Name: kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить всех в лаборатории LaBaer за их помощь и критику во время разработки проекта. Этот проект был поддержан грантом NIH U01CA117374, U01AI077883 и Фондом Вирджинии Г. Пайпер.

<ol>
	<li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+kinases.">Targeting protein kinases.</a> Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).</li><li>Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+inhibitors+in+the+treatment+of+inflammatory+and+autoimmune+diseases.">Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases.</a> Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).</li><li>Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA-approved+small-molecule+kinase+inhibitors.">FDA-approved small-molecule kinase inhibitors.</a> Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).</li><li>Heinrich, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+c-kit+receptor+tyrosine+kinase+activity+by+STI+571,+a+selective+tyrosine+kinase+inhibitor.">Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor.</a> Blood. 96 (3), 925-932 (2000).</li><li>Stagno, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+mesylate+in+chronic+myeloid+leukemia:+frontline+treatment+and+long-term+outcomes.">Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes.</a> Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).</li><li>Ben Ami, E., Demetri, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safety+evaluation+of+imatinib+mesylate+in+the+treatment+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor.</a> Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).</li><li>Ramachandran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+microarrays.">Self-assembling protein microarrays.</a> Science. 305 (5680), 86-90 (2004).</li><li>Festa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+microarray+production+of+freshly+expressed+proteins+in+a+human+milieu.">Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu.</a> Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).</li><li>Rauf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inhibition+of+ERBB4+reduces+cell+growth+in+a+WNT5A-dependent+manner.">Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner.</a> Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).</li><li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarray+signature+of+autoantibody+biomarkers+for+the+early+detection+of+breast+cancer.">Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer.</a> Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Autoantibodies+Associated+with+Basal-like+Breast+Cancers.">Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).</li><li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+Antibody+Immunome+in+Type+1+Diabetes+Using+Protein+Arrays.">Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays.</a> Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Antibody+Targets+for+Tuberculosis+Serology+using+High-Density+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays.">Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Autoantibody+Responses+between+Lung+Adenocarcinoma+and+Benign+Pulmonary+Nodules.">Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules.</a> Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).</li><li>Montor, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+Pseudomonas+aeruginosa+outer+membrane+protein+immunogenicity+using+self-assembling+protein+microarrays.">Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays.</a> Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).</li><li>Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+Protein-Protein+Interactions+Using+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays.">Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+(click+chemistry)-based+detection+of+global+pathogen-host+AMPylation+on+self-assembled+human+protein+microarrays.">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).</li><li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+signature+for+the+serologic+detection+of+ovarian+cancer.">Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).</li><li>Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B-cell+receptor+signaling+pathway+as+a+therapeutic+target+in+CLL.">The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL.</a> Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).</li><li>Smith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+in+B+lymphoid+malignancies.">Ibrutinib in B lymphoid malignancies.</a> Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).</li><li>Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cloning+and+expression+library+creation+for+functional+proteomics.">High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics.</a> Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).</li><li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).</li></ol>

