Name: kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer a todos no laboratório da LaBaer por sua ajuda e críticas durante o desenvolvimento do projeto. Este projeto foi apoiado pela subvenção NIH U01CA117374, U01AI077883 e Virginia G. Piper Foundation.

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Os autores não declaram conflitos de interesse.

Modificações e solução de problemas Durante a fase de otimização do estudo da atividade quinase em matrizes NAPPA, uma das principais fontes de fundo e baixa faixa dinâmica observada foi a BSA utilizada na mistura de impressão. BSA estava fornecendo as aminas primárias necessárias para a reticulação com a superfície do de e estava prendendo o DNA e o anticorpo de captura no local. No entanto, a BSA é altamente fosforilada, dificultando a detecção do sinal de autofosforilação na matriz acima do ruído de fundo. Para resolver este problema, foram testadas várias alternativas para a BSA na mistura de impressão, e a poli-lisina foi identificada como boa substituta. A poli-lisina carece de qualquer local de fosforilação; Portanto, o plano de fundo de matrizes não expressas é muito mínimo. Além disso, os microarrays impressos com poli-lisina são reprodutíveis e exibem bons níveis de proteínas (Figura 2).
A modificação crítica seguinte executada no ensaio padrão de NAPPA era a adição de uma etapa do tratamento da fosfatase/DNase. O tratamento dos Microarrays com fosfatase permite a remoção de qualquer fosforilação ocorrida na mistura de IVTT durante a síntese protéica e captação (Figura 3). A fonte desta fosforilação pode ser proveniente da atividade de autofosforilação intrínseca ou da atividade das cinases presentes na mistura de IVTT. A remoção de toda a pós-expressão de fosforilação permitiu a fácil identificação das cinases ativas e podem sofrer autofosforilação (Figura 3).
Etapas críticas dentro do protocolo NAPPA é uma tecnologia robusta, mas como esperado, existem várias etapas críticas. A primeira é a aquisição de DNA de alta qualidade na concentração apropriada. O uso de DNA de má qualidade ou em baixas concentrações gerará Microarrays de baixa qualidade com diversas características que não estão sendo expressas e exibidas nos níveis adequados, diminuindo o número de proteínas analisadas na matriz. A segunda etapa crítica é a expressão de proteínas no microarray. O uso de um sistema de IVTT que expresse níveis elevados de proteína funcional é vital para estudar a atividade da quinase na disposição.
O próximo passo crítico na triagem TKI é como os microarrays são manipulados. Os microarrays não devem secar durante nenhuma etapa do protocolo, e a manipulação delicada é recomendada impedir os riscos que podem aumentar o sinal do fundo. Como as matrizes de todo o experimento serão comparadas entre si, é importante garantir que cada etapa de incubação seja mesmo em todos os slides. Por exemplo, o tempo necessário para executar uma etapa em uma única matriz deve ser levado em consideração quando um lote de 20 matrizes é processado para evitar diferenças no comprimento de incubação entre matrizes.
Por fim, o delineamento do experimento e a inclusão de controles positivos e negativos são críticos para o controle de qualidade e a análise dos dados. O primeiro conjunto de controles são aqueles impressos em cada matriz e inclui controles negativos [ou seja, manchas vazias (sem qualquer material impresso), água ou vetor vazio (expressar apenas a marca)], bem como um controle positivo (i.e., IgG purificada, que é detectado pelo anticorpo secundário e é inerte para alteração nos níveis de fosforilação). Coletivamente, eles medem os níveis de fundo do microarray, possível transição durante a impressão e a intensidade do sinal do método de detecção.
O próximo conjunto de controles são os controles de triagem de drogas e incluem os microarrays dephosphorylated e autophosphorylated (na presença ou ausência de DMSO). Como mencionado mais cedo, o microarray dephosphorylated mede o nível de fosforilação após o tratamento da fosfatase e conseqüentemente o nível da linha de base para todos experimentos restantes. Quanto menor o nível basal, maior o alcance dinâmico dos ensaios. Os arrays autofosforilados apresentam os níveis máximos de fosforilação de todas as matrizes e o sinal deve ser forte e claro. Ele é usado para análise de dados, mas também como um controle que todas as reações foram executadas com êxito na matriz.
Limitações da técnica A partir de agora, uma das limitações da triagem de drogas aqui apresentada é a sua capacidade de tela apenas proteínas quinases que podem ser autofosforiladas. Uma maneira possível de superar isso é imprimir uma quinase e substrato conhecido no mesmo local. A co-impressão do ADN para duas proteínas distintas foi realizada com sucesso15, sugerindo a viabilidade desta aproximação. Além disso, a proteína indicada na matriz pode não ser dobrada corretamente, resultando em uma proteína inativa. O uso do sistema de expressão com base humana fez uma melhora significativa na atividade da quinase medida na matriz; no entanto, algumas proteínas ainda não podem ser analisadas na matriz devido à sua inatividade.
