000).</li><li>Stagno, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+mesylate+in+chronic+myeloid+leukemia:+frontline+treatment+and+long-term+outcomes.">Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes.</a> Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).</li><li>Ben Ami, E., Demetri, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safety+evaluation+of+imatinib+mesylate+in+the+treatment+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor.</a> Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).</li><li>Ramachandran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+microarrays.">Self-assembling protein microarrays.</a> Science. 305 (5680), 86-90 (2004).</li><li>Festa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+microarray+production+of+freshly+expressed+proteins+in+a+human+milieu.">Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu.</a> Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).</li><li>Rauf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inhibition+of+ERBB4+reduces+cell+growth+in+a+WNT5A-dependent+manner.">Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner.</a> Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).</li><li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarray+signature+of+autoantibody+biomarkers+for+the+early+detection+of+breast+cancer.">Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer.</a> Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Autoantibodies+Associated+with+Basal-like+Breast+Cancers.">Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).</li><li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+Antibody+Immunome+in+Type+1+Diabetes+Using+Protein+Arrays.">Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays.</a> Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Antibody+Targets+for+Tuberculosis+Serology+using+High-Density+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays.">Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Autoantibody+Responses+between+Lung+Adenocarcinoma+and+Benign+Pulmonary+Nodules.">Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules.</a> Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).</li><li>Montor, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+Pseudomonas+aeruginosa+outer+membrane+protein+immunogenicity+using+self-assembling+protein+microarrays.">Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays.</a> Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).</li><li>Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+Protein-Protein+Interactions+Using+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays.">Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+(click+chemistry)-based+detection+of+global+pathogen-host+AMPylation+on+self-assembled+human+protein+microarrays.">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).</li><li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+signature+for+the+serologic+detection+of+ovarian+cancer.">Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).</li><li>Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B-cell+receptor+signaling+pathway+as+a+therapeutic+target+in+CLL.">The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL.</a> Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).</li><li>Smith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+in+B+lymphoid+malignancies.">Ibrutinib in B lymphoid malignancies.</a> Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).</li><li>Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cloning+and+expression+library+creation+for+functional+proteomics.">High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics.</a> Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).</li><li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).</li></ol>

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

שינויים ופתרון בעיות במהלך שלב האופטימיזציה של המחקר של הפעילות של קינאז על מערכי הנפה, אחד המקורות העיקריים של הרקע וטווח דינמי נמוך נצפתה היה BSA בשימוש בתמהיל ההדפסה. BSA סיפק את האמינים העיקריים הנחוצים ליצירת קשר עם פני השטח של עמינח והוא היה לוכדת את ה-DNA ואת נוגדן לכידת במקום. עם זאת, BSA הוא זרחתית מאוד, ומקשה על גילוי האות האוטומטית במערך מעל רעשי הרקע. כדי לפתור בעיה זו, כמה חלופות BSA בתמהיל ההדפסה נבדקו, ו פולי ליזין זוהה כתחליף טוב. ליזין פולי חסר כל אתר זירחון; לכן, הרקע ממערכים שאינם מבוטא הוא מאוד מינימלי. יתר על כן, מיקרו מערכים מודפסים עם פולי ליזין מוצגים ומציגים רמות טובות של חלבונים (איור 2).
השינוי הקריטי הבא שבוצע על-גבי התיקון הסטנדרטי של הנפה היתה תוספת של שלב הטיפול בפוספספטאז/DNase. הטיפול במיקרו מערכים עם פוספספטאז מאפשר הסרה של זירחון כלשהו שהתרחש בתמהיל ה-IVTT במהלך סינתזה החלבונים ולכידה (איור 3). המקור של זרחון זה יכול להיות מתוך פעילות פנימית בתוך התצוגה האוטומטית או מן הפעילות של החולים הקיימים בתמהיל IVTT. ההסרה של כל זירחון שלאחר הביטוי מאפשרת זיהוי קל של הקיסים הפעילים ויכולים לעבור מראש המואזלציה (איור 3).
צעדים קריטיים בפרוטוקול נאפה היא טכנולוגיה איתנה, אך כצפוי, קיימים מספר שלבים קריטיים. הראשונה היא רכישת ה-DNA באיכות גבוהה בריכוז המתאים. שימוש ב-DNA של איכות ירודה או בריכוזים נמוכים יפיק מיקרומערכים באיכות ירודה עם מספר תכונות לא להיות מבוטא ומוצג ברמות המתאימות, הפחתת מספר החלבונים שנותחו על המערך. הצעד הקריטי השני הוא הביטוי של חלבונים במיקרו-מערך. השימוש במערכת IVTT אשר לבטא רמות גבוהות של חלבון פונקציונלי הוא חיוני עבור לימוד הפעילות של קינאז במערך.
השלב הקריטי הבא בהקרנה TKI הוא האופן שבו מטופלות המיקרו-מערכים. המיקרו-מערכים לא צריכים להתייבש במהלך כל שלב של הפרוטוקול, וטיפול עדין מומלץ למנוע שריטות שיכולות להגביר את אות הרקע. מאחר והמערכים מהניסוי כולו יושוו זה לזה, חשוב לוודא שכל צעד של הדגירה הוא אפילו בכל השקופיות. לדוגמה, יש לקחת בחשבון את הזמן הנדרש לביצוע שלב אחד במערך יחיד, כאשר קבוצה של 20 מערכים מעובדת כדי למנוע הבדלים באורך הדגירה בין מערכים.
לבסוף, עיצוב הניסוי והכללה של פקדים חיוביים ושליליים הם קריטיים עבור בקרת איכות וניתוח נתונים. הסט הראשון של פקדים הם אלה המודפסים בכל מערך וכולל פקדים שליליים [i.e., כתמים ריקים (ללא כל חומר מודפס), מים או וקטור ריק (לבטא רק את התג)], כמו גם שליטה חיובית (כלומר, igg מטוהרים, המזוהה על ידי ה נוגדן משני והוא אינרטי שינוי ברמות זירחון). באופן קולקטיבי, הם מודדים את רמות הרקע של המיקרו-מערך, הניתן לנשיאה במהלך ההדפסה ועוצמת האות של שיטת הזיהוי.
