Name: kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

लेखक परियोजना के विकास के दौरान उनकी मदद और आलोचना के लिए LaBaer प्रयोगशाला में सभी को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस परियोजना NIH अनुदान U01CA117374, U01AI077883 और वर्जीनिया जी पाइपर फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.

<ol>
	<li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+kinases.">Targeting protein kinases.</a> Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).</li><li>Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+inhibitors+in+the+treatment+of+inflammatory+and+autoimmune+diseases.">Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases.</a> Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).</li><li>Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA-approved+small-molecule+kinase+inhibitors.">FDA-approved small-molecule kinase inhibitors.</a> Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).</li><li>Heinrich, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+c-kit+receptor+tyrosine+kinase+activity+by+STI+571,+a+selective+tyrosine+kinase+inhibitor.">Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor.</a> Blood. 96 (3), 925-932 (2000).</li><li>Stagno, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+mesylate+in+chronic+myeloid+leukemia:+frontline+treatment+and+long-term+outcomes.">Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes.</a> Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).</li><li>Ben Ami, E., Demetri, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safety+evaluation+of+imatinib+mesylate+in+the+treatment+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor.</a> Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).</li><li>Ramachandran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+microarrays.">Self-assembling protein microarrays.</a> Science. 305 (5680), 86-90 (2004).</li><li>Festa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+microarray+production+of+freshly+expressed+proteins+in+a+human+milieu.">Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu.</a> Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).</li><li>Rauf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inhibition+of+ERBB4+reduces+cell+growth+in+a+WNT5A-dependent+manner.">Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner.</a> Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).</li><li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarray+signature+of+autoantibody+biomarkers+for+the+early+detection+of+breast+cancer.">Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer.</a> Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Autoantibodies+Associated+with+Basal-like+Breast+Cancers.">Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).</li><li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+Antibody+Immunome+in+Type+1+Diabetes+Using+Protein+Arrays.">Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays.</a> Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Antibody+Targets+for+Tuberculosis+Serology+using+High-Density+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays.">Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Autoantibody+Responses+between+Lung+Adenocarcinoma+and+Benign+Pulmonary+Nodules.">Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules.</a> Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).</li><li>Montor, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+Pseudomonas+aeruginosa+outer+membrane+protein+immunogenicity+using+self-assembling+protein+microarrays.">Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays.</a> Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).</li><li>Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+Protein-Protein+Interactions+Using+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays.">Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+(click+chemistry)-based+detection+of+global+pathogen-host+AMPylation+on+self-assembled+human+protein+microarrays.">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).</li><li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+signature+for+the+serologic+detection+of+ovarian+cancer.">Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).</li><li>Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B-cell+receptor+signaling+pathway+as+a+therapeutic+target+in+CLL.">The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL.</a> Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).</li><li>Smith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+in+B+lymphoid+malignancies.">Ibrutinib in B lymphoid malignancies.</a> Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).</li><li>Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cloning+and+expression+library+creation+for+functional+proteomics.">High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics.</a> Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).</li><li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).</li></ol>