Uma segunda limitação é a medida da fosforilação utilizando um anticorpo antifosho-Tyr Pan. Apesar de sua não especificidade em relação ao motivo do local da fosforilação, todas as fosforilações medidas ocorreram em resíduos de tirosina, deixando para trás serinas e treoninas e suas respectivas quinases. Até à data, mais de 10 anticorpos Pan fosho-ser/thr foram testados sem sucesso, apesar de várias tentativas de otimizar a incubação e as condições de lavagem. Um novo sistema de detecção que é independente de anticorpos pode ser a melhor opção para expandir o número de proteínas quinases que podem ser rastreadas para inibição de drogas. Neste contexto, algumas opções estão disponíveis, incluindo radioatividade ou abordagens químicas, como a conjugação de clique. Uma série de otimizações é necessária para minimizar o sinal de fundo e fornecer uma boa faixa dinâmica para os ensaios.
A terceira limitação é a aquisição de clones de cDNA a serem impressos no array. Os clones de cDNA podem ser gerados usando qualquer técnica de clonagem, incluindo sistemas de recombinação específicos do site, como Creator ou gateway23. Outra opção é comprar os clones da biblioteca DNAsu, encontrados em < https://Dnasu.org/dnasu/Home.do >, onde mais de 17.000 clones de cDNAs, incluindo todo o kinome humano, está prontamente disponível para ser usado para a construção de matrizes NAPPA24 .
A quarta limitação é que nem todos os laboratórios estão equipados com equipamentos adequados para fabricar e fazer a tela de seus próprios arrays NAPPA. Este protocolo fornece métodos alternativos para gerar o DNA a ser imprimido no microarray, sem a necessidade de equipamento da elevado-produção, e protocolos para executar manualmente todas as etapas da hibridação. Entretanto, o acesso a um varredor do arrayer e do microarray é ainda necessário. Uma opção para superar esse problema é usar o serviço e a facilidade do NAPPA Core, encontrados em < http://nappaproteinarray.org/>, que distribui Microarrays NAPPA personalizados a um preço acadêmico sem fins lucrativos. Por fim, a partir de qualquer metodologia de triagem, os dados obtidos nas matrizes são suscetíveis a serem artefatos (positivos ou negativos) e, portanto, devem ser validados por meio de ensaios ortogonais.
Significância em relação aos métodos existentes Várias plataformas estão disponíveis comercialmente para a triagem de proteínas quinases. Uma abordagem rotineiramente utilizada é a de ensaios vinculativos, que podem ser realizados com fragmentos proteicos, domínio quinase, maiores fragmentos proteicos com o domínio quinase e algumas regiões reguladoras, e até mesmo proteínas de comprimento total. As proteínas são geralmente expressas em sistemas bacterianos devido ao custo e simplicidade nos protocolos de expressão e purificação. A interação entre a droga do interesse e a proteína é medida então com algum tipo de ensaio do relatório como a fluorescência ou a presença de tag, por exemplo. A principal limitação deste conjunto de abordagens é o fato de que a proteína não é necessariamente ativa durante a interação com a droga, o que pode resultar na identificação de interações falso-positivas e falsas negativas. Os fragmentos proteicos são particularmente vulneráveis a alterações na conformação e falta de atividade e todos os dados obtidos devem ser validados usando proteínas ativas, preferencialmente em sua forma completa. Outra limitação de algumas das plataformas é a capacidade de tela apenas análogos de ATP, limitando seu uso geral.
A maioria dos serviços comercialmente disponíveis para a triagem de TKIs usando abordagens baseadas em enzimas utilizam apenas versões de tipo selvagem da quinase de interesse, e às vezes apenas alguns mutantes selecionados. Sabendo que a resistência à droga é muito comum em pacientes tratados com TKI, é importante ser capaz de medir a resposta medicamentosa em diferentes mutantes, para a seleção do inibidor mais adequado. Devido à natureza da NAPPA, a triagem de mutantes da quinase é simples e pode ser facilmente realizada, e a única ferramenta necessária é a incorporação do mutante da quinase na coleção de cDNA NAPPA, que pode ser feita por mutagenese local específica, por exemplo.
Aplicações futuras Uma das formas mais comuns de tratamento decorre na terapia com câncer usando inibidores da quinase é a aquisição de mutações no alvo de drogas durante um curso de tratamento. A triagem desses mutantes em relação à sua resposta aos inibidores da quinase é de vital importância para a seleção da segunda/terceira geração de TKIs para alcançar um tratamento personalizado para cada paciente. A aproximação da seleção da droga apresentada aqui, fornece uma plataforma de seleção imparcial em que todo o inibidor da tirosina quinase pode ser testado de encontro a um painel das quinases do tirosina atuais no genoma humano. Uma vez que as proteínas exibidas em matrizes NAPPA são expressas in vitro a partir do cDNA impresso no slide, qualquer variante mutante pode ser facilmente incorporado na coleção cDNA a ser exibido na matriz. A instalação em que os mutantes da quinase podem ser gerados e expressos na disposição, combinada com o poder da elevado-produção da técnica de NAPPA, fornecem um ambiente original para o estudo de mutantes da quinase e de sua resposta às drogas, fazendo NAPPA apropriado para triagem de medicamentos personalizados, um dos objetivos da medicina de precisão.

As proteínas quinases são responsáveis pela fosforilação de seus alvos e podem modular vias moleculares complexas que controlam muitas funções celulares (i.e., proliferação celular, diferenciação, morte celular e sobrevida). A desregulação da atividade da quinase está associada a mais de 400 doenças, tornando os inibidores da quinase uma das principais classes de medicamentos disponíveis para o tratamento de várias doenças, incluindo câncer, distúrbios cardiovasculares e neurológicos, bem como inflamatória e doenças auto-imunes1,2,3.