מערכת הבקרה הבאה היא שולטת בסינון התרופות וכוללות את המיקרו-מערכים הדאטיים והאוטומטיים (בנוכחות או העדר DMSO). כפי שהוזכר קודם לכן, המיקרו-מערך הפחת מודד את רמת זירחון לאחר טיפול פוספספטאז ולכן רמת הבסיס לכל הניסויים האחרים. ככל שרמת הבסיס נמוכה יותר, כך הטווח הדינמי גבוה יותר של ה-assays. המערכים האוטומטיים מציגים את רמות הזרחון המקסימליים של כל המערכים והאות צריך להיות חזק וברור. היא משמשת לניתוח נתונים, אך גם כפקד שכל התגובות בוצעו בהצלחה במערך.
מגבלות הטכניקה נכון לעכשיו, אחת המגבלות של הקרנת התרופה המוצגת כאן היא יכולתה להקרין רק את החלבונים שניתן להציג בתצוגה מקדימה. דרך אפשרית אחת להתגבר על כך היא הדפסת קינאז והמצע המוכר באותו מקום. הדפסה משותפת של ה-DNA עבור שני חלבונים נפרדים הושגה בהצלחה15, מציע את הכדאיות של גישה זו. יתר על כן, החלבון המוצג במערך עשוי לא להיות מקופל כראוי חלבון לא פעיל. השימוש במערכת ביטויים מבוססי-אדם גרם לשיפור משמעותי בפעילות קינאז הנמדדת במערך; עם זאת, חלבונים מסוימים עדיין לא ניתן לנתח על המערך בשל חוסר הפעילות שלה.
הגבלה שנייה היא המדידה של זרחון באמצעות המחבת נגד פוספפו-זרחן-tyr. למרות חוסר הספציפיות שלה לגבי המוטיב של אתר הזירחון, כל ההדנידות שנמדדו התרחשו על שאריות טירוזינים, והשאירו מאחור סרביני וטראונינים והקינסים בהתאמה. עד כה נבדקו ללא הצלחה, למרות ניסיונות מסוימים לייעל את תנאי הדגירה והכביסה. מערכת איתור חדשה שאינה תלויה בנוגדנים עשויה להיות האופציה הטובה ביותר להרחבת מספר הקינסים של חלבונים שניתן לוקרן לצורך עיכוב בסמים. בהקשר זה, מספר אפשרויות זמינות כולל רדיואקטיביות או גישות כימיות כגון בניינים לחץ. סדרה של מיטוב נדרשים כדי למזער את אות הרקע ולספק טווח דינמי טוב עבור assays ספר.
המגבלה השלישית היא רכישת שיבוטים cDNA כדי להיות מודפס על המערך. שיבוטים cDNA ניתן ליצור באמצעות כל טכניקת שיבוט כולל מערכות משולבות ספציפי לאתר, כגון הבורא או שער23. אפשרות נוספת היא לרכוש את המשובטים מספריית DNAsu, שנמצאו ב-< https:/Psu.olnoda/sas.lssatupfi//b >, שם יותר מ-17,000 cDNAs שיבוטים, כולל kinome האנושי כולו, זמין לשמש לבניית מערכים נאפה24 .
המגבלה הרביעית היא שלא כל מעבדה מצוידת בציוד מתאים כדי להמציא ולהקרין את מערכי ה-נאפה שלהם. פרוטוקול זה מספק שיטות חלופיות ליצירת ה-DNA שיודפס על המיקרו-מערך, ללא צורך בציוד של תפוקה גבוהה ופרוטוקולים לביצוע ידני של כל צעדי הכלאה. עם זאת, עדיין יש צורך בגישה לסורק מוכן ומערך מיקרו. אפשרות אחת להתגבר על בעיה זו היא להשתמש בשירות הליבה של נאפה ובמתקן, שנמצא ב-< http:/uparapaatsnleminnear.p\>, המפיץ מיקרומיקרו מותאם אישית במחיר ללא כוונת רווח. לבסוף, כמו כל מתודולוגיה להקרנה, הנתונים המתקבלים על המערכים רגישים להיות חפצי אמנות (חיובי או שלילי) ולכן יש לאמת באמצעות אורתוגונאליות.
משמעות ביחס לשיטות קיימות מספר פלטפורמות זמינים מסחרית להקרנה של החלבון. גישה אחת המשמשת באופן שגרתי היא מחייבת מחייב, אשר ניתן לבצע עם שברי חלבונים, מתחם קינאז, שברי חלבונים גדולים יותר עם הדומיין קינאז וכמה אזורי רגולציה, ואפילו חלבונים באורך מלא. החלבונים מבוטאים בדרך כלל במערכות חיידקיים בשל העלות והפשטות של הביטוי ופרוטוקולי הטיהור. האינטראקציה בין הסם של הריבית לבין החלבון נמדד לאחר מכן עם סוג כלשהו של שיטת דו ח כמו זריחה או נוכחות של תגים, למשל. המגבלה העיקרית של קבוצה זו של גישות היא העובדה כי החלבון הוא לא בהכרח פעיל במהלך האינטראקציה עם התרופה, אשר עשוי לגרום לזיהוי של האינטראקציות חיוביות שווא שווא מוטעה. שברי החלבון פגיעים במיוחד לשינויים במבנה ובחוסר הפעילות וכל הנתונים המתקבלים צריכים להיות מאומתים באמצעות חלבונים פעילים, רצוי בצורתם המלאה. מגבלה נוספת של חלק מהפלטפורמות היא היכולת להקרין רק את ה-ATP האנלוגית, ולהגביל את השימוש הכולל בו.
רוב השירותים הזמינים מסחרית עבור הקרנת TKIs באמצעות גישות מבוססות אנזימטית לנצל רק גרסאות סוג פראי של קינאז של עניין, ולפעמים רק מוטציות מסוימות שנבחרו. בידיעה כי התנגדות לסמים היא נפוצה מאוד בחולים שטופלו TKI, חשוב להיות מסוגל למדוד את תגובת הסמים במוטציות שונים, עבור הבחירה של המעכב המתאים ביותר. בשל טבעו של נאפה, הקרנת מוטציות קינאז פשוטה וניתנת לביצוע בקלות, והכלי הנדרש היחיד הוא שילוב המוטציה של קינאז באוסף ה-"נאפה cDNA", שניתן לבצע על-ידי מוטזיס ספציפי לאתר, למשל.