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Модификации и устранение неполадок На этапе оптимизации исследования активности киназы на массивах NAPPA одним из основных источников фона и низкого динамического диапазона была BSA, используемая в печатной смеси. BSA обеспечивала первичные амины, необходимые для перекрестного соединения с поверхностью аминозилана, и захватывал ДНК и улавливание антитела на месте. Тем не менее, BSA является высоко фосфорилированным, что затрудняет обнаружение сигнала автофосфорилирования на массиве над фоновым шумом. Для решения этой проблемы было протестировано несколько альтернатив ДЛЯ BSA в печатной смеси, и поли-лизин был определен в качестве хорошей замены. Поли-лизин не имеет какого-либо фосфорилирования сайта; таким образом, фон из невыраженных массивов очень минимален. Кроме того, микроаррей, напечатанные поли-лизином, воспроизводимы и отображают хорошие уровни белков(рисунок 2).
Следующей критической модификацией, выполненной на стандартном ассее NAPPA, было добавление шага лечения фосфатазой/DNase. Обработка микроаррей с фосфатазой позволяет удалить любой фосфорилирование, которое произошло в смеси IVTT во время синтеза и захвата белка(рисунок 3). Источником этого фосфорилирования может быть внутренняя аутофосфорилационная активность или активность киназы, присутствующие в смеси IVTT. Удаление всех фосфорилирования пост-выражения позволило легко идентификации киназы, которые являются активными и могут пройти аутофосфорилирование(рисунок 3).
Критические шаги в протоколе NAPPA является надежной технологией, но, как и ожидалось, есть несколько критических шагов. Во-первых, приобретение высококачественной ДНК в соответствующей концентрации. Использование ДНК низкого качества или в низких концентрациях будет генерировать низкое качество microarrays с несколькими функциями не выражается и отображается в соответствующих уровнях, уменьшая количество белков, проанализированных на массиве. Вторым важным шагом является выражение белков на микроарле. Использование системы IVTT, которая будет выражать высокий уровень функционального белка имеет жизненно важное значение для изучения активности киназы на массиве.
Следующим важным шагом на скрининге TKI является обработка микрорейрей. Микроаррей не должен высыхать во время любого этапа протокола, а для предотвращения царапин, которые могут увеличить фоновый сигнал, рекомендуется нежная обработка. Поскольку массивы всего эксперимента будут сравниваться друг с другом, важно гарантировать, что каждый инкубационный шаг равномерно проходит на всех слайдах. Например, время, необходимое для выполнения одного шага в одном массиве, следует учитывать при обработке партии из 20 массивов для предотвращения различий в длине инкубации в массивах.
Наконец, разработка эксперимента и включение как позитивного, так и отрицательного контроля имеют решающее значение для контроля качества и анализа данных. Первый набор элементов управления печатается в каждом массиве и включает в себя отрицательные элементы управления (т.е. пустые пятна (без какого-либо материала напечатаны), воду или пустой вектор (выразить только тег) , а также положительный контроль (т.е. очищенный IgG, который обнаруживается вторичные антитела и инертны к изменению уровня фосфорилирования). В совокупности они измеряют фоновые уровни микроаррей, возможную перенос во время печати и интенсивность сигнала метода обнаружения.
Следующий набор мер контроля является контроль за скринингом наркотиков и включает в себя дефосфорилированные и аутофосфорилированные микроаррей (при наличии или отсутствии ДМСО). Как упоминалось ранее, дефосфорилированный микроаррей измеряет уровень фосфорилирования после лечения фосфатазой и, следовательно, базовый уровень для всех других экспериментов. Чем ниже базовый уровень, тем выше динамический диапазон анализов. Аутофосфорилированные массивы представляют максимальные уровни фосфорилирования всех массивов, и сигнал должен быть сильным и ясным. Он используется для анализа данных, но и в качестве контроля, что все реакции были успешно выполнены на массиве.
Ограничения техники На данный момент, одним из ограничений наркотиков скрининга представлены здесь является его способность экранировать только протеиновые киназы, которые могут быть аутофосфорилированы. Один из возможных способов преодолеть это является печать киназы и известный субстрат в том же месте. Совместное печать ДНК для двух различных белков была успешно выполнена15,что свидетельствует о целесообразности такого подхода. Кроме того, белок, отображаемый на массиве, может быть неправильно сложен, что приводит к неактивному белку. Использование системы экспрессии на основе человека значительно улучшило активность киназы, измеряемую на массиве; однако, некоторые белки все еще не могут быть проанализированы на массиве из-за его бездействия.