Com o advento da medicina de precisão, a identificação de novas terapias, especialmente os inibidores da quinase, têm grande apelo farmaceuticamente e clinicamente. Várias abordagens podem ser usadas para a identificação de possíveis novos pares de inibidores da quinase/quinase, incluindo o design de novo de inibidores da quinase e identificação de novos alvos para os medicamentos aprovados pela FDA existentes. Este último é especialmente atraente, uma vez que o tempo e o dinheiro necessários para implementar essas drogas em clínicas são drasticamente reduzidos devido à disponibilidade de dados de ensaios clínicos anteriores. Um exemplo canônico do Repurposing de um inibidor da quinase é imatinib, projetado inicialmente para o tratamento da leucemia Myelogenous crônica (LMC) com a inibição de BCR-abl, que pode igualmente com sucesso ser usado para o tratamento do c-kit que sobreexpressa tumores estromais gastrointestinais (GISTs)4,5,6,7.
A triagem de inibidores da quinase pode ser realizada em ensaios de ligação ou em ensaios enzimáticos. A primeira classe de ensaios centra-se em interações proteína-droga e pode fornecer informações como local de ligadura e afinidade. Desde que a atividade da quinase na altura destes ensaios é desconhecida, um número de interações pode ser faltado ou identificado falsa devido às mudanças conformacional na proteína. Por outro lado, os ensaios enzimáticos exigem que as proteínas cinases sejam ativas e forneçam informações valiosas sobre o efeito do inibidor na atividade enzimática, entretanto, esse tipo de triagem é geralmente mais demorado e dispendioso. Atualmente, ambos os tipos de ensaios estão disponíveis comercialmente a partir de várias fontes. Eles representam uma opção confiável para a triagem de inibidores da quinase com algumas limitações, incluindo: I) a maioria dos métodos envolvem testes de múltiplas cinases individualmente, o que pode tornar a triagem de um grande conjunto de proteínas dispendiosas; II) o conjunto de quinases a serem testados limita-se a uma lista de cinases pré-selecionadas, de tipo selvagem e de várias versões mutadas conhecidas de algumas cinases, dificultando o teste de muitas novas isoformas mutadas.
Neste contexto, os microarrays proteicos são uma plataforma poderosa capaz de superar algumas das limitações apresentadas pelas técnicas comercialmente disponíveis. É apropriado executar ensaios enzimáticos na triagem de alta taxa de transferência usando proteínas ativas de comprimento total de qualquer sequência de interesse. Os microarrays podem ser gerados por uma abordagem automontada como a NAPPA (matriz de proteínas programáveis de ácido nucleico), na qual as proteínas são expressas apenas a tempo para os ensaios, aumentando a probabilidade de que aqueles exibidos na matriz estejam realmente ativos. As proteínas exibidas no NAPPA são produzidas com ribossomas e proteínas de Chaperona derivadas de humanos, a fim de melhorar a probabilidade de dobramento e atividade natural.
As proteínas são programadas inicialmente imprimindo cDNAs que codificam para os genes do interesse fundidos com uma etiqueta da captação, junto com um agente da captação, na superfície do Microarray. As proteínas são produzidas então nos Microarrays usando um sistema in vitro da transcrição e da tradução (IVTT), e as proteínas recentemente expressas são imobilizadas na superfície do microarray pelo agente da captação. Os arrays Nappa expressos podem ser usados para o estudo das proteínas exibidas na matriz de forma imparcial e de altataxa de transferência8,9.
Anteriormente, mostrou-se que as proteínas exibidas em matrizes NAPPA são dobradas corretamente para interagir com parceiros conhecidos10; Além disso, sua atividade enzimática foi explorada pela primeira vez em 2018, quando foi demonstrado que as proteínas quinases exibidas no autofoslato de Microarray11. Até o momento, a metodologia Nappa tem sido utilizada para muitas aplicações distintas, incluindo a descoberta de biomarcadores12,13,14,15,16,17, interações proteína-proteína10,18, identificação do substrato19e triagem de fármacos11. Sua flexibilidade é uma das principais características da plataforma que permite a adaptação a cada aplicação.