יישומים עתידיים אחת הצורות הנפוצות ביותר של טיפול שחלוף בטיפול בסרטן באמצעות מעכבי קינאז היא רכישת מוטציות ביעד התרופה במהלך קורס הטיפול. הקרנת מוטציות אלה לגבי התגובה שלהם מעכבי קינאז היא בעלת חשיבות חיונית לבחירת הדור השני/השלישי של TKIs כדי להשיג טיפול מותאם אישית עבור כל מטופל. הגישה הקרנת התרופה המוצגת כאן, מספק פלטפורמת הקרנה משוחדת שבה כל מעכב טירולך קינאז ניתן לבחון נגד פאנל של טירולי kinases בנוכחות הגנום האנושי. מאחר שהחלבונים המוצגים על מערכי הנפה מבוטאים בתוך מבחנה מחוץ ל-cDNA המודפס על השקופית, כל משתנה מוטציה יכול להיות משולב בקלות באוסף cDNA כדי להיות מוצג על המערך. המתקן בו ניתן ליצור מוטציות קינאז ולהתבטא במערך, בשילוב עם כוח התפוקה הגבוהה של טכניקת ה-נאפה, מספק סביבה ייחודית לחקר מוטציות קינאז ותגובתם לסמים, מה שהופך את המלון למתאים ל הקרנת תרופות אישית, אחת המטרות של רפואה מדויקת.

קינטיות חלבונים אחראים על זרחון של מטרות שלהם יכול לווסת מסלולים מולקולריים מורכבים השולטים בפונקציות סלולריות רבות (כלומר, הפצת תאים, בידול, מוות תאים והישרדות). פעילות רגולציה של קינאז קשורה ליותר מ-400 מחלות, מה שהופך את קינאז מעכבי אחת המחלקות העיקריות של תרופות הזמינות לטיפול במחלות מספר, כולל סרטן, וכלי דם הפרעות נוירולוגיות, כמו גם דלקתי . ומחלות אוטואימוניות1,2,3
עם הופעתו של הרפואה דיוק, הזיהוי של טיפולים חדשים, בעיקר מעכבי קינאז, יש ערעור גדול ברוקחות וקלינית. ניתן להשתמש במספר גישות לזיהוי צמדים חדשים אפשריים של מעכבי קינאז/קינאז, כולל עיצוב דה נובו של מעכבי קינאז וזיהוי מטרות חדשות עבור תרופות הקיימות באישור ה-FDA. האחרון הוא אטרקטיבי במיוחד, מאז הזמן והכסף הנדרשים כדי ליישם תרופות אלה במרפאות מופחת באופן דרסטי בשל הזמינות של נתוני ניסוי קליני הקודם. דוגמה קאנונית של מעכב קינאז הוא imatinib, תוכנן בתחילה לטיפול של לוקמיה myelogenous כרונית (CML) באמצעות עיכוב של BCR-Abl, אשר יכול גם לשמש בהצלחה לטיפול של c-Kit מעל-הבעת סטרומה גידולים במערכת העיכול (בלוגים)4,5,6,7.
ניתן לבצע את הקרנת מעכבי קינאז בכריכה מחייבת או באסמפי מבוסס-אנזימטי. המחלקה הראשונה של הספר מתמקדת באינטראקציות של תרופות חלבונים ויכולות לספק מידע כגון אתר לתקשורת ואהדה. מאחר שפעילותו של קינאז בזמן הפעולה הזאת אינה ידועה, מספר אינטראקציות עשויות להחמיץ או להיות מזוהות בטעות בשל שינויים בחלבון. מצד שני, בסיס אנזימטי מבוסס על הצורך להיות פעיל ולספק מידע חשוב לגבי השפעת המעכב על פעילות האנזים, עם זאת, סוג זה של ההקרנה הוא בדרך כלל יותר זמן רב ויקר. כיום, שני הסוגים של בחני הם זמינים מסחרית ממספר מקורות. הם מייצגים אופציה אמינה להקרנה של מעכבי קינאז עם מספר מגבלות, כולל: אני) רוב השיטות כרוכות בדיקה של מספר קינסים בנפרד, אשר יכול לעשות את ההקרנה של קבוצה גדולה של חלבונים יקרים; II) הקבוצה של הקינסים להיבדק מוגבלת לרשימה של מראש שנבחרו, פראי סוג הקונסים ומספר גרסאות ידועות מוטציה של כמה הקינסים, בחינת בדיקות של מוטציה חדשים רבים.
בהקשר זה, מיקרו-מערכי חלבון הם פלטפורמה רבת עוצמה המסוגלת להתגבר על חלק מהמגבלות המוצגות על ידי טכניקות זמינות מסחרית. היא מתאימה לביצוע מספר אנזימטי מבוסס בהקרנה בתפוקה גבוהה, תוך שימוש בחלבונים פעילים באורך מלא, בכל רצף של עניין. ניתן לייצר את המיקרו-מערכים על-ידי גישה הניתנת להרכבה עצמית, כגון מערך הגרעין של ה-"נאפה" (מערכת החלבונים הניתנים לתכנות), שבהם חלבונים מבוטאים בדיוק בזמן לקבלת הספר, הגדלת הסבירות שאלה המוצגים על המערך אכן פעילים. החלבונים המוצגים ב-נאפה מיוצרים בעזרת הריבוזומים אנושיים וחלבונים המלווה על מנת לשפר את הסבירות לקיפול ולפעילות טבעיים.
החלבונים מתוכנתים בתחילה על ידי הדפסת קידוד cDNAs עבור גנים של עניין התמזגו עם תג לכידת, יחד עם סוכן לכידה, על פני השטח microarray. החלבונים מיוצרים לאחר מכן על המיקרומערכים באמצעות תמלול ותרגום מחוץ למערכת (IVTT), והחלבונים המובטאים הטריים מוטאים על המשטח המיקרומערך על ידי סוכן הלכידה. ניתן להשתמש במערכים מסוג נאפה לחקר החלבונים המוצגים על המערך באופן בלתי משוחד ותפוקה גבוהה8,9.