Вторым ограничением является измерение фосфорилирования с помощью антифосфо-тир-антитела. Несмотря на свою неспеционность в отношении мотива фосфорилирования сайта, все измеренные фосфорилирования произошли на остатках тирозина, оставляя после себя серины и трионины и их соответствующие киназы. На сегодняшний день более 10 антител pan phospho-Ser/Thr были протестированы безуспешно, несмотря на несколько попыток оптимизировать условия инкубации и стирки. Новая система обнаружения, которая не зависит от антител может быть лучшим вариантом для расширения числа белковых киназ, которые могут быть проверены на ингибирование препарата. В этом контексте доступно несколько вариантов, включая радиоактивность или химические подходы, такие как спряжение кликов. Для минимизации фонового сигнала и обеспечения хорошего динамического диапазона для анализов требуется серия оптимизаций.
Третьим ограничением является приобретение клонов кДНК, которые будут напечатаны на массиве. Клоны кДНК могут быть сгенерированы с помощью любой техники клонирования, включая системы рекомбинации, такие как Creator или Gateway23. Другим вариантом является покупка клонов из библиотеки DNAsu, найденных в lt;https://dnasu.org/DNASU/Home.do'gt;, где более 17 000 клонов cDNAs, включая весь человеческий киноман, легко доступны для использования для строительства массивов NAPPA24 .
Четвертое ограничение заключается в том, что не каждая лаборатория оснащена соответствующим оборудованием для изготовления и проверки собственных массивов NAPPA. Этот протокол предоставляет альтернативные методы для создания ДНК для печати на microarray, без необходимости высокой пропускной техники, и протоколы для ручной выполнения всех шагов гибридизации. Тем не менее, доступ к массивнику и сканеру microarray по-прежнему необходим. Одним из вариантов решения этой проблемы является использование основной службы и объекта NAPPA, найденного по адресу: http://nappaproteinarray.org/'gt; который распространяет индивидуальные микроары NAPPA по некоммерческой академической цене. Наконец, как и любая методология скрининга, данные, полученные на массивах, могут быть артефактами (как положительными, так и отрицательными) и поэтому должны быть проверены с помощью ортогонных анализов.
Значение по отношению к существующим методам Несколько платформ доступны на коммерческой коммерческой точки зрения для скрининга белковых киназ. Один из подходов, обычно используемых является обязательным анализы, которые могут быть выполнены с фрагментами белка, киназа домена, большие фрагменты белка с киназой домена и некоторых нормативных регионов, и даже полнометражные белки. Белки обычно выражаются в бактериальных системах из-за стоимости и простоты в протоколах выражения и очистки. Взаимодействие между препаратом интереса и белка затем измеряется с некоторым типом отчета анализ, как флуоресценция или наличие тегов, например. Основным ограничением этого набора подходов является тот факт, что белок не обязательно активен во время взаимодействия с препаратом, что может привести к выявлению ложноположительных и ложных негативных взаимодействий. Фрагменты белков особенно уязвимы к изменениям в конформации и отсутствии активности, и все полученные данные должны быть проверены с использованием активных белков, предпочтительно в их полнометражной форме. Еще одним ограничением некоторых платформ является возможность экранировать только аналоги ATP, ограничивая его общее использование.
Большинство коммерчески доступных услуг для скрининга ТКИ с использованием ферментативных подходов используют только дикие версии киназы, представляющие интерес, а иногда и лишь отдельные несколько мутантов. Зная, что лекарственная устойчивость очень распространена у пациентов, получавших ТКИ, важно уметь измерять реакцию препарата у различных мутантов, для выбора наиболее подходящего ингибитора. В связи с характером NAPPA, скрининг мутантов киназы прост и может быть легко выполнен, и единственным необходимым инструментом является включение мутанта киназы в коллекцию NAPPA cDNA, что может быть сделано с помощью сайта конкретных мутагенеза, например.
Будущие приложения Одной из наиболее распространенных форм лечения в терапии рака с использованием ингибиторов киназы является приобретение мутаций в лекарственной мишени во время курса лечения. Скрининг этих мутантов относительно их реакции на ингибиторы киназы имеет жизненно важное значение для выбора второго/третьего поколения ТКИ для достижения персонализированного лечения для каждого пациента. Подход к скринингу наркотиков, представленный здесь, обеспечивает объективную платформу скрининга, в которой любой ингибитор тирозинкиназы может быть протестирован на панели тирозиновых киназ, присутствующих в геноме человека. Поскольку белки, отображаемые на массивах NAPPA, выражены в пробирке из кДНК, напечатанной на слайде, любой вариант мутантов может быть легко включен в коллекцию cDNA, которая будет отображаться на массиве. Объект, в котором мутанты киназы могут быть созданы и выражены на массиве, в сочетании с высокой пропускной способностью техники NAPPA, обеспечивает уникальную среду для изучения мутаций киназы и их реакции на наркотики, что делает NAPPA пригодным для персонализированный скрининг на наркотики, одна из целей точной медицины.