Aqui, um protocolo para a seleção de inibidores da tirosina quinase em matrizes Self-assembled de NAPPA é apresentado. A plataforma é otimizada para a exibição de proteínas humanas ativas e para a análise da atividade da proteína quinase, com baixo nível de fundo e alta amplitude dinâmica. Entre as modificações implementadas para o uso de NAPPA para a triagem de inibidores da quinase incluem: I) alterações na química da impressão, II) de-fosforilação do Microarranjo proteico antes da triagem do inibidor da quinase, e III) otimização da detecção de proteínas fosforiladas na matriz. Este protocolo é o primeiro de seu tipo e fornece a informação original sobre o estudo da quinase em Microarrays de NAPPA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>364 well plates (for arraying)</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>x7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 &#181;L 96-well collection plate</td>
			<td>Abgene</td>
			<td>AB-0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin device</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>140500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>1.00066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone 99.9%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum seal for 96 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76004-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>80370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>37535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 35</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>BP345-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeepWell Block, case of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-intercalating dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plates</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA77002804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Permeable Seals, box of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass box</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human-based IVTT system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPure Mouse IgG whole molecule</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>31202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (Potassium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4(Potassium phosphate monobasic)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Protein Phosphatase</td>
			<td>new england biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifterslips, 24 x 60 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25X60I24789001LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal 30-slide rack with no handles</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4 (Sodium orthovanadate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOAc (Sodium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410.10 / 740414.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoprep Anion II</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740503.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>79617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution (0.01%)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Phosphatase (Lambda)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs, Inc</td>
			<td>44904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica packets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100489-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single well plate</td>
			<td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (3M, pH 5.5)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB media (Terrific Broth)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T0918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>IBI scientific</td>
			<td>IB70144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td>Maker/model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable chilling incubator</td>
			<td>Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker for bacterial growth</td>
			<td>ATR Multitron shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold with liquid waste trap</td>
			<td>MultiScreenVacuum Manifold 96 well</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well autopippetor/liquid handler</td>
			<td>Genmate or Biomek FX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser</td>
			<td>Wellmate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarrayer</td>
			<td>Genetix QArray2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic hybridization station</td>
			<td>Tecan HS4800 Pro Hybridization Station</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Tecan PowerScanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray data quantification</td>
			<td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays

A triagem de inibidores da quinase é crucial para uma melhor compreensão das propriedades de um fármaco e para a identificação de alvos potencialmente novos com implicações clínicas. Várias metodologias têm sido relatadas para realizar tal triagem. No entanto, cada um tem suas próprias limitações (por exemplo, a triagem de apenas análogos de ATP, restrição ao uso de domínios da quinase purificada, custos significativos associados ao teste de mais de algumas quinases de cada vez, e falta de flexibilidade no rastreamento de proteínas quinases com mutações novas). Aqui, um novo protocolo que supera algumas dessas limitações e pode ser usado para a triagem imparcial de inibidores da quinase é apresentado. A força deste método é a sua capacidade de comparar a atividade dos inibidores da quinase através de múltiplas proteínas, quer entre diferentes cinases ou variantes diferentes da mesma quinase. Os microarrays automontados da proteína gerados com a expressão de quinases da proteína por um sistema in vitro da transcrição e da tradução do humano-baseado (ivtt) são empregados. As proteínas exibidas no microarray são ativas, permitindo a mensuração dos efeitos dos inibidores da quinase. O procedimento a seguir descreve os passos de protocolo em detalhes, da geração de Microarray e triagem para a análise de dados.

Os microarrays de Nappa automontados fornecem uma plataforma contínua que possa ser usada para muitas aplicações distintas, incluindo a descoberta do biomarcador, as interações proteína-proteína, a identificação do substrato, e a seleção da droga10,11 ,12,13,14,15,16,17,18,19,20.
A metodologia geral adotada para o estudo da atividade da quinase e o rastreamento de inibidores da tirosina cinases em Microarrays NAPPA são representados esquematicamente na Figura 1. Primeiramente, os microarrays de NAPPA são gerados pela imobilização do cDNA e pelo agente da captação nos Microarrays revestidos. Os cDNAs são então utilizados como um modelo para a transcrição e tradução de proteínas, utilizando um sistema de IVTT humano-baseado, e as proteínas recém-sintetizadas são imobilizados pelo agente de captura9. A qualidade do microarray impresso pode ser monitorada medindo os níveis de ADN (confirmando a impressão consistente) ou a proteína indicada na disposição (confirmando a expressão e a captação da proteína; Figura 1). Para diminuir o sinal de fundo e aumentar o intervalo dinâmico do experimento, os microarrays são tratados com 1) fosfatase lambda para remover a fosforilação de resíduos de ser/thr/Tyr, depois com 2) DNase para simplificar a química no local e diminuir fundo (Figura 1).
O próximo passo é a reação de autofosforilação, na qual os microarrays são incubados com tampão quinase na ausência de ATP (matriz de controle negativo, referida como Microarrays dephosphorylated), e o tampão da quinase é suplementado com ATP (controle positivo, denominados matrizes autofosforiladas) ou ATP + DMSO (controlo do veículo). Deve-se enfatizar que, durante esta etapa, não é adicionada quinase; Conseqüentemente, a atividade intrínseca de cada quinase indicada no microarray é quantificada com a medida de seus níveis do fosforilação usando um anticorpo da anti-phospho-tyrosine da bandeja seguido por um anticorpo secundário Cy3-labbeled (Figura 1).
O controle de qualidade das matrizes da NAPPA-quinase exibindo um painel de proteínas humanas quinases impressas em quadruplicado é mostrado na Figura 2. Os níveis de DNA imobilizado foram medidos por coloração de DNA e mostrou um sinal uniforme em todo o Microarranjo, sugerindo que a quantidade de DNA impressa na matriz era uniformizada. Também é possível observar várias características sem qualquer coloração de DNA. Essas características correspondem a alguns controles em que o DNA foi omitido da mistura de impressão [ou seja, manchas vazias (nada foi impresso), manchas de água, ponto de IgG purificada (poli-lisina, chapéu cabeado e IgG purificada), apenas mistura de impressão (mistura de impressão completa: poli-lisina mais chapéu cabeado e anticorpo antisinalizador, sem qualquer DNA)]. Os níveis de proteína indicados nos Microarrays da NAPPA-quinase foram avaliados após a reação de IVTT usando o anticorpo antitag.