בעבר, הוצגה העובדה שחלבונים המוצגים במערכים של הנפה מקופלים כראוי כדי לקיים אינטראקציה עם שותפים מוכרים10; יתרה מזאת, הפעילות האנזימטית שלהם נוצלה לראשונה ב-2018, כאשר הוצגה הצגת החלבונים בחלבון המוצג על המיקרו-מערך האוטומטי11. עד היום, מתודולוגיה של נאפה בשימוש עבור יישומים רבים ושונים, כולל גילוי ביואריקר12,13,14,15,16,17, אינטראקציות חלבונים בחלבון10,18, זיהוי מצע19, והקרנת תרופות11. הגמישות שלה היא אחת מתכונות המפתח של הפלטפורמה המאפשרת הסתגלות לכל יישום.
כאן מוצג פרוטוקול להקרנת מעכבי טירולי קינאז במערכים מורכבים מתוך מערכי הנפה. הפלטפורמה מותאמת במיוחד להצגת הקיזות של חלבון אנושי פעיל ולניתוח של פעילות חלבון קינאז, עם רקע נמוך וטווח דינמי גבוה. בין השינויים שבוצעו באמצעות ההקרנה בשנת הקרנת מעכבי קינאז: I) שינויים בכימיה המודפסת, II, דה-זירחון של מיקרומערך החלבון לפני הקרנת המעכב של קינאז, ו III) אופטימיזציה של גילוי חלבונים זרחליים על המערך. פרוטוקול זה הוא הראשון מסוגו ומספק מידע ייחודי על מחקר קינאז במיקרו-מיקרו של הנפה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>364 well plates (for arraying)</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>x7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 &#181;L 96-well collection plate</td>
			<td>Abgene</td>
			<td>AB-0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin device</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>140500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>1.00066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone 99.9%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum seal for 96 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76004-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>80370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>37535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 35</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>BP345-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeepWell Block, case of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-intercalating dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plates</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA77002804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Permeable Seals, box of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass box</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human-based IVTT system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPure Mouse IgG whole molecule</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>31202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (Potassium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4(Potassium phosphate monobasic)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Protein Phosphatase</td>
			<td>new england biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifterslips, 24 x 60 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25X60I24789001LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal 30-slide rack with no handles</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4 (Sodium orthovanadate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOAc (Sodium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410.10 / 740414.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoprep Anion II</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740503.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>79617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution (0.01%)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Phosphatase (Lambda)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs, Inc</td>
			<td>44904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica packets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100489-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single well plate</td>
			<td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (3M, pH 5.5)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB media (Terrific Broth)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T0918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>IBI scientific</td>
			<td>IB70144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td>Maker/model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable chilling incubator</td>
			<td>Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker for bacterial growth</td>
			<td>ATR Multitron shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold with liquid waste trap</td>
			<td>MultiScreenVacuum Manifold 96 well</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well autopippetor/liquid handler</td>
			<td>Genmate or Biomek FX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser</td>
			<td>Wellmate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarrayer</td>
			<td>Genetix QArray2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic hybridization station</td>
			<td>Tecan HS4800 Pro Hybridization Station</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Tecan PowerScanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray data quantification</td>
			<td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays

הקרנת מעכבי קינאז חיונית להבנה טובה יותר של התרופה ולזיהוי יעדים שעלולים להיות חדשים עם השלכות קליניות. מספר מתודולוגיות דווחו לביצוע הקרנה כזו. עם זאת, לכל אחד יש מגבלות משלו (לדוגמה, הקרנת התוכנה האנלוגית של ATP בלבד, הגבלה לשימוש בתחומים של קינאז מטוהרים, עלויות משמעותיות הקשורות לבדיקות יותר מכמה כלוניות בזמן, וחוסר גמישות בסינון החלבונים עם מוטציות הרומן). כאן, פרוטוקול חדש הגוברת על חלק ממגבלות אלה ניתן להשתמש להקרנה משוחדת של מעכבי קינאז מוצג. חוזק של שיטה זו הוא יכולתה להשוות את הפעילות של מעכבי קינאז על פני חלבונים מרובים, בין הקינסים שונים או גרסאות שונות של אותו קינאז. מיקרומערכים חלבון מורכבים הנוצרים באמצעות הביטוי של הקיסים חלבונים על ידי האדם מבוסס תמלול ומערכת תרגום (IVTT) מועסקים. החלבונים המוצגים על המיקרו-מערך פעילים, ומאפשרים מדידה של השפעות מעכבי קינאז. הפרוצדורה הבאה מתארת את שלבי הפרוטוקול בפירוט, מדור המיקרו-מערך ומהקרנה לניתוח הנתונים.

מיקרומערכים מורכבים בלבד מספקים פלטפורמה מוצקה שניתן להשתמש בהם עבור יישומים רבים וברורים, כולל גילוי ביואריקר, אינטראקציות חלבון חלבון, זיהוי מצע והקרנת סמים10,11 ,12,13,14,15,16,17,18,19,20.
המתודולוגיה הכללית שאומצה לחקר הפעילות של קינאז והקרנת מעכבי הטירולה במיקרו-מיקרו-מיקרומערכים מיוצגים באיור 1. ראשית, מיקרומערכים של הנפה מופקים על-ידי השתק של cDNA וסוכן לכידה על המיקרומערכים הצופים. CDNAs משמשים לאחר מכן כתבנית עבור תמלול ותרגום של חלבונים, באמצעות מערכת ה-IVTT האנושית מבוססת, ואת החלבונים החדשים מסונתז הם מקיבוע על ידי סוכן לכידת9. ניתן לנטר את איכות המיקרו-מערך המודפס על-ידי מדידת רמות ה-DNA (המאשרת הדפסה עקבית) או חלבון המוצג במערך (אישור ביטוי חלבון ולכידה; איור 1). כדי להקטין את אות הרקע ולהגדיל את הטווח הדינמי של הניסוי, המיקרו-מערכים מטופלים עם 1) למדא פוספטאז כדי להסיר זירחון מפסולת Ser/שאריות, ואז עם 2) DNase כדי לפשט את הכימיה במקום ולהקטין רקע (איור 1).
השלב הבא הוא התגובה האוטומטית הבאה, שבה מיקרו מערכים מודבטים עם מאגר קינאז בהעדר ATP (מערך בקרה שלילי, המכונה מיקרו-מערכים מדיזליים), ומאגר קינאז הינו בתוספת ATP (בקרה חיובית, המכונים מערכים הנמצאים בתצוגה מקדימה) או ב-ATP + DMSO (בקרת רכב). יש להדגיש כי במהלך שלב זה, אף קינאז לא נוספה; לפיכך, הפעילות הפנימית של כל קינאז המוצגת על המיקרו-מערך היא בכמת באמצעות מדידה של רמות זירחון שלה באמצעות הפאן נגד פוספפו-זרחן, ואחריו נוגדן משני cy3-labbeled (איור 1).