Белковые киназы отвечают за фосфорилирование своих целей и могут модулировать сложные молекулярные пути, контролирующие многие клеточные функции (т.е. пролиферацию клеток, дифференциацию, гибель клеток и выживание). Дерегуляция активности киназы связана с более чем 400 заболеваниями, что делает ингибиторы киназы одним из основных классов препаратов, доступных для лечения ряда заболеваний, включая рак, сердечно-сосудистые и неврологические расстройства, а также воспалительные и аутоиммунные заболевания1,2,3.
С появлением высокоточной медицины, выявление новых методов лечения, особенно ингибиторы киназы, имеют большую привлекательность фармацевтически и клинически. Несколько подходов могут быть использованы для выявления возможных новых пар ингибиторов киназы/киназы, включая de novo дизайн ингибиторов киназы и определение новых целей для существующих препаратов, одобренных FDA. Последнее особенно привлекательно, так как время и деньги, необходимые для внедрения этих препаратов в клиниках, резко сокращаются из-за наличия предыдущих данных клинических испытаний. Каноническим примером повторного использования ингибитора киназы является иматиниб, первоначально предназначенный для лечения хронического миелоимного лейкоза (ХМЛ) через ингибирование BCR-Abl, который также может быть успешно использован для лечения c-Kit чрезмерного выражения стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (ГИСТ)4,5,6,7.
Скрининг ингибиторов киназы может быть выполнен в связывающих анализов или ферментативных анализов. Первый класс анализов фокусируется на белково-лекарственное взаимодействие и может предоставить информацию, такую как место перевязки и сродство. Поскольку активность киназы во время этих анализов неизвестна, ряд взаимодействий может быть пропущен или ложно идентифицирован из-за конформанционных изменений в белке. С другой стороны, ферментативные анализы требуют, чтобы протеиновые киназы были активными и предоставляют ценную информацию о влиянии ингибитора на активность ферментов, однако этот тип скрининга, как правило, занимает больше времени и дороже. В настоящее время оба типа анализов доступны на коммерческой стадии из нескольких источников. Они представляют собой надежный вариант для скрининга ингибиторов киназы с некоторыми ограничениями, в том числе: I) большинство методов включают тестирование нескольких киназов индивидуально, что может сделать скрининг большого набора белков дорогостоящим; II) набор киназ, которые должны быть протестированы ограничивается список предварительно отобранных, дикого типа киназы и несколько известных мутировавших версий некоторых киназов, препятствуя тестированию многих новых мутировавших изоформ.
В этом контексте белковые микроаррей являются мощной платформой, способной преодолеть некоторые ограничения, представленные коммерчески доступными методами. Подходит для проведения ферментативных анализов при высокопроемном скрининге с использованием полнометражных активных белков любой последовательности интереса. Микроаррей может быть создан с помощью самособранного подхода, такого как NAPPA (программируемый набор нуклеиновых кислот), в котором белки выражаются как раз вовремя для анализов, увеличивая вероятность того, что те, которые отображаются на массиве, действительно активны. Белки, отображаемые на NAPPA, производятся с использованием биосом и белков сопровождающего человека для повышения вероятности естественного складывания и активности.
Белки первоначально запрограммированы путем печати cDNAs кодирования для генов, представляющих интерес сливается с захватом тега, вместе с агентом захвата, на поверхность microarray. Белки затем производятся на microarrays с помощью системы экстракорпорации и перевода (IVTT), а свежевыраженные белки обездвиживаются на поверхности микроаррей агентом захвата. Выраженные массивы NAPPA могут быть использованы для изучения белков, отображаемых на массиве в беспристрастным, высокой пропускнойспособом8,9.
Ранее было показано, что белки, отображаемые на массивах NAPPA, складываются должным образом, чтобы взаимодействовать с известными партнерами10; кроме того, их ферментативная активность была впервые использована в 2018 году, когда было показано, что протеиновые киназы, отображаемые на микроаре ауфосфорилат11. На сегодняшний день методология NAPPA используется для многих различных применений, включая открытие биомаркеров12,13,14,15,16,17, белково-белковые взаимодействия10,18,идентификация субстрата19,и скрининг препарата11. Его гибкость является одной из ключевых характеристик платформы, которая позволяет адаптироваться к каждому приложению.
Здесь представлен протокол скрининга ингибиторов тирозинкиназы в самособранных массивах NAPPA. Платформа оптимизирована для отображения активных человеческих белковых киназ и для анализа белковой киназы, с низким фоном и высоким динамическим диапазоном. Среди модификаций, реализованных для использования NAPPA для скрининга ингибиторов киназы, включают: I) изменения в химии печати, II) дефосфорилирование микроаря белка до скрининга ингибитора киназы, и III) оптимизация обнаружения фосфорилированных белков на массиве. Этот протокол является первым в своем роде и предоставляет уникальную информацию об исследовании киназы в микроарах NAPPA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>364 well plates (for arraying)</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>x7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 &#181;L 96-well collection plate</td>
			<td>Abgene</td>
			<td>AB-0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin device</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>140500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>1.00066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone 99.9%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum seal for 96 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76004-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>80370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>37535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 35</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>BP345-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeepWell Block, case of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-intercalating dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plates</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA77002804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Permeable Seals, box of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass box</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human-based IVTT system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPure Mouse IgG whole molecule</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>31202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (Potassium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4(Potassium phosphate monobasic)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Protein Phosphatase</td>
			<td>new england biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifterslips, 24 x 60 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25X60I24789001LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal 30-slide rack with no handles</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4 (Sodium orthovanadate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOAc (Sodium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410.10 / 740414.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoprep Anion II</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740503.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>79617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution (0.01%)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Phosphatase (Lambda)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs, Inc</td>
			<td>44904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica packets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100489-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single well plate</td>
			<td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (3M, pH 5.5)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB media (Terrific Broth)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T0918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>IBI scientific</td>
			<td>IB70144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td>Maker/model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable chilling incubator</td>
			<td>Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker for bacterial growth</td>
			<td>ATR Multitron shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold with liquid waste trap</td>
			<td>MultiScreenVacuum Manifold 96 well</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well autopippetor/liquid handler</td>
			<td>Genmate or Biomek FX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser</td>
			<td>Wellmate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarrayer</td>
			<td>Genetix QArray2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic hybridization station</td>
			<td>Tecan HS4800 Pro Hybridization Station</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Tecan PowerScanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray data quantification</td>
			<td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays

Скрининг ингибиторов киназы имеет решающее значение для лучшего понимания свойств препарата и для выявления потенциально новых целей с клиническими последствиями. Сообщалось о нескольких методологиях, которые могли бы провести такой скрининг. Тем не менее, каждый из них имеет свои собственные ограничения (например, скрининг только аналогов АТФ, ограничение на использование очищенных доменов киназы, значительные затраты, связанные с тестированием более чем несколько киназ в то время, и отсутствие гибкости в скрининге белка киназы с новые мутации). Здесь представлен новый протокол, который преодолевает некоторые из этих ограничений и может быть использован для беспристрастного скрининга ингибиторов киназы. Сила этого метода заключается в его способности сравнивать активность ингибиторов киназы между несколькими белками, либо между различными киназами, либо различными вариантами одной и той же киназы. Используются самособранные белковые микроаррей, генерируемые в результате выражения белковых киназ человеческой системой экстракорпорации и перевода (IVTT). Белки, отображаемые на микроарере, активны, что позволяет измерять эффекты ингибиторов киназы. Следующая процедура подробно описывает этапы протокола, начиная с генерации микроаррей и скрининга и консиворивая данных.

Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Представлен подробный протокол для генерации самособранных человеческих белковых микроаррей для скрининга ингибиторов киназы.

Скрининг ингибиктора Киназы в самособранных микроарах человеческого белка

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Анализ активности протеинкиназы с радиоактивно меченым АТФ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Анализ специфичности гистонового антитела с пептидными микрочипами

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Человеческая периферическая кровь Нейтрофилов Изоляция для допроса Паркинсона Связанные LRRK2 Киназы Путь путем оценки Rab10 фосфорилирования

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Изучая РНК посредники РНК активирована во время цикла Mammalian клетки киназы протеина

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Характеристика на молекулярном уровне с использованием надежных биохимических подходов нового белка киназы

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Скрининг для Термотога маритима Мембрана-Связанные пирофосфаза ингибиторы

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Вывод белковых кристаллов с I3C с помощью случайного скрининга матрицы микросея

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...