Para a triagem da quinase, a bandeira foi usada como a tag de escolha e o nível de proteína exibido no microarray foi medido usando um anticorpo antisinalizador. Como mostrado, a maioria dos pontos que contêm cDNA exibiu com sucesso níveis detectáveis de proteína. Alguns dos pontos do controle sem cDNA igualmente revelaram o sinal com o anticorpo da anti-bandeira: ponto de IgG (usado para detectar a atividade do anticorpo secundário) e pontos vazios do vetor (códigos do cDNA para o Tag somente) (Figura 2). Os Microarrays da NAPPA-quinase mostraram boa reprodutibilidade entre as lâminas, com a correlação dos níveis de exposição da proteína entre lotes de impressão distintos superiores a 0,88 (Figura 2). Dentro do mesmo lote a correlação foi ainda maior, perto de 0,92 (dados não mostrados).
Em seguida, a atividade de autofosforilação da quinase das proteínas exibidas na matriz foi mensurada com anticorpo antifosfotirosina (Figura 3). A proteína indicada na matriz mostrou altos níveis de fosforilação protéica após a expressão (Figura 3, esquerda), que pode ser causada pela atividade da quinase intrínseca da proteína indicada na matriz ou por cinases ativas presentes na mistura de ivtt. Este fosforilação foi removido completamente com tratamento da fosfatase do lambda e estes Microarrays foram usados para os ensaios da quinase. Após dephosphorylation, as reações do autophosphorylation executadas sem ATP não mostraram nenhuns níveis significativos de fosforilação, como esperado, quando os microarrays incubadas com tampão da quinase na presença de ATP mostraram o fosforilação da proteína tão rapidamente quanto 15 minutos ( Figura 3). Para a triagem medicamentosa, a atividade da quinase foi mensurada após 60 min de reação de autofosforilação para maximizar o número de quinases testadas.
A comparação entre os microarrays nos quais os níveis de fosforilação foram medidos logo após a expressão protéica (Figura 3, esquerda) e após 60 min de reação de autofosforilação (Figura 3, direita) mostraram: i) proteínas fosforiladas apenas após a expressão, sugerindo que eles podem ser exogenamente fosforilado por proteínas presentes na mistura de IVTT, mas não podem ser autofosforilados; II) proteína fosforilada somente após a reação de autofosforilação, sugerindo que essas proteínas não eram ativas após a expressão protéica e os cofatores necessários presentes no tampão da quinase estivessem ativos; ou III) proteínas fosforiladas em ambas as matrizes, sugerindo que estivessem ativas em ambos os ajustes (Figura 3).
Como exemplo dos resultados obtidos para a triagem de inibidores da tirosina quinase nas matrizes da NAPPA-quinase foram utilizados três inibidores de cinases com seletividade distinta em proteínas quinases: staurosporina, imatinib e Ibrutinib. Para todas as seleções, os microarrays dephosphorylated de NAPPA foram incubados com concentrações crescentes de TKI (que variam de 100 nanômetro a 10 uM) durante a reação do autophosphorylation. A primeira TKI testada foi a staurosporina, um inibidor global da proteína quinase, que demonstrou inibição potente da quinase no microarray em praticamente todas as cinases testadas11.
Em seguida, foi testado o imatinib, um inibidor de ABL e c-kit utilizado para o tratamento de leucemia mielóide crônica e tumores estromais gastrointestinais4,5,6,7. Nas matrizes de NAPPA-quinase o imatinib mostrou uma redução significativa na atividade de Abl1 e de BCR-Abl1 visto que outras quinases permaneceram na maior parte não afetadas (figura 4a). A quantificação dos dados para a atividade da quinase foi normalizada contra a matriz dephosphorylated e representada como uma porcentagem do microarray positivo do controle (veículo somente). Os dados para TNK2 (quinase não relevante), Abl1 e BCR-Abl1 são mostrados na Figura 4B. Como esperado, o imatinib demonstrou inibição seletiva para Abl1 e BCR-ABl1. Os dados para o c-kit foram inconclusivos devido à falta de atividade nos arrays de controle positivo.
Finalmente, o Ibrutinib, um inibidor covalente aprovado pela FDA da tirosina quinase de Bruton (BTK), foi testado. O Ibrutinib é actualmente utilizado no tratamento de vários tipos de cancro relacionados com o sangue com BTK hiperactivo, incluindo leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de células do manto e macroglobulinemia de Waldenström21,22. A Figura 4Cé representativa dos resultados típicos obtidos para a triagem do Ibrutinib. A atividade da quinase de ABL1 (quinase não relevante) e BTK (alvo canônico) e ERBB4 (potencial novo alvo) é mostrada na Figura 4D. Os dados sugerem que o ERBB4 pode ser inibido pelo Ibrutinib em uma forma específica da dose. Esta inibição foi confirmada in vitro e em ensaios baseados em células11, demonstrando o poder desta plataforma.