בקרת איכות של מערכי נאפה-קינאז המציגה פאנל של מעטפת חלבונים אנושיים המודפסים בקורופליקיטה מוצגת באיור 2. רמות של ה-DNA הקיבוע נמדדו על ידי כתמים DNA וזה הראה אות אפילו על פני microarray, מציע את כמות ה-DNA המודפס על המערך היה אחיד. כמו כן ניתן להתבונן במספר תכונות ללא כתמים של דנ א. תכונות אלה מתאימות לפקדים מסוימים שבהם ה-DNA הושמט מתמהיל ההדפסה [i.e., כתמים ריקים (שום דבר לא הודפס), כתמי מים, מטוהר במקום IgG (פולי ליזין, crosslinker קשר ומטוהרים IgG), מיקס הדפסה בלבד (להשלים לערבב הדפסה: פולי ליזין בתוספת הקרומקשר ואנטי הדגל נוגדן, ללא כל דנ א)]. רמות החלבון המוצגות על המיקרומערכים נאפה-קינאז העריכו לאחר תגובת ה-IVTT באמצעות נוגדן נגד תגים.
עבור ההקרנה קינאז, הדגל שימש תג הבחירה ואת רמת החלבון המוצג על מיקרוarray נמדד באמצעות נוגדן אנטי דגל. כפי שמוצג, רוב המקומות המכילים cDNA הציג בהצלחה רמות לזיהוי חלבונים. חלק מנקודות הבקרה ללא cDNA חשף גם את האות עם נוגדן נגד הדגל: הספוט IgG (משמש כדי לזהות את הפעילות של הנוגדן המשני) וכתמים וקטוריים ריק (cDNA קודי לתג רק) (איור 2). מיקרו-מערכי נאפה-קינאז הראו באמצעות שקופיות, עם התאמה של רמות התצוגה החלבונים בקרב אצוות הדפסה ברורות יותר מ-0.88 (איור 2). בתוך אותה אצווה המתאם היה אפילו גבוה יותר, קרוב 0.92 (הנתונים לא מוצגים).
בשלב הבא, הפעילות האוטומטית של קינאז בחלבונים המוצגים על המערך נמדדה באמצעות נוגדן אנטי-פוספהו-טירולי (איור 3). חלבון מוצג על המערך הראה רמות גבוהות של זרחון חלבון לאחר הביטוי (איור 3, שמאל), אשר עשוי להיגרם על ידי פעילות פנימית קינאז של החלבון המוצג על המערך או על ידי בעלי כישורים פעילים הנמצאים בתמהיל ivtt. זרחון זה הוסר לחלוטין עם הטיפול למדא פוספספטאז ומיקרומערכים אלה שימשו לקינאז. לאחר הדרחון, תגובות באופן אוטומטי בוצעו ללא ATP לא הראו רמות משמעותיות של זירחון, כצפוי, בעוד מיקרומערכים מודבטים עם מאגר קינאז בנוכחות ATP הראה זרחון חלבון מהר ככל 15 דקות ( איור 3). עבור הקרנת התרופה, הפעילות בקינאז נמדדה לאחר 60 דקות של התגובה האוטומטית להגדלת מספר הקינסים שנבדקו.
ההשוואה בין מיקרוערכים בהם נמדדו רמות הזרחון מיד לאחר ביטוי החלבון (איור 3, שמאל) ולאחר 60 דקות של תגובת היתר (איור 3, ימין) הראו: i) חלבונים הנמדדים רק לאחר הביטוי, הרומז שהם יכולים להיות זרחתית באופן שווה על-ידי חלבונים המצויים בתמהיל ה-IVTT, אך לא ניתן להציג אותם באופן אוטומטי; ii) החלבון הזורך רק לאחר התגובה האוטומטית, הרומז שהחלבונים האלה לא היו פעילים לאחר ביטוי החלבון והנדרשים הגורמים השותפים המצויים במאגר קינאז להיות פעילים; או iii) חלבון זרחני בשני המערכים, ורומז שהם היו פעילים בשתי ההגדרות (איור 3).
כדוגמה לתוצאות שהתקבלו עבור הקרנת מעכבי טירוצין קינאז על מערכי נאפה-קינאז שלושה מעכבי הקיסים עם סלקטיביות ברורה ברחבי הקינסים בחלבון שימשו: סטרוספורטין, imatinib ו-ibrutinib. עבור כל ההקרנות, המיקרו-מיקרו-מערכים של ה-מיקרוא מואבקים בריכוזים הגדלים של TKI (החל מ-100 ננומטר ל -10 uM) במהלך התגובה האוטומטית. ה-TKI הראשון שנבדק היה סטרוספורטין, מעכב פרוטאין קינאז גלובלי, שהראה על המיקרו-מערך של קינאז על המיקרוarray ברחבי העולם כמעט כל הקיסים שנבדקו11.
הבא, imatinib נבדק, מעכבי abl ו-c-Kit משמש לטיפול לוקמיה myeloסוגני כרונית וסטרומה גידולים במערכת העיכול4,5,6,7. במערכים נאפה-קינאז imatinib הראו ירידה משמעותית בפעילות Abl1 ו-BCR-Abl1 בעוד ששאר הקינסים נותרו מושפעים ברובו (איור 4A). כימות הנתונים עבור פעילות קינאז הייתה מנורמלת כנגד המערך המנוכה ומיוצגת כאחוז ממיקרו הבקרה החיובי (הרכב בלבד). נתונים עבור TNK2 (קינאז שאינם רלוונטיים), Abl1 ו-BCR-Abl1 מוצגים באיור 4B. כצפוי, imatinib הראה עיכוב סלקטיבי לעבר Abl1 ו BCR-ABl1. הנתונים עבור c-Kit לא היו חד-משמעית עקב חוסר פעילות על מערכי בקרה חיוביים.