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

प्रोटीन kinases अपने लक्ष्य के फॉस्फोरिलेशन के लिए जिम्मेदार हैं और जटिल आणविक रास्ते है कि कई सेलुलर कार्यों को नियंत्रित (यानी, सेल प्रसार, भेदभाव, सेल मौत और अस्तित्व) को नियंत्रित मोड्यूल कर सकते हैं। kinase गतिविधि के विनियमन 400 से अधिक रोगों के साथ जुड़ा हुआ है, kinase inhibitors कैंसर, हृदय और तंत्रिका संबंधी विकारों के साथ ही भड़काऊ सहित कई रोगों के उपचार के लिए उपलब्ध दवाओं के मुख्य वर्गों में से एक बना और ऑटोम्यून्यून रोग1,2,3.
सटीक चिकित्सा के आगमन के साथ, नए उपचार की पहचान, विशेष रूप से kinase inhibitors, महान अपील दवा और चिकित्सकीय है. काइनेज इनहिबिटर ोंके डे नोवो डिजाइन और मौजूदा एफडीए-अनुमोदित औषधियों के लिए नए लक्ष्यों की पहचान सहित काइनेज/किनेस इनहिबिटरों के संभावित नए जोड़े की पहचान के लिए कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है। बाद विशेष रूप से आकर्षक है, के बाद से समय और पैसे क्लीनिक में इन दवाओं को लागू करने के लिए आवश्यक काफी पिछले नैदानिक परीक्षण डेटा की उपलब्धता के कारण कम कर रहे हैं. एक kinase अवरोध करनेवाला के repurposing का एक विहित उदाहरण imatinib है, शुरू में बीसीआर-Abl के निषेध के माध्यम से पुरानी myelogenous ल्यूकेमिया (सीएमएल) के उपचार के लिए डिजाइन, जो भी सफलतापूर्वक सी-किट के उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अधिक-व्यक्त जठरांत्र stromal ट्यूमर (GISTs)4,5,6,7.
काइनेज अवरोधकों की स्क्रीनिंग बाध्यकारी परख या एंजाइमी आधारित परख में की जा सकती है। परख के प्रथम श्रेणी प्रोटीन दवा बातचीत पर केंद्रित है और इस तरह के ligation साइट और आत्मीयता के रूप में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. चूंकि इन परख के समय kinase की गतिविधि अज्ञात है, बातचीत के एक नंबर याद किया जा सकता है या गलत प्रोटीन में अनुरूप परिवर्तन के कारण पहचान की. दूसरी ओर, एंजाइमी आधारित परख प्रोटीन kinases सक्रिय होने की आवश्यकता है और एंजाइम गतिविधि पर अवरोध करनेवाला के प्रभाव के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं, तथापि, स्क्रीनिंग के इस प्रकार आम तौर पर अधिक समय लगता है और महंगा है. वर्तमान में, परख के दोनों प्रकार के कई स्रोतों से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. वे कुछ सीमाओं के साथ kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए एक विश्वसनीय विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं, सहित: मैं) तरीकों के अधिकांश कई kinases व्यक्तिगत रूप से परीक्षण शामिल है, जो प्रोटीन का एक बड़ा सेट की स्क्रीनिंग महंगा कर सकते हैं; II) परीक्षण किया जा करने के लिए kinases के सेट preselected, जंगली प्रकार kinases और कुछ kinases के कई प्रसिद्ध उत्परिवर्तित संस्करणों की एक सूची तक ही सीमित है, कई नए उत्परिवर्तित isoforms के परीक्षण में बाधा.
इस संदर्भ में, प्रोटीन microarrays व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तकनीकों द्वारा प्रस्तुत सीमाओं में से कुछ पर काबू पाने में सक्षम एक शक्तिशाली मंच हैं. यह ब्याज के किसी भी अनुक्रम के पूर्ण लंबाई, सक्रिय प्रोटीन का उपयोग कर उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग में एंजाइमी आधारित परख प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त है। microarrays NAPPA (न्यूक्लिक एसिड प्रोग्राम प्रोटीन सरणी) की तरह एक आत्म इकट्ठे दृष्टिकोण द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है, जिसमें प्रोटीन सिर्फ परख के लिए समय में व्यक्त कर रहे हैं, संभावना है कि सरणी पर प्रदर्शित उन वास्तव में सक्रिय हैं बढ़ रही है. NAPPA पर प्रदर्शित प्रोटीन प्राकृतिक तह और गतिविधि की संभावना में सुधार करने के क्रम में मानव व्युत्पन्न राइबोसोम और chaperone प्रोटीन का उपयोग कर उत्पादन कर रहे हैं.
प्रोटीन शुरू में एक कब्जा टैग के साथ जुड़े ब्याज के जीन के लिए कोडिंग cDNAs मुद्रण द्वारा क्रमादेशित रहे हैं, एक कब्जा एजेंट के साथ, microarray सतह पर. प्रोटीन तो एक इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद (IVTT) प्रणाली का उपयोग कर microarrays पर उत्पादित कर रहे हैं, और ताजा व्यक्त प्रोटीन कब्जा एजेंट द्वारा microarray सतह पर स्थिर कर रहे हैं. व्यक्त एनपीए सरणियों का उपयोग सरणी पर प्रदर्शित प्रोटीनों के अध्ययन के लिए एक निष्पक्ष, उच्च थ्रूपुट तरीके से किया जा सकताहै 8,9.
पहले, यह दिखाया गया था कि NAPPA सरणियों पर प्रदर्शित प्रोटीन ठीक से मोड़ रहे हैं ज्ञात भागीदारों के साथ बातचीत करने के लिए10; इसके अलावा, उनकी एंजाइमी गतिविधि पहली बार 2018 में शोषण किया गया था, जब यह दिखाया गया था कि प्रोटीन kinases microarray autophosphorylate11पर प्रदर्शित . आज तक, नेपा पद्धति का उपयोग कई विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए किया गया है , जिनमें बायोमार्कर खोज12,13,14,15,16,17, प्रोटीन प्रोटीन बातचीत10,18, सब्सट्रेट पहचान19, और दवा स्क्रीनिंग11. इसका लचीलापन मंच की प्रमुख विशेषताओं में से एक है जो प्रत्येक आवेदन के लिए अनुकूलन की अनुमति देता है।
यहाँ, स्वयं इकट्ठे NAPPA सरणियों में tyrosine kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. मंच सक्रिय मानव प्रोटीन kinases के प्रदर्शन के लिए और प्रोटीन kinase गतिविधि के विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, कम पृष्ठभूमि और उच्च गतिशील रेंज के साथ. kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए NAPPA का उपयोग करने के लिए लागू संशोधनों में शामिल हैं: मैं) मुद्रण रसायन विज्ञान में परिवर्तन, द्वितीय) kinase अवरोधक स्क्रीनिंग से पहले प्रोटीन microarray के de-फॉस्फोरिलेशन, और III) का पता लगाने का अनुकूलन सरणी पर फॉस्फोरीयुक्त प्रोटीन. यह प्रोटोकॉल अपनी तरह का पहला प्रोटोकॉल है और एनपीए माइक्रोरेरेसिस में काइनाज अध्ययन के बारे में अद्वितीय जानकारी प्रदान करता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>364 well plates (for arraying)</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>x7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 &#181;L 96-well collection plate</td>
			<td>Abgene</td>
			<td>AB-0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin device</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>140500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>1.00066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone 99.9%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum seal for 96 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76004-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>80370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>37535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 35</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>BP345-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeepWell Block, case of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-intercalating dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plates</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA77002804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Permeable Seals, box of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass box</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human-based IVTT system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPure Mouse IgG whole molecule</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>31202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (Potassium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4(Potassium phosphate monobasic)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Protein Phosphatase</td>
			<td>new england biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifterslips, 24 x 60 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25X60I24789001LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal 30-slide rack with no handles</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4 (Sodium orthovanadate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOAc (Sodium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410.10 / 740414.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoprep Anion II</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740503.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>79617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution (0.01%)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Phosphatase (Lambda)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs, Inc</td>
			<td>44904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica packets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100489-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single well plate</td>
			<td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (3M, pH 5.5)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB media (Terrific Broth)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T0918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>IBI scientific</td>
			<td>IB70144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td>Maker/model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable chilling incubator</td>
			<td>Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker for bacterial growth</td>
			<td>ATR Multitron shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold with liquid waste trap</td>
			<td>MultiScreenVacuum Manifold 96 well</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well autopippetor/liquid handler</td>
			<td>Genmate or Biomek FX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser</td>
			<td>Wellmate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarrayer</td>
			<td>Genetix QArray2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic hybridization station</td>
			<td>Tecan HS4800 Pro Hybridization Station</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Tecan PowerScanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray data quantification</td>
			<td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays

kinase inhibitors की स्क्रीनिंग एक दवा के गुणों को बेहतर समझने के लिए और नैदानिक प्रभाव के साथ संभावित नए लक्ष्यों की पहचान के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसी स्क्रीनिंग को पूरा करने के लिए कई तरीकों की सूचना दी गई है। हालांकि, प्रत्येक की अपनी सीमाएं हैं (उदाहरण के लिए, केवल एटीपी एनालॉग की स्क्रीनिंग, शुद्ध kinase डोमेन का उपयोग करने के लिए प्रतिबंध, एक समय में कुछ kinases से अधिक परीक्षण के साथ जुड़े महत्वपूर्ण लागत, और प्रोटीन kinases स्क्रीनिंग में लचीलेपन की कमी के साथ उपन्यास उत्परिवर्तन). यहाँ, एक नया प्रोटोकॉल है कि इन सीमाओं में से कुछ पर काबू पाने और kinase inhibitors के निष्पक्ष स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रस्तुत किया है. इस विधि की एक ताकत कई प्रोटीन भर में kinase inhibitors की गतिविधि की तुलना करने की क्षमता है, या तो अलग kinases या एक ही kinase के विभिन्न वेरिएंट के बीच. एक मानव आधारित इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद प्रणाली (IVTT) द्वारा प्रोटीन kinases की अभिव्यक्ति के माध्यम से उत्पन्न स्वयं इकट्ठे प्रोटीन microarrays कार्यरत हैं. microarray पर प्रदर्शित प्रोटीन सक्रिय हैं, kinase inhibitors के प्रभाव की माप के लिए अनुमति देता है. निम्न कार्यविधि प्रोटोकॉल चरणों का विस्तार से वर्णन करती है, माइक्रोरेरे जनरेशन और स्क्रीनिंग से डेटा विश्लेषण तक.

Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए स्वयं इकट्ठे मानव प्रोटीन microarrays की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.

Kinase अवरोधक स्क्रीनिंग में स्वयं इकट्ठे मानव प्रोटीन Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

रेडियोलैलेड एटीपी के साथ प्रोटीन किनास गतिविधि पर काबू पाने

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

पेप्टाइड माइक्रोरायर्स के साथ हिस्टोन एंटीबॉडी विशिष्टता का विश्लेषण

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin के आश्रित कळेनासे 1 विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान एक इन विट्रो कळेनासे परख

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

अंशांकन-मुक्त इन विट्रो ठहराव में प्रोटीन होमो-oligomerization का उपयोग कर वाणिज्यिक इंस्ट्रूमेंटेशन और नि: शुल्क, खुला स्रोत चमक विश्लेषण सॉफ्टवेयर

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

रै10 फॉस्फोरिलेशन का आकलन करके पार्किंसंस के एसोसिएटेड LRRK2 Kinase पाथवे से पूछताछ के लिए मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल अलगाव

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

स्तनधारी कोशिका चक्र के दौरान सक्रिय प्रोटीन काइनेज आरएनए के आरएनए इंटरएक्टर्स का अध्ययन

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

एक नई Kinase प्रोटीन के मजबूत जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग कर आणविक स्तर पर विशेषता

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

थर्मोटोगा मैरिटिमा झिल्ली-बाउंड पायरोफोस्फेटेसे अवरोधकों के लिए स्क्रीनिंग

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

रैंडम माइक्रोसीेड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग का उपयोग करके I3C के साथ प्रोटीन क्रिस्टल का व्युत्पन्न

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...