Tomados em conjunto, os dados sugerem que a plataforma de Microarray NAPPA-quinase poderia ser usada para a triagem imparcial de inibidores de TK. Além disso, a triagem é rápida e pode ser facilmente personalizada para incluir qualquer variação das proteínas quinases de interesse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg"> Figura 1: representação esquemática do controle de qualidade e triagem de inibidores da tirosina quinase em matrizes NAPPA. As matrizes de NAPPA são imprimidas com o cDNA que codifica para a proteína do interesse fundido com uma etiqueta e um anticorpo da captação. Durante a transcrição in vitro e a reação da tradução (IVTT) as proteínas sintetizadas são capturadas na superfície do microarray através da etiqueta pelo anticorpo da captação. O controle da qualidade (QC) das matrizes é executado pela medida dos níveis de ADN imprimidos na corrediça, usando um corante DNA-intercalating fluorescente, e os níveis de proteína indicados no array usando anticorpos tag-specific. Para a triagem da quinase, os microarrays são tratados com DNase e fosfatase, após a reação do IVTT, para remover o DNA impresso e toda a fosforilação que pode ter ocorrido durante a síntese proteica. As matrizes dephosphorylated estão agora prontas para ser usado para a tela da droga. Para cada ensaio, três conjuntos de controles são usados rotineiramente: (I) matrizes dephosphorylated, em que a reação do autophosphorylation é executada sem ATP; (II) Microarrays autofosforilados, nos quais a reação de autofosforilação é realizada na presença de ATP; e (III) matriz tratada com DMSO (veículo), na qual a reação de autofosforilação é realizada com ATP e DMSO. As lâminas tratadas com diferentes concentrações de inibidores da quinase seguem exatamente o mesmo protocolo utilizado para as matrizes tratadas com DMSO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg"> Figura 2: resultados representativos do controle de qualidade para matrizes de NAPPA-quinase automontadas. O índice do ADN medido por um corante DNA-intercalating fluorescente (esquerdo) e os níveis de proteína indicados no microarray medido pelo anticorpo da anti-bandeira (meio) são mostrados. No lado direito é um gráfico de correlação dos níveis de proteína exibido em dois arrays NAPPA-quinase impressos em lotes separados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg"> Figura 3: resultados representativos da atividade da quinase em matrizes da NAPPA-quinase. Microarrays exibindo proteínas quinases em quadruplicado foram usados para estudar a atividade da proteína kinase na matriz através da medição de fosforilação protéica usando anticorpo anti-pTyr, seguido pelo anticorpo anticamundongo Cy3-rotulado. As matrizes de controle sem o tratamento da fosfatase/DNase e sem ATP durante a reação do autophosphorylation foram usadas para medir o fosforilação do fundo após a expressão da proteína (borne-expressão). Os microarrays restantes foram tratados com a fosfatase/ADN, e a reação do autophosphorylation foi executada sem ATP (microarray dephosphorylated, controle negativo) ou com ATP (microarrays autophosphorylated). Para os microarrays autofosforilados, a reação de autofosforilação foi realizada por 15 min, 30 min, 45 min ou 60 min, como mostrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg"> Figura 4: dados representativos da tela da tirosina quinase em matrizes NAPPA-quinase. (A) as matrizes de Nappa-quinase tratadas com fosfatase/DNase foram incubadas em concentrações crescentes de imatinib durante a reação de autofosforilação e a atividade da quinase foi medida com anticorpo antifosfotyr. (B) quantificação da atividade quinase observada nas matrizes da Nappa-quinase expostas ao imatinib. Os dados foram normalizados contra o sinal das matrizes de controle negativo (dephosphorylated) e é mostrado como uma porcentagem das matrizes positivas do controle (reação do autophosporylation executada na presença de DMSO). Dados semelhantes são mostrados para a triagem de Ibrutinib (C, D). Este número foi modificado de Rauf et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo complementar 1. Protocolo alternativo para a seleção de inibidores da tirosina quinase em matrizes de NAPPA usando uma estação automatizada da hibridação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Um protocolo detalhado para a geração de Microarrays humanos Self-assembled da proteína para a seleção de inibidores da quinase é apresentado.