לבסוף, ibrutinib, מעכב ה-FDA מאושר קשר קוולנטי ברוטון של טירולך קינאז (btk), נבדק. Ibrutinib משמש כיום לטיפול במספר סוגי סרטן הקשורים דם עם btk הפרוע, כולל לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL), לימפומה תא מנטל, ו Waldenström's קרוגלוביולינמיה21,22. איור 4C, מייצג תוצאות טיפוסיות שהתקבלו עבור הקרנת ibrutinib. פעילות קינאז של ABL1 (קינאז שאינה רלוונטית) ו-BTK (היעד הקאנוני) ו-ERBB4 (מטרה חדשה פוטנציאלית) מוצגת באיור 4D. הנתונים מצביעים על ERBB4 יכול להיות מעוכב על ידי ibrutinib בצורה מסוימת מינון. , ובתא מבוסס מספר11. מפגין את כוחה של הפלטפורמה
יחד עם זאת, הנתונים מצביעים על כך שפלטפורמת microarray-קינאז מיקרוarray עשויה לשמש להקרנה משוחדת של מעכבי TK. יתר על כן, ההקרנה מהירה וניתן להתאים אישית בקלות כדי לכלול כל וריאציה של החלבון של הריבית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של בקרת איכות והקרנת מעכבי טירולך קינאז במערכים נאפה. מערכי נאפה מודפסים בקידוד cDNA עבור חלבון הריבית התמזגו עם תגית ונוגדן לכידה. במהלך תמלול ותגובת התרגום (IVTT) החלבונים מסונתז נלכדים על משטח microarray דרך התג על ידי נוגדן לכידת. בקרת איכות (QC) של המערכים מבוצעת על ידי המדידה של רמות ה-DNA מודפס על השקופית, באמצעות הצבע ה-DNA של פלורסנט-intercalating, ואת רמות החלבון המוצג על המערך באמצעות נוגדנים ספציפיים לתגים. עבור ההקרנה קינאז, מיקרו מערכים מטופלים עם DNase ו פוספספטאז, לאחר תגובת ה-IVTT, כדי להסיר את ה-DNA המודפס ואת כל זרחון שייתכן שהתרחשו במהלך סינתזה החלבון. המערכים שאינם מוכנים כעת לשימוש עבור מסך התרופות. עבור כל אחת מהקיימות, שלושה סטים של פקדים משמשים באופן שגרתי: (I) מערכים בעלי מערכי הפחת, בהם התגובה האוטומטית מבוצעת ללא ATP; (II) המיקרו-מיקרו-מערכים, שבהם התגובה האוטומטית מבוצעת בנוכחות ATP; ו (III) DMSO מטופל מערך (כלי רכב), שבו התגובה האוטומטית מבוצעת עם ATP ו DMSO. השקופיות שטופלו בריכוז שונה של מעכבי קינאז מתבצע בדיוק באותו פרוטוקול המשמש למערכים שטופלו DMSO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg"> איור 2: התוצאות הייצוגיות של בקרת איכות למערכים נאפה-קינאז התאספו בעצמם. תוכן ה-DNA נמדד על ידי ה-DNA צבען-intercalating צבע (משמאל) ורמות של חלבון מוצג על microarray נמדד על ידי אנטי דגל נוגדן (באמצע) מוצגים. מצד ימין מהווה מגרש מתאם של רמות החלבון המוצגות על שני מערכי נאפה-קינאז המודפסים בקבוצות נפרדות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg"> איור 3: התוצאות הייצוגיות של פעילות קינאז במערכים נאפה-קינאז. מיקרו-מערכים המציגים כקיסים חלבונים בקוורופלייצ'טה שימשו לחקר הפעילות בחלבון קינאז על המערך באמצעות המדידה של זרחון החלבון באמצעות נוגדן אנטי-pTyr, ואחריו נוגדן נגד עכבר cy3. מערכי בקרה ללא הטיפול בפוספספטאז/DNase וללא ATP במהלך התגובה האוטומטית שימשו למדידת זירחון הרקע לאחר ביטוי החלבון (לאחר ביטוי). המיקרומערכים הנותרים טופלו באמצעות פוספספטאז/דנ א, והתגובה האוטומטית בוצעה ללא ATP (microarrays מיקרו, שליטה שלילית) או ב-ATP (מיקרו-מערכים מיקרואוטומטיים). עבור המיקרו-מערכים האוטומטיים התגובה האוטומטית היתה בוצעה עבור 15 דקות, 30 דקות, 45 דקות, או 60 דקות, כפי שמוצג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg"> איור 4: נתונים מייצגים ממסך טירולך קינאז במערכים נאפה-קינאז. (א) פוספספטאז/DNase טיפל במערכים נאפה-קינאז הותוו בריכוזים הגדלים של imatinib במהלך התגובה האוטומטית והפעילות של קינאז הייתה מדידה עם נוגדן אנטי-פוספהו-tyr. (ב) הכמת מפעילות קינאז שנצפתה על מערכי נאפה-קינאז שנחשפו לאימאטב. הנתונים הונורממו כנגד האות של מערכי הבקרה השליליים (שאינם מצורפים) והוא מוצג כאחוז מערכי הבקרה החיוביים (התגובה האוטומטית המבוצעת בנוכחות DMSO). נתונים דומים מוצגים להקרנה של ibrutinib (C, D). דמות זו שונתה מראוף ואח '11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1. פרוטוקול אלטרנטיבי להקרנה של מעכבי טירולך קינאז במערכים נאפה באמצעות תחנת הכלאה אוטומטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

פרוטוקול מפורט ליצירת מיקרומערכים של חלבון אנושי מורכב באמצעות הקרנת מעכבי הסרט מוצג.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