Triagem de inibidores da quinase em Microarrays de proteínas humanas Automontados

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

O NAPPA é uma poderosa plataforma de microarray proteica que pode ser usada para o estudo da atividade e função proteica de forma imparcial de alto rendimento. As proteínas exibidas no NAPPA são produzidas em um sistema de expressão de base humana usando ribossomos e acompanhantes derivados humanos, a fim de melhorar a probabilidade de dobras naturais e atividade. O uso de matrizes NAPPA para a triagem de inibidores de quinase fornecem uma nova plataforma para o teste de novas drogas e mutações de quinase clinicamente relevantes.Microarrays proteicas geradas pela metodologia NAPPA podem ser usadas para muitas aplicações distintas, incluindo descoberta de biomarcadores, interações proteína-proteína, identificação de substratos e rastreamento de medicamentos. Execute etapas de controle de qualidade ao longo do caminho. Teste a qualidade da preparação do dna, a microarray de DNA e a microarray proteica.Se em qualquer passo a qualidade não é boa, é só começar de novo. Demonstrando o procedimento estará Lisa Miller, uma técnica do meu laboratório. Para preparar o crescimento bacteriano para a mini-preparação de alto rendimento da casa, primeiro inocular as bactérias na placa auger em um formato de 96 poços, e deixá-la crescer por 16 horas.No dia seguinte, encha cada poço da placa de poço profundo com 1,5 mililitros de caldo fantástico médio, complementado com ampicillina anticorpo. O anticorpo depende do marcador de seleção no plasmídeo. Em seguida, esterilize um dispositivo de 96 pinos com 80% de etanol e chama.Use o dispositivo estéril de 96 pinos para colher colônias da placa de ágar incubada durante a noite e submergir nos poços da placa do poço profundo para inocular a cultura. Cubra o bloco com um selo permeável a gás e incubar em um agitador por 22 a 24 horas a 37 graus Celsius, e 300 a 800 rpm. Depois disso, culturas de pelotas e resuspensam as culturas de acordo com o manuscrito.Bactérias lyse adicionando 200 microliters de solução dois em cada poço, selar a placa com uma vedação de alumínio, e inverter cinco vezes. Incubar as células por exatamente cinco minutos. Para neutralizar a solução, adicione 200 microliters da solução três, sele a placa com uma vedação de alumínio e inverta cinco vezes.Em seguida, gire a placa a 3800 G, quatro graus Celsius, por 30 minutos para limpar o supernatante lysate. Para preparar placas de resina de troca de ânion, primeiro, misture o chorume de troca de ânion e despeje o chorume em um cocho de vidro. Empilhe placas de filtro em cima de uma placa de poço profundo para atuar como um vaso de coleta de lixo.Em seguida, usando pontas P1000 de placa larga, misture o chorume e transfira 450 microliters do chorume para cada poço das placas do filtro. Centrifugar e descartar o fluxo. Agora, transfira os supernantes lysate para a pilha de placa de resina e bloco de poço profundo.Gire as placas empilhadas por cinco minutos a 30 vezes G com velocidade de rampa mais lenta e descarte o fluxo através. Para lavar a coluna, adicione 400 microliters de solução N3 tampão de lavagem a cada poço. Transfira a placa de resina para aspirar o coletor para remover o tampão de lavagem.Repita a etapa de lavagem três vezes e, em seguida, remova qualquer tampão de arruela restante com um breve giro de cinco minutos a 30 vezes G.To elute o DNA, coloque a placa de resina em uma placa de coleta limpa de 800 microliter. Adicione 300 microliters de solução N5 a cada poço e deixe-o sentado à temperatura ambiente por dez minutos. Em seguida, gire as placas empilhadas por cinco minutos a 20 vezes G com velocidade de rampa lenta até 233 vezes G por um minuto.Armazene placas a 20 graus Celsius negativos antes de usar. Primeiro, coloque os slides em um rack e submerse os slides em reservatório de vidro contendo a solução de revestimento de reagente de 2% de aminosilano em acetona. Balance os slides por 15 minutos.Em seguida, enxágue os slides em acetona seguido de uma lavagem final na água. Em seguida, seque as lâminas usando ar pressionado. Soprando sobre eles de todos os ângulos por cerca de três minutos até que todas as gotículas de água tenham sido removidas.Armazene os slides revestidos à temperatura ambiente em um rack de metal dentro de uma caixa bem selada. Agora, prossiga para precipitar o DNA como descrito no manuscrito. Em seguida, resuspenque a pelota de DNA em 20 microliters de água ultrapura e agite a 1000 rpm por duas horas.Para preparar a amostra de matriz, adicione 10 microliters de mistura de impressão recém-preparada que contém o anticorpo, crosslinker e polilise a cada amostra de DNA. Placas de vedação com papel alumínio e trema à temperatura ambiente por 90 minutos a 1000 rpm. Armazene as placas durante a noite a quatro graus Celsius.No dia da impressão, brevemente vórtice e gire as placas. Transfira 28 microliters de cada amostra para uma placa de 384 poços. Coloque os slides revestidos de aminosilano e a placa 384, no deck do arrayer, e inicie o programa de impressão de microarray.Quando a impressão estiver pronta, rotule as microarrays. As microarrays podem ser armazenadas por meses até uso posterior. Para medir os níveis de DNA, coloque os slides em uma caixa de pipeta e bloqueie-os com 50 mililitros de tampão de bloqueio.Incubar os slides em um agitador de balanço à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, descarte a solução e adicione 20 mililitros de tampão de bloqueio e 33 microliters de corante fluorescente de DNA. Incubar por 15 minutos com agitação.Após o fim da incubação, enxágue rapidamente os slides com água ultra pura e seco com ar pressionado. As microarrays estão prontas para serem escaneadas. Para expressar as microarrays, bloqueie os slides como mostrado anteriormente e enxágue-os com água ultra pura e seque com ar comprimido filtrado.Conecte uma junta de vedação a cada slide. Adicione 130 mililitros de transcrição in vitro e misture a tradução nos slides, e massageie suavemente as juntas de vedação para que a transcrição in vitro e a mistura de tradução se espalhem e cubra toda a área da matriz sem bolhas. Aplique as pequenas vedações de porta redonda em ambas as portas.Incubar por 90 minutos a 30 graus Celsius para expressão proteica, seguido de 30 minutos a 15 graus Celsius para imobilização da proteína de consulta. Em seguida, remova a junta, lave os slides três vezes por cinco minutos cada em 15 mililitros TBST com leite e bloqueie a mesma solução por uma hora. Para a detecção das proteínas na matriz, remova o TBST com leite, coloque os slides em uma placa de grade e aplique 600 microliters de anticorpo primário, anti-bandeira de rato, diluído de um a duzentos, e 1x TBST suplementado com 5% de leite.Incubar por uma hora em temperatura ambiente. Lave os slides com 50 mililitros de 1x TBST e 5% de leite no shaker de balanço três vezes por cinco minutos cada. Repita o procedimento para o anticorpo secundário.Após o fim da incubação de uma hora, lave os slides com 1x TBST no shaker de balanço três vezes por cinco minutos cada. Em seguida, enxágue rapidamente os slides com água ultra pura, e seque usando ar pressionado. Os slides estão prontos para serem escaneados.Para realizar o tratamento fosfatese e DNase, lave e bloqueie os slides expressos com TBST suplementado com 3%BSA como descrito no manuscrito. Em seguida, coloque os slides em uma placa de grade e aplique 200 microliters de solução fosfatese DNase. Coloque um deslizamento de tampa de microarray em cima para evitar a evaporação.Incubar a 30 graus Celsius durante uma hora e 30 minutos no forno. Em seguida, lave slides com 1x TBST e 0,2 cloreto de sódio molar no shaker de balanço três vezes por cinco minutos cada. Para realizar o tratamento medicamentoso e a reação de quinase, coloque os slides na placa de grade e aplique 200 microliters de solução de quinase medicamentosa.Coloque um deslizamento de tampa em cima para evitar a evaporação. Incubar por uma hora a 30 graus Celsius no forno. A chave para dados reprodutíveis é o tempo de incubação consistente entre slides.Isso é especialmente importante durante a reação da quinase. O tempo necessário para processar cada slide deve ser contabilizado. Depois disso, lave slides com 1x TBST e 0,2 cloreto de sódio molar no shaker de balanço três vezes por cinco minutos cada.Detecção de proteína repetida usando como anticorpo de anticorpos fosfotyrosina primário diluído de um a 100 em TBST, suplementado com albumina de soro bovino de 3%. Use 1x TBST e 3% de albumina de soro bovino para lavagem após a incubação com anticorpo primário, e TBST para lavagens após incubações com anticorpo secundário. Lave e seque como antes.Para aquisição de imagens, carregue as microarrays na revista porta-slides. Coloque a revista no scanner de microarray. Escaneie todas as microarrays com as configurações otimizadas e lembre-se de desativar o ganho automático ao comparar imagens entre experimentos.Transfira as imagens para um software de quantificação, alinhe a grade com as manchas e quantifique a intensidade do sinal de cada recurso na microarray. Prossiga com a análise estatística. Neste estudo, a microarray mostrou que a maioria das manchas contendo DNA complementar apresentou com sucesso níveis detectáveis de proteína.As microarrays nappa quinase apresentaram boa reprodutibilidade entre slides, com a correlação dos níveis de exibição de proteína entre lotes de impressão distintos superiores a 0,88. Os resultados representativos da atividade de quinase nos arrays de quinase NAPPA mostraram altos níveis de fosforilação proteica após a expressão. A comparação entre microarrays em que os níveis de fosforilação foram medidos logo após o tratamento fosfatase, e após 60 minutos de reação de autofosforilação, sugere a presença de quinases de proteína ativa na matriz.Nas matrizes de quinase NAPPA, o imatinib apresentou uma redução significativa na atividade ABL1 e BCR-ABL1, enquanto outras quinases permaneceram em sua maioria não afetadas. A atividade de quinase normalizou-se em relação à matriz desfosforilada e representou como porcentagem da microarray de controle positivo mostrou inibição seletiva de imatinib em relação ao ABL1 e BCR-ABL1. Os resultados típicos obtidos para a triagem de ibrutinib mostraram que a atividade de quinase da quinase não relevante ABL1 não foi afetada.O alvo canônico BTK, e o potencial novo alvo erbb4, mostraram atividade reduzida na presença de ibrutinib. Os dados sugerem que o ERBB4 pode ser inibido por ibrutinib de forma específica de dose. O sucesso dos exames de microarraia proteica são altamente dependentes da qualidade da microarray em si.Vários recursos de controle positivos e negativos devem ser usados para permitir a análise adequada dos dados. O ensaio nappa quinase é uma plataforma de triagem e, como tal, os dados obtidos devem ser validados em ensaios de acompanhamento, que podem incluir ensaios de quinase in vitro ou ensaios baseados em células. Uma vez que nosso protocolo começa com cDNA, qualquer mutação ou variação de quinase pode ser facilmente incorporada na microarray e estudada em alta produtividade.Durante a preparação da troca de ânions de chorume e placas de resina, recomenda-se o uso de máscaras para evitar possível inalação das partículas de resina.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Bioquímica

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano para interrogar o Caminho Associado lRRK2 Kinase de Parkinson avaliando rab10 fosforilação

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudando o RNA interactianos de proteína quinase RNA-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Triagem para inibidores da pirofosia ligada à membrana de maritoga

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Derivatização de Cristais de Proteína com I3C usando Triagem de Matriz Microseada Aleatória

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...