NAPPA היא פלטפורמת microarray חלבון רב עוצמה שניתן להשתמש בהם לחקר פעילות החלבון ותפקוד באופן תפוקה גבוהה משוחדת. החלבונים המוצגים על NAPPA מיוצרים במערכת ביטוי אנושית באמצעות ריבוזום ומשגיחים שמקורם בבני אדם על מנת לשפר את הסבירות לקיפול ופעילות טבעיים. השימוש במערכי NAPPA להקרנת מעכבי קינאז מספק פלטפורמה חדשה לבדיקת תרופות חדשות ומוטציות קינאז רלוונטיות קלינית.ניתן להשתמש במיקרו-סדרים של חלבונים הנוצרים על ידי מתודולוגיית NAPPA עבור יישומים שונים רבים, כולל גילוי סמנים ביולוגיים, אינטראקציות חלבון-חלבון, זיהוי מצעים והקרנת תרופות. בצע שלבי בקרת איכות לאורך הדרך. בדוק את איכות הכנת הדנ"א שלך, את המיקרו-ריי של הדנ"א ואת המיקרו-ריי של החלבון.אם בכל שלב האיכות לא טובה, פשוט להתחיל מחדש. הדגימה של ההליך תהיה ליסה מילר, טכנאית במעבדה שלי. כדי להכין צמיחה חיידקית בבית תפוקה גבוהה מיני הכנה, תחילה לחסן את החיידקים בצלחת auger בפורמט 96 גם, ולתת לו לגדול במשך 16 שעות.למחרת, למלא כל באר של צלחת באר עמוקה עם 1.5 מיליליטר של מדיום מרק נהדר, בתוספת אמפיצילין נוגדנים. הנוגדן תלוי בסמן הבחירה בפלסמיד. לאחר מכן, לעקר מכשיר 96 פינים עם 80% אתנול ולהבה.השתמש במכשיר סטרילי 96 פינים כדי לבחור מושבות מצלחת אגר דגירה לילה להיכנס לתוך בארות של צלחת באר עמוקה כדי לחסן את התרבות. מכסים את הבלוק עם חותם חדיר לגז ודגירה על שייקר במשך 22 עד 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, ו 300 עד 800 סל"ד. לאחר מכן, תרבויות גלולה ו resuspend התרבויות על פי כתב היד.Lyse חיידקים על ידי הוספת 200 microliters של פתרון שתיים לתוך כל באר, לאטום את הצלחת עם חותם אלומיניום, ולהפוך חמש פעמים. דגירה התאים בדיוק חמש דקות. כדי לנטרל את הפתרון, להוסיף 200 microliters של פתרון שלוש, לאטום את הצלחת עם חותם אלומיניום, ולהפוך חמש פעמים.לאחר מכן, לסובב את הצלחת ב 3800 G, ארבע מעלות צלזיוס, במשך 30 דקות כדי לנקות את על טבעי ליסנט. כדי להכין צלחות שרף חילופי אניון, ראשית, מערבבים את תרחיף חילופי אניון, ויוצקים את תרחיף לתוך שוקת זכוכית. מחסנית צלחות מסנן על גבי צלחת באר עמוקה לפעול ככלי איסוף פסולת.לאחר מכן, באמצעות טיפים P1000 לוח רחב, לערבב את תרחיף, ולהעביר 450 microliters של תרחיף לתוך כל באר של לוחות המסנן. צנטריפוגה ולהשליך את הזרימה דרך. עכשיו, להעביר את על טבעי ליסאט לערימה של צלחת שף וגוש עמוק היטב.סובבו את הלוחות המוערמים במשך חמש דקות במהירות של פי 30 עם מהירות הרמפה האיטית ביותר והשליכו את הזרימה. כדי לשטוף את העמודה, להוסיף 400 microliters של פתרון N3 לשטוף מאגר לכל באר. מעבירים את צלחת שף לסעפת ואקום כדי להסיר את מאגר לשטוף.חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים ולאחר מכן להסיר כל חיץ מכונת כביסה שנותר עם ספין קצר חמש דקות ב 30 פעמים G.To להניף את ה-DNA, מניחים את צלחת השדר על צלחת נקייה 800 מיקרוליטר איסוף. הוסף 300 microliters של פתרון N5 לכל באר ולתת לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות. לאחר מכן, לסובב את הלוחות מוערמים במשך חמש דקות ב 20 פעמים G עם מהירות רמפה איטית עד 233 פעמים G במשך דקה אחת.יש לאחסן צלחות ב-20 מעלות צלזיוס לפני השימוש. ראשית, מניחים את השקופיות על מתלה ומטביעים את השקופיות במאגר זכוכית המכיל את פתרון הציפוי של 2%aminosilane reagent באצטון. רוק המגלשות במשך 15 דקות.לאחר מכן, לשטוף את המגלשות אצטון ואחריו שטיפה סופית במים. לאחר מכן, לייבש את השקופיות באמצעות אוויר לחוץ. נושבת עליהם מכל הזוויות במשך כשלוש דקות עד שכל טיפות המים הוסרו.אחסן את המגלשות המ מצופות בטמפרטורת החדר על מתלה מתכת בתוך קופסה אטומה היטב. עכשיו, להמשיך לזרז את ה-DNA כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולת הדנ"א ב-20 מיקרוליטרים של מים אולטרה-חמים ותנער ב-1,000 סל"ד למשך שעתיים.להכנת דגימת מערך, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תערובת הדפסה טרייה המכילה את הנוגדן, ההצלבה והפוליסין לכל דגימת דנ"א. אטם צלחות עם רדיד אלומיניום לנער בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות ב 1000 סל"ד. לאחסן את הצלחות לילה בארבע מעלות צלזיוס.ביום ההדפסה, מערבולת קצרה ולסובב את הצלחות. מעבירים 28 מיקרוליטרים של כל דגימה לצלחת של 384 בארות. מניחים את השקופיות מצופות aminosilane ואת צלחת 384 היטב, על סיפון arrayer, ולהתחיל את תוכנית ההדפסה microarray.לאחר שההדפסה תסיים, תייג את המיקרו-ריי. ניתן לאחסן את המיקרו-ריי במשך חודשים עד לשימוש נוסף. כדי למדוד את רמות הדנ"א, מקם את השקופיות בתיבת פיפטה וחסום אותן עם 50 מיליליטר של חיץ חסימה.הדגירה את המגלשות על שייקר נדנדה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לאחר מכן, להשליך את הפתרון ולהוסיף 20 מיליליטר של חיץ חסימה ו 33 microliters של צבע פלורסנט DNA intercalating. דגירה במשך 15 דקות עם תסיסה.לאחר שהדוגירה נגמרת, שטפו במהירות את המגלשות במים טהורים במיוחד ויבשים באוויר לחוץ. המיקרו-ריי מוכנים לסריקה. כדי לבטא את microarrays, לחסום את השקופיות כפי שהוצגו בעבר ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים טהורים במיוחד, ויבש עם אוויר דחוס מסונן.חבר אטם איטום לכל מגלשה. הוסיפו 130 מיליליטר של תמלול ותרגום במבחנה לערבב על השקופיות, בעדינות לעסות את אטמי איטום כך תמלול במבחנה תערובת תרגום מתפשט ומכסה את כל האזור של המערך ללא בועות. החל את אטמי היציאה העגולים הקטנים על שתי היציאות.דגירה במשך 90 דקות ב 30 מעלות צלזיוס לביטוי חלבון, ואחריו 30 דקות ב 15 מעלות צלזיוס עבור קיבוע של חלבון השאילתה. לאחר מכן, להסיר את אטם, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד 15 מיליליטר TBST עם חלב, ולחסום באותו פתרון במשך שעה אחת. לגילוי החלבונים במערך, הסר את ה- TBST עם חלב, הנח את השקופיות על צלחת רשת והחל 600 מיקרוליטרים של נוגדן ראשי, עכבר נגד דגל, מדולל 1 עד 200, ו- 1x TBST בתוספת 5%חלב.דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר. לשטוף את השקופיות עם 50 מיליליטר של 1x TBST ו 5% חלב על שייקר נדנדה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. חזור על ההליך עבור הנוגדן המשני.לאחר הדגירה של שעה אחת נגמר, לשטוף את השקופיות עם 1x TBST על שייקר נדנדה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן, שטפו במהירות את המגלשות במים טהורים במיוחד, והתייבשו באמצעות אוויר לחוץ. השקופיות מוכנות לסריקה.כדי לבצע את הטיפול phosphatase ו DNase, לשטוף ולחסום את השקופיות לידי ביטוי עם TBST בתוספת 3%BSA כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, מניחים את השקופיות על צלחת רשת ולהחיל 200 microliters של פתרון DNase פוספטאז. מניחים פתק כיסוי microarray על גבי כדי למנוע אידוי.דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ו 30 דקות בתנור. לאחר מכן, לשטוף שקופיות עם 1x TBST ו 0.2 כלוריד נתרן טוחן על שייקר נדנדה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. כדי לבצע את הטיפול התרופתי ואת תגובת קינאז, מניחים את השקופיות על צלחת הרשת ולהחיל 200 microliters של פתרון קינאז סמים.מניחים פתק כיסוי על גבי כדי למנוע אידוי. דגירה במשך שעה אחת ב 30 מעלות צלזיוס בתנור. המפתח לשחזור נתונים הוא זמן דגירה עקבי בין שקופיות.זה חשוב במיוחד במהלך תגובת קינאז. יש לקחת בחשבון את הזמן הדרוש לעיבוד כל שקופית. לאחר מכן, לשטוף שקופיות עם 1x TBST ו 0.2 נתרן כלורי טוחן על שייקר נדנדה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד.חזור על גילוי חלבון באמצעות נוגדן נוגדן ראשוני phosphotyrosine מדולל אחד עד 100 ב TBST, בתוספת אלבומין סרום 3%bovine. השתמש 1x TBST ו 3%bovine סרום אלבומין לשטיפה לאחר הדגירה עם נוגדן ראשוני, ו TBST עבור שטיפות לאחר דגירה עם נוגדנים משניים. לשטוף ולייבש כבעבר.לרכישת תמונה, טען את המיקרו-ריי למגזין מחזיק השקופיות. טען את המגזין לסורק המיקרו-ריי. סרוק את כל המיקרו-סדרים עם ההגדרות הממוטבות וזכור לבטל את הרווח האוטומטי בעת השוואת תמונות בין ניסויים.העבר את התמונות לתוכנה לכימות, יישר את הרשת עם הנקודות וכמת את עוצמת האות של כל תכונה במיקרו-ריי. המשך בניתוח סטטיסטי. במחקר זה, microarray הראה את רוב כתמים המכילים DNA משלים הציג בהצלחה רמות לזיהוי של חלבון.נת"א קינאז microarrays הראה רבייה טובה בין שקופיות, עם המתאם של רמות תצוגת החלבון בין אצוות הדפסה נפרדות גבוה מ 0.88. תוצאות מייצגות של פעילות קינאז במערכי NAPPA קינאז הראו רמות גבוהות של זרחון חלבון לאחר הביטוי. ההשוואה בין מיקרו-ריי שבהם נמדדו רמות הזרחן מיד לאחר הטיפול בפוספטאז, ולאחר 60 דקות של תגובת זרחון אוטומטי, מרמזת על נוכחות של קינאזות חלבון פעילות במערך.על מערכי NAPPA קינאז, imatinib הראה ירידה משמעותית בפעילות ABL1 ו BCR-ABL1, בעוד kinases אחרים נשארו מושפעים בעיקר. פעילות קינאז מנורמל נגד המערך dephosphorylated ומיוצג כאחוז microarray שליטה חיובית הראה עיכוב סלקטיבי של imatinib כלפי ABL1 ו BCR-ABL1. תוצאות אופייניות שהושגו עבור ההקרנה ibrutinib הראו את פעילות קינאז של קינאז ABL1 לא רלוונטי אינו מושפע.יעד קנוני BTK, ו ERBB4 יעד חדש פוטנציאלי, הראה פעילות מופחתת בנוכחות ibrutinib. הנתונים מראים ERBB4 יכול להיות מעוכב על ידי ibrutinib באופן ספציפי מינון. ההצלחה של הקרנות microarray חלבון תלויים מאוד באיכות של microarray עצמו.יש להשתמש במספר תכונות בקרה חיוביות ושליליות כדי לאפשר ניתוח נתונים תקין. בדיקת NAPPA kinase היא פלטפורמת סינון, וככזה, יש לאמת את הנתונים המתקבלים בבדיקות מעקב, שעשויות לכלול בדיקות מבוא קינאז, או בדיקות מבוססות תאים. מאז הפרוטוקול שלנו מתחיל עם cDNA, כל מוטציה קינאז או וריאציה ניתן לשלב בקלות microarray ונחקר בתפוקה גבוהה.במהלך הכנת שרף חילופי אניון תרחיף וצלחות, מומלץ להשתמש במסכות כדי למנוע שאיפה אפשרית של חלקיקי שרף.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

גניבות של גבישי חלבון עם I3C באמצעות הקרנת מטריצת מיקרו-זרעים אקראית